CC BY
23
УДК 636.084.416:579.62:636.4
НОВЫЕ ПОДХОДЫ К РАЗРАБОТКЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ НА ОСНОВЕ МЕТАБОЛИТОВ BIFIDOBACTERIUM BIFIDUM
ПОПОВ ВС.,
доктор ветеринарных наук, главный научный сотрудник, ФГБНУ «Курский федеральный аграрный научный центр»; e-mail: viktor.stugen@yandex.ru, тел.: 8 (920)7140260.
СВАЗЛЯН Г.А.,
кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, ФГБНУ «Курский федеральный аграрный научный центр».
НАУМОВ Н.М.,
кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, ФГБНУ «Курский федеральный аграрный научный центр».
ВОРОБЬЕВА Н.В.,
кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник, ФГБНУ «Курский федеральный аграрный научный центр».
КОРОЛЕВА А.Ю.,
лаборант-исследователь, ФГБНУ «Курский федеральный аграрный научный центр».
Реферат. В интенсивном промышленном свиноводстве значительную роль в этиологии и развитии гастроэнтеритов, наряду со специфическими инфекциями, решающее значение имеет состояние микробиоциноза кишечника. Вместе с тем, соотношение нормальной и условно-патогенной микрофлоры достаточно важный фактор для стимуляции неспецифического иммунитета. Актуальной представляется разработка биопрепаратов на основе штаммов пробиотических микроорганизмов, синтезирующих биологически активные вещества (метабиотики) в желудочно-кишечном тракте животных, способствующих развитию нормальной микрофлоры. Цель исследований заключается в получении метаболитов Bifidobacterium bifidum, при культивировании на питательной среде из мелассы и научно практическое обоснование биологически активной добавки для коррекции микробиоценоза желудочно-кишечного тракта у животных. В исследованиях установлено значительное превышение аминокислот и органических кислот в опытных образцах культуральной жидкости. Метабиотики из группы витаминов представлены в основном группой «В». В результате проведенных клинических исследований у поросят-сосунов в 30-суточном возрасте установлено содержание В.bifidum и Lactobacillus в пределах 107-109 КОЕ/г. В 60-суточном возрасте установлено снижение КОЕ/г лактобактерий до 103, увеличение стафилококков и клостридий до 106 и 107, незначительного увеличения другой условно-патогенной микрофлоры. Вместе с тем содержание бифидобактерий достигает значения 10 9 КОЕ/г. Динамика Т- и В-лимфоцитов отражает взаимосвязь показателей микробиоценоза и клеточного иммунитета иммунитета, соответственно возрастных периодов поросят при применении метабиотиков и пробиоти-ческой культуры.
Ключевые слова: пробиотик, метаболиты, микробиоценоз, питательная среда, культуральная жидкость, меласса, поросята, кишечная микрофлора, клеточный иммунитет.
NEW APPROACHES TO THE DEVELOPMENT OF A DIETARY SUPPLEMENT BASED ON BIFIDOBACTERIUM BIFIDUM METABOLITES
POPOV V.S.,
doctor of veterinary Sciences, chief researcher,Federal Agricultural Kursk Research Center; e-mail: viktor.stugen@yandex.ru, тел.: 8 (920)7140260
SVAZLIAN G.A.,
candidate of biological Sciences, senior researcher, Federal Agricultural Kursk Research Center. NAUMOV N.M.,
candidate of biological Sciences, senior researcher, Federal Agricultural Kursk Research Center. VOROBIEVA N.V.,
candidate of veterinary Sciences, senior researcher, Federal Agricultural Kursk Research Center. KOROLEVA A. Yu.,
research laboratory assistant, Federal Agricultural Kursk Research Center.
Essay. In intensive industrial pig farming, the state of intestinal microbiocinosis plays a significant role in the etiology and development of gastroenteritis, along with specific infections. At the same time, the ratio of normal and opportunistic microflora is quite an important factor for stimulating non-specific immunity. The development of biologics based on probiotic micro-organisms that synthesize biologically active substances (metabiotics) in the gastrointestinal tract of animals that contribute to the development of normal microflora is relevant. The purpose of research is to obtain metabolites of Bifidobacterium bifidum, when cultured on a nutrient medium from molasses and scientific and practical justification of a biologically active additive for the correction of gastrointestinal microbiocenosis in animals. Studies have found a significant excess of amino acids and organic acids in experimental samples of culture fluid. Metabiotics from the vitamin group are mainly represented by the "B" group. As a result of clinical studies in suckling pigs at 30-day age, the content of B. bifidum and Lactobacillus was found to be within 107-109 CFU/g. At 60-day age, a decrease in CFU/g of lactobacilli to 103, an increase in staphylococci and Clostridium to 106 and 107, and a slight increase in other opportunistic microflora were found. However, the content of bifidobacteria reaches a value of 109 CFU/g. The dynamics of T-and B-lymphocytes reflects the relationship between the indicators of microbiocenosis and cellular immunity, respectively, the age periods of piglets when using metabiotics and probiotic culture.
Keywords: probiotic, metabolites, microbiocenosis, nutrient medium, culture fluid, molasses, piglets, intestinal microflora, cellular immunity.
Введение. Применение пробиотических кормовых добавок в кормлении поросят раннего отъема являются одним из факторов регуляции гомеостаза растущего молодняка свиней, от которых зависят практически все физиологические функции и биохимические реакции макроорганизма, влияющие на формирование неспецифического иммунитета и естественной резистентности [1. - С.35, 2. -С.203, 3. - С.250]. Наиболее перспективным и актуальным направлением в области разработки пробиотических биологически активных добавок является изучение биопрепаратов (пробиотиков), синтезирующих метабиотики -аминокислоты, витамины, и другие биологически активные вещества [4. - С.86, 5. - С.1]. Исследования, которые выполняются в России и за рубежом, рассматриваются как наиболее перспективный подход при формировании микробиоценоза кишечной микрофлоры [6. -С.86, 7. - С.69].
Известно, что нормальная микрофлора желудочно-кишечного тракта поросят составляет
конкуренцию для многих патогенов и механизмы подавления их роста достаточно разнообразны. Основным является избирательное связывание поверхностных рецепторов клеток, особенно эпителиальных. Большинство представителей резидентной микрофлоры проявляет выраженный антагонизм, направленный, в том числе и против патогенных видов. Подобные свойства особенно выражены у бифидобактерий и лактобацилл этот антибактериальный потенциал образует секреция кислот, спиртов, лизоцима, бактериоцинов и некоторых других компонентов. Кроме того, высокая концентрация указанных продуктов ин-гибирует выделение токсичных субстанций патогенными видами, например термолабильного токсина энтеропатогенными эшерихиями [8. - С.17, 9. - С.19]. Не менее важна роль нормальной микрофлоры как антигенного стимулятора иммунной системы, отсутствие нормального микробного биоценоза вызывает многочисленные её дисфункции, а у поросят-сосунов отмечают недоразвитие основных
иммунокомпетентных органов. При нормальной колонизации многочисленные микробы индуцируют образование низких титров антител, мишенью которых вряд ли являются конкретные виды. Эти антитела - преимущественно Ig класса А, выделяющиеся на поверхность слизистых оболочек. С одной стороны, IgA составляют основу местной невосприимчивости к проникающим возбудителям и не дают возможности комменсалам проникать в глубокие ткани, с другой - способствуют поддержанию гомеостаза самих слизистых оболочек [10. - С.30, 11. - С.418, 3. - С.250].
Цель исследований заключается в получении метаболитов Bifidobacterium bifidum и научно практическое обоснование биологически активной добавки для коррекции микробиоценоза желудочно-кишечного тракта и клеточного иммунитета у поросят.
Материал и методы исследования. Исследования выполнены в лаборатории «Биотехнологии животноводства» Курского ФАНЦ. Объектом исследований служила меласса сахарной свеклы 5%-25%. Для ферментации мелассы использовали пробиотический микроорганизм Bifidobacterium bifidum штамм № 1. Для получения бактериального концентрата использовали суточную культуру микроорганизмов, которую стандартизировали до 1*106 КОЕ/см3. Изучение микробиоценоза кишечника поросят проводили методом группового количественного анализа согласно методическим рекомендациям «Дисбактериозы кишечника. Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение дисбактериоза кишечника».
Количество Т-лимфоцитов определяли в реакциях спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК, %), а В-лимфоцитов -методом комплементарного розеткообразования (ЕАС - РОК, %) с эритроцитами мыши (И.М. Карпуть, 1993). Абсолютные количества клеток рассчитывали на основе данных об абсолютном количестве и проценте розеткообразующих лимфоцитов. Содержание Т-хелперов определяли нагрузочной пробой с теофиллином (Р.В. Петров с соавт., 1989, Стебловская с соавт, 2003). Экспериментальные клинические испытания биопрепарата проводили на поросятах-сосунах в период с 10 по 30 сут. и в период до-ращивания при использовании комбикормов на зерновой основе после отъема от 30 до 60 сут. возраста. Были сформированы две группы поросят по 15 голов в каждой. Первая группа
контрольная, поросятам II группы дополнительно один раз в 7 сут. выпаивали биопрепарат на основе Bifidobacterium bifidum штамм - № 1 в количестве не менее 109 КОЕ/гол.
Результаты исследования. Проведенные исследования, позволяют отметить вариабельность динамики колониеобразующих единиц (КОЕ 106) различных пробиотических микроорганизмов по отношению к питательной среде, которой являлась меласса в различной концентрации. При использовании 5% мелассы показатель КОЕ Bifidobacterium bifidum на вторые сутки достигал 7*106 КОЕ/см3. В других концентрациях максимальный показатель количества микроорганизмов приходился на третьи сутки и не превышал 6,6*106 КОЕ/см3. В данном случае низкая концентрация мелассы позволяет бифи-добактериям более активно размножаться, расходуя легко сбраживаемые сахара в течение первых 2-3 суток. На пятые сутки численность снижается до минимальных значений во всех концентрациях мелассы и составляет 3-4* 106 КОЕ/см . С 5-6 сут. отмечается повторный рост численности, что возможно связано с переходом бифидобактерий на питание более сложными сахарами, так на восьмые сутки максимальная численность микроорганизмов отмечалась в 25% мелассе 6,5*106 КОЕ/см3, а минимальная в 5% мелассе 4*106 КОЕ/см3. Вместе с тем, наиболее целесообразно использование 5% мелассы, так как позволяет достичь максимального количества КОЕ Bifidobacterium bifidum за минимальный период культивирования. При этом 25% концентрация мелассы позволяет поддерживать численность микроорганизмов в пределах 3,6-6,6 КОЕ/см3 до 8 сут. Таким образом, установлено, что максимальная численность на восьмые сутки Bifidobacterium bifidum (6,5*106 КОЕ/см3), что свидетельствует о значительной активности микроорганизмов в питательной среде из мелассы.
Следует отметить, что образование метаболитов Bifidobacterium bifidum позволяет отметить продуцирование протеинообразующих аминокислот культивируемыми микроорганизмами, тем не менее, установлена определенная вариабельность показателей (таблица 2).
Обращает внимание факт значительного увеличения синтеза незаменимых аминокислот по отношению к контролю. В исследованиях установлено значительное превышение по синтезу лизина в 26 раз, фенилаланина в 14 раз, Лейцин+изолейцину в 6,4 раза, и другим не заменимым и условно заменимым аминокисло-
там, что свидетельствует о значительной активности пробиотических микроорганизмов в питательной среде. При этом следует учитывать значимость отдельных протеинообразующих кислот для организма животных и полученного комплекса аминокислот в белковом обмене.
Показатели органических кислот, продуцируемых пробиотическими микроорганизмами, имеют высокую степень различий по отношению к контролю. Качественный состав органических кислот дает основание прогнозировать их положительное действие на организм животных. Вместе с тем, содержание щавелевой кислоты в опытном образце несколько ниже по отношению к контролю на 1,5%. Содержание уксусной кислоты выше в 2,4 раза. Показатель янтарной кислоты в опытном образце по отношению к контролю увеличен в 41,1 раза. Следует предположить, что питательная среда из мелассы и специфичность метаболизма Bifidobacterium bifidum не адекватны по отношению к органическим кислотам. Тем не менее, высокий уровень янтарной и уксусной кислот свидетельствуют о высокой степени процессов анаэробного
окисления у культивируемого микроорганизма.
Метабиотики культивируемого пробиоти-ческих средств из группы витаминов представлены в основном группой «В».
Следует отметить, что фактически весь метаболический потенциал кишечной микрофлоры локализован в толстой кишке и именно он определяет ее функциональное значение для организма животных. Поэтому одним из факторов нового подхода в создании биологически активных добавок на основе метаболитов пробиотических микроорганизмов явилось изучение микробиоценоза кишечника и взаимосвязь с клеточным иммунитетом.
В результате клинических испытаний биопрепарата установлено, что у поросят в 30 суточном возрасте отмечалось достаточно высокое содержание бифидо- и лактобактерий и типичной эшерихии. При этом было отмечено наличие в кишечном содержимом клостридий и других условно-патогенных энтеробактерий (таблица 3). Следует предположить, что полученный состав микробиоценоза соответствует нормальному состоянию кишечной микрофлоры.
Таблица 1 - Протеиногенные аминокислоты, мг/л
Показатели Результаты
Bifidobacterium bifidum Меласса
Аргинин 10,50 18,30
Лизин 27,90 0,62
Тирозин 29,10 0,44
Фенилаланин 14,80 0,31
Гистидин 6,10 5,40
Лейцин+изолейцин 90,10 14,90
Метионин 14,50 2,10
Валин 36,40 3,50
Пролин 83,90 2,40
Треонин 163,10 1,50
Серин 26,50 4,80
Аланин 224,80 1,50
Глицин 33,00 1,80
Таблица 2 - Показатели микроорганизмов кишечного микробиоценоза у поросят
Вид микроорганизмов (КОЕ/г среда faecalis) Возраст поросят
30 суток 60 суток
Bifidobacterium >109 >109
Lactobacillus 107-109 >103
Enterobacter отр. отр.
Proteus отр. 105
Staphylococcus) >103 <106
Clostridium >104 10'
Другие условно-патогенные энтеробактерии >106 107
Таблица 3 - Показатели иммунного статуса поросят, n=5
Показатели Контроль Опыт
1 Лимфоциты,109/л; 10,31±0,21 11,40 ± 0,45 13,97±1,01* 11,32 ± 1,01
2 Т-лимфоциты ,109/л; 1,98±0,06 1,47 ± 1,31 1,92±0,05 1,22 ± 1,91
3 Т-хелперы,109/л; 1,09±2,31 1,11 ± 3,01 1,29±1,69 1,93 ± 1,71
4 Т-супрессоры,109/л; 0,62±1,56 0,64 ± 1,21 0,65±1,91 0,55 ± 2,37
5 В-лимфоциты,109/л 2,20±0,69 2,21 ± 0,63 4,25±0,73* 5,28 ± 0,71*
Примечание: Р< 0,05; Числитель показатели в 30сут. возрасте; знаменатель в 60 сут. возрасте.
Следует отметить, что нормальная микрофлора составляет конкуренцию для многих патогенов, и механизмы подавления их роста достаточно разнообразны. Основным является избирательное связывание поверхностных рецепторов клеток, особенно эпителиальных. Большинство представителей резидентной микрофлоры проявляет выраженный антагонизм, направленный, в том числе и против патогенных видов. Подобные свойства особенно выражены у бифидобактерий.
Проведенные исследования в 60 суточном возрасте позволяют отметить, что наблюдается тенденция изменения кишечной микрофлоры с явлениями относительного неблагополучия микробоценоза. Установлено снижение КОЕ/г лактобактерий 103, увеличение стафилококков и клостридий до 106 и 107, незначительного увеличения другой условно-патогенной микрофлоры. Вместе с тем содержание бифидобактерий 109 остатается на достаточном уровне.
Не менее важна роль нормальной микрофлоры как антигенного стимулятора иммунной системы, отсутствие нормального микробного биоценоза вызывает многочисленные её дисфункции, а у поросят-сосунов отмечают недоразвитие основных иммунокомпетентных органов. При нормальной колонизации многочисленные микробы индуцируют образование низких титров антител, мишенью которых вряд ли являются конкретные виды. Эти антитела - преимущественно ^ класса А, выделяющиеся на поверхность слизистых оболочек.
Рассматривая отделано динамику Т- и В-лимфоцитов (таблица 4) следует отметить, что в первые дни жизни поросят основную массу среди лимфоцитов составляли Т-клетки. По
мере повышения возраста поросят идет достоверное увеличение абсолютного числа В-лимфоцитов и положительная тенденция увеличения Т-хелперных клеток. Вместе с тем клеточные факторы иммунитета дают объективное представление о взаимосвязи микробиоценоза и показателей неспецифического иммунитета.
Таким образом, следует предположить, что изменение микробиоценоза связано с кормлением поросят растительными комбикормами, при этом дополнительное введение биопрепарата на основе Bifidobacterium bifidum штамм - № 1 в количестве не менее 109 КОЕ/гол. позволяет корректировать состояние кишечной микрофлоры и клеточного иммунитета растущих поросят.
Вывод. Результаты исследований позволяют утверждать, что после отъема у поросят развиваются дисбиотические изменения микрофлоры кишечника, проявляющиеся в снижении числа представителей нормофлоры: бифидо- и лактобактерий, типичных эшерихий и росте числа факультативных и условно-патогенных микроорганизмов. Для
стабилизации нормальной микрофлоры у поросят-сосунов и отъемышей целесообразно применение различных препаратов в виде биологически активных добавок пробиотически средств и их метаболитов. В исследованиях проведено научно практическое обоснование биологически активной добавки для коррекции микробиоценоза желудочно-кишечного тракта и некоторых факторов клеточного иммунитета у растущего молодняка свиней на основе пробио-тического микроорганизма Bifidobacterium bifidum при культивировании на питательной среде из мелассы.
Список использованных источников
1. Метабиотики как естественное развитие пробиотической концепции / М.Д. Ардатская, Л.Г. Столярова, Е.В. Архипова, О.Ю. Филимонова // Трудный пациент. - 2017.- № 6-7. - Т. 15. - С. 35-39.
2. Shenderov B.A. Metabiotics: novel idea or natural development of probiotic conception. Microb Ecol Health Dis. - 2013. - V. 24. - P. 203-299.
3. Yoshimura Y., Oda M., Isobe N. Effect of Feeding Probiotics on the Localization of Cells Containing Immunorective Interleukin-6 in the Intestine of Broiler Chicks Text. J. Poultry Sci. - 2010. - V. 47. - 3. - P. 250-255.
4. Коршунов В.М., Ефимов Б.А., Пикина П.А. Характеристика биологических препаратов и пищевых добавок для функционального питания и коррекции микрофлоры кишечника // Микробиология. -2000. - № 3. - С. 86-91.
5. Probiotics in aquaculture: The need, principles and mechanisms of action and screening processes / A. Kesarcodi-Watson, H. Kaspar, M.J. Lategan, L. Gibson // Aquaculture. - 2008. - 274. - P. 1-14.
6. Использование биологически активных кормовых добавок для повышения питательных свойств комбикормов и увеличения норм ввода в комбикорма шротов и жмыхов / Д.С. Павлов, И.А. Егоров, Р.В. Некрасов и др. // Проблемы биологии продуктивных животных. - 2011. - № 1. - С. 89-92.
7. Тараканов Б.В., Николичева Т.А., Алешин В.В. Достижения и перспективы использования в животноводстве Пробиотики // В кн.: Прошлое, настоящее и будущее зоотехнической науки. Тр. ВИЖа. -2004. - С. 69-73.
8. Сидоров М.А., Субботин В.В., Данилевская Н.В. Нормальная микрофлора животных и ее коррекция пробиотиками // Ветеринария. - 2000. - № 1. - С. 17-22.
9. Панин А.Н., Малик Н.И. Пробиотики - неотъемлемый компонент рационального кормления животных // Ветеринария. - 2006. - № 7. - С. 19-22.
10. Филенко В., Растоваров Е. Использование биологически активной добавки биобактон в сочетании с бифидобактерином для поросят-гипотрофиков // Главный зоотехник. - 2006. - № 12. - С. 3 0-31.
11. Биопрепарат на основе штамма Lactobacillus plantarum L-211 для животноводства / В.И. Фисинин, Е.А. Артемьева, И.И. Чеботарев и др. // Сельскохозяйственная биология. - 2017. - № 2. - С. 418-424.
List of sources used
1. Metabiotics as a natural development of the probiotic concept / M.D. Ardatskaya, L.G. Stolyarova, E.V. Arkhipova, O.Yu. Filimonova // Difficult patient. - 2017. - No. 6-7. - T. 15. - S. 35-39.
2. Shenderov B.A. Metabiotics: novel idea or natural development of probiotic conception. Microb Ecol Health Dis. - 2013. - V. 24. - P. 203-299.
3. Yoshimura Y., Oda M., Isobe N. Effect of Feeding Probiotics on the Localization of Cells Containing Immunorective Interleukin-6 in the Intestine of Broiler Chicks Text. J. Poultry Sci. - 2010. - V. 47. - 3. - P. 250255.
4. Korshunov V.M., Efimov B.A., Pikina P.A. Characterization of biological preparations and food additives for functional nutrition and correction of intestinal microflora // Microbiology. - 2000. - No. 3. - S. 86-91.
5. Probiotics in aquaculture: The need, principles and mechanisms of action and screening pro-cesses. / A. Kesarcodi-Watson, H. Kaspar, M.J. Lategan, L. Gibson // Aquaculture. - 2008. - 274. - P. 1-14.
6. The use of biologically active feed additives to improve the nutritional properties of compound feeds and increase the rate of introduction of meal and cake into compound feeds / D.S. Pavlov, I.A. Egorov, R.V. Nekrasov et al. // Problems of the biology of productive animals. - 2011. - No. 1.- P. 89-92.
7. Tarakanov B.V., Nikolicheva T.A., Aleshin V.V. Achievements and prospects of use in livestock probiotics // In the book: Past, present and future of zootechnical science. Tr. VIZHA. - 2004. - S. 69-73.
8. Sidorov M.A., Subbotin V.V., Danilevskaya N.V. Normal microflora of animals and its correction with probiotics // Veterinary medicine. - 2000. - No. 1. - S. 17-22.
9. Panin A.N., Malik N.I. Probiotics - an integral component of rational animal feeding // Veterinary medicine. - 2006. - No. 7. - S. 19-22.
10. Filenko V., Rastovarov E. The use of biologically active biobactone supplements in combination with bifidobacterin for hypotrophic piglets // Chief Zootechnician. - 2006. - No. 12. - S. 30-31.
11. Biological product based on the strain of Lactobacillus plantarum L-211 for livestock / V.I. Fisinin, E.A. Artemyev, I.I. Chebotarev et al. // Agricultural Biology. - 2017. - No. 2. - S. 418-424.
