CC BY
9
С О. В. БУХАРИН. Н. В. НЕМЦЕВА, 2002 УДК 614.777:574.6331-078
О. В. Бухарин, И. В. Нелщева
НОВЫЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К АНАЛИЗУ САНИТАРНО-ГИГИЕНИЧЕСКОГО И ЭКОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ПРИРОДНЫХ ВОДОЕМОВ
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН. Оренбург
Регистрируемое повсеместно ухудшение экологического и санитарного состояния водоемов определило повышенный интерес исследователей к углубленному изучению водных микроорганизмов (бактерий, водорослей и простейших), составляющих первичное звено экологических систем и являющихся наиболее информативной диагностической компонентой биоты. При исследовании водных микроорганизмов опираются на количественные показатели: общее число особей, видовое разнообразие, биомассу, долю индикаторных и санитарно-по-казательных видов |6|. Вместе с тем достаточно информативными для определения санитарного и экологического состояния объектов внешней среды оказались качественные показатели, позволяющие выявлять сдвиги, предшествующие необратимым изменениям природной среды [1|. Вот почему микробиологическая характеристика микробиоценозов, основанная на анализе межмикробных симбиотических взаимодействий гидробио-нтов, продуцирующих биологически активные вещества [8, 15], может быть использована для оценки состояния водоемов.
В результате изучения 350 видов бактерий, водорослей и простейших, изолированных из речных планктонных сообществ, обозначился широкий круг обитателей водоемов с наличием персистентных свойств (рис. 1). Среди бактерий лизоцимная активность встречалась у 50—70% изолятов. Продукция лизоцима была также характерна для 25% видов сине-зеленых, 44% зеленых и 20% диатомовых водорослей, а также для подавляющего большинства (99,9%) простейших. Антилизоцимная активность (АЛА) выявлена у 33—50% изученных альго-культур, относящихся соответственно к отделам сине-зеленых и зеленых водорослей. У представителей прото-зойной фауны АЛА не зарегистрирована. У бактерий АЛА встречалась достаточно часто: у 30—90% изолятов в зависимости от вида. Для ряда пресноводных бактериальных культур были характерны также антикомплементарная (АКА), "антиинтерфероновая" (АИА) и антигис-тоновая активности. Отмечено, что в подавляющем большинстве случаев сочетанием антилизоцимного, антикомплементарного и "антиинтерферонового" признаков характеризовались условно-патогенные и санитар-но-показательные виды бактерий. Наличие у этих мик-
роорганизмов указанных свойств свидетельствует об их высоком персистентном потенциале, что согласуется с представлениями о них как о прокариотах, способных длительно выживать в эукариотических клетках [3].
В последнее время показатели изменения экспрессивных характеристик, определяющие эковариантные различия биопрофилей бактерий, выявленные на модели кишечной палочки, рассматриваются в качестве информативных критериев их экотопной принадлежности |5|.
В результате дальнейшего изучения биопрофилей водной бактериофлоры оказалось, что экспрессивность персистентных свойств у аллохтонной микрофлоры приблизительно в 2 раза выше, чем у автохтонной (рис. 2), что, следуя принципу экологической детерминированности [3|, свидетельствует об организменном происхождении большинства привносимых в водоем бактерий.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что факторы персистенции водных микроорганизмов достаточно широко распространены в природных популяциях, а экспериментальное изучение лизоцим-ан-тилизоцимных характеристик у гидробионтов выявило их ведущее положение. Лизоцим-антилизоцимные характеристики гидробионтов оказалось возможным объединить в функциональную систему [2|. Установлено, что эта система может не только автономно функционировать внутри одного сообщества, но и способствовать осуществлению сложных сетевых взаимодействий в биоценозах и экосистемах [12]. Лизоцим-антилизоцимные взаимодействия оценены как универсальный механизм выживания микроорганизмов в альго- и протозойно-бакте-риальных сообществах [II, 13|. Виды микроорганизмов, характеризующиеся антилизоцимным признаком, медленнее выедаются животными-фитофагами (рис. 3), чем виды, не проявляющие антилизоцимную активность, падение кривой их численности менее выражено и нарастание биомассы начинается раньше.
Данные анализа внутрипопуляционной структуры свидетельствовали об адаптивном характере антилизоцимного признака гидробионтов. Оказалось, что лизо-цим гидробионтов способствует расширению спектра гетерогенности популяций бактерий и водорослей по ан-тилизоцимному признаку, а зоопланктеры участвуют в
/ОО -| 90-80-70-бО-50-40-30-20-Ю -О у
I б Ъв □ <
1
1
1
1
ю
п
/2
13
И
¡5
Рис. I. Распространение персистентных свойств у гидробионтов.
По оси абсцисс 1 — СШорИога, 2 — Загсотая^орЬога, 3 — ВасШапарНуШ, 4 — СЫогорЬут. 5— СуапорЬую, 6— СЫат1с1оЬас(спассае, 7— Ведааюасеае, 8— Мюгососсассас, 9— 51гер1ососсассае, 10— С^орИадасеае, 11 — ВасШасеае, 12— АгоюЬааепасеае, 13— Рки-с1отопасеае, 14 — МЬпопасеае, 15 — ЕшегоЬас(епасеае; а — антилизоцимная активность, б — антикомплементарная активность, а — антиинтерфероновая активность, г — лизоцимная активность, д — антигистоновая активность; по оси ординат — доля изолятов (в %).
Рис. 2. Сравнительная характеристика экспрессивности антилизоцимного и антикомплементарного признаков у автохтонной и аллохтонной микрофлоры природных водоемов.
По оси абсцисс — / — автохтонные. 2 — аллоктониые; а — АЛА, б — АКА; по оси ординат (слева) — АЛА (в мкг/мг), (справа) — АКА (в усл. ед).
селективном отборе клонов бактерий и водорослей с более высоким антилизоцимным признаком |13].
В этой связи, по-видимому, лизоцим-антилизоцим-ные связи гидробионтов следует рассматривать как один из механизмов, обеспечивающий жизнедеятельность водных биоценозов в целом.
Вместе с тем анализ распространения персистентных свойств среди гидробионтов показал, что, вероятно, взаимодействия микроорганизмов выходят за рамки системы лизоцим—антилизоцим. Не следует забывать, что для многих изолятов характерны также АКА, АИА и антиги-стоновая активность (АГА). Это приводит к мысли о возможности существования аналогичных связей комплемент—антикомплемент, гистон—антигистон и т. п., поскольку появление комплемента как фактора неспецифической защиты отмечено у моллюсков, рыб [7] и других более совершенных представителей гидрофауны. Ги-стоны же достаточно широко представлены в эукариоти-ческих клетках и организмах [9].
Факторы бактериальной персистенции оцениваются в качестве маркеров при определении санитарно-эколо-гического состояния объектов окружающей среды [3]. Использование указанных свойств микроорганизмов в санитарной практике привлекательно тем, что они относятся к так называемым факторам раннего реагирования, т. е. могут задолго до необратимых изменений сигнализировать об экологическом неблагополучии.
Проведенные исследования персистентных свойств у пресноводных микрооорганизмов показали, что наиболее информативными параметрами для улавливания изменений в природных водоемах являются лизоцимная и антилизоцимная активности гидробионтов, в то время как для оценки антропогенной нагрузки на водоемы, а также для санитарной характеристики воды лучше подходит сочетание АЛА с АКА и АИА.
Полученные материалы позволили разработать ряд методов, позволяющих оценивать экологическое и санитарное состояние природных и питьевых вод. В основу разработанного метода определения состояния водных биоценозов был положен расчетный показатель "Л" оценки лизоцим-антилизоцимных взаимодействий гидробионтов, имеющий дискретный характер, опираю-
щийся на соотношение лизоцимактивных и антилизоци-мактивных микроорганизмов при оценке экологического состояния водоемов. Оценочная шкала состояния водных биоценозов имеет следующий вид: 0—2 > "Л" > 5 — экологическое неблагополучие; 2 < "Л" < 5 — экологическое благополучие.
Были разработаны также новые подходы к биоиндикации свежего фекального загрязнения воды поверхностных водоемов, включающие выделение культур лакто-зопозитивных кишечных палочек, дополнительно у которых определяли АЛА, АКА и АИА. Показатели АЛА > 4 мкг/мл, АКА > 0,5 усл. ед. и АИА > 0,1 усл. ед. свидетельствовали о присутствии свежего фекального загрязнения. Комплекс качественных персистентных характеристик выделенных лактозопозитивных кишечных палочек как инструмент биоиндикации свежего фекального загрязнения позволил выявлять сроки его возникновения и зоны распространения.
При выборе источника открытого питьевого водоснабжения важна оценка сапробности водоема. Наиболее чувствителен к изменяющимся условиям внешней среды фитопланктон. Водоросли благодаря высокой чувствительности к условиям окружающей среды играют важную роль при биологическом анализе воды, для многих из них уже известны показатели сапробности (в отличие, например, от бактериальной флоры) и разработаны соответствующие таблицы [4].
Как известно, сапробность рассматривается как комплекс физиолого-биохимических свойств организма, обусловливающий его способность обитать в воде с тем или иным содержанием органических веществ, отражающим, в частности, степень ее загрязнения. Степень сапробности водоема обычно оценивается по усредненному суммарному показателю индексов сапробности максимального количества водорослевых организмов [16), обнаруживаемых в водоеме. Понятно, что этот метод весьма трудоемкий, а исследования занимают длительный срок.
В ходе работ было выявлено, что для водных объектов с поли- и а-мезосапробными типами воды характерно преобладание антилизоцимных форм водорослей, тогда как водные объекты с р-мезо и олигосапробным состоянием характеризовались преобладанием лизоцимактивных (ЛА) форм. В связи с этим стало ясно, что для определения сапробности воды нет необходимости выде-
8 г-7 6 5 4 3 2 1
¡4
21
28
Рис. 3. Динамика "выедания" водорослевых культур при сокультивировании с фитофагами.
По оси абсцисс — время (в сут); / — водоросли Scenedesmiis acutus (АЛА +), при сокультивировании с простейшими, 2 — водоросли Sccncdesmus qudricauda (АЛА-) при сокультивировании с простейшими. 3 — водоросли Microcystis aeruginosa (АЛА +) при сокультивировании с кладоиера-ми, 4 — водоросли Microcystis pulverea (АЛА-) при сокультивировании с дафниями; 5 — простейшие при сокультивировании с водорослями: 6 — дафнии при сокультивировании с водорослями: по оси ординат — Ln числа обследованных особ/мл.
40 20 О
-го -40 -so -во -too -120
я
Ос
Рис. 4. Характеристика степени очистки и вторичной контаминации потребляемой питьевой воды (ось ординат — в %).
I — простейшие, 2 — диатомовые, 3 — зеленые, 4 — эвглсновыс, 5 — бактерии; а — доля микроорганизмов в питьевой воде после очистки до се поступления в разводящую сеть, б — доля микроорганизмов в питьевой воде, доставленной по разводящей сети к потребителю.
лять все микроводоросли из отобранных проб — достаточно выделить индикаторные виды, обладающие лизо-цимной и антилизоцимной активностью, у которых определяют сапробные индексы, вычисляют среднее значение и по нему судят о степени сапробности водоема. Это существенно упростило исследования, ограничивая их лизоцим-антилизоцимной частью альгосообщества, и ускорило определение сапробности водоема в 2—5 раз.
Известно, что качество воды во многом определяется составом населяющей ее микрофлоры. Установлено, что в процессе водоподготовки из воды элиминируются бактерии с низким уровнем персистентных свойств или их отсутствием [10). В итоге, как правило, изолируемые из проб питьевой воды штаммы бактерий, характеризуются АЛА и АКА. Сохранение бактерий с персистентным потенциалом можно объяснить их тесными симбиотичес-кими связями с другими гидробионтами, которые также преодолели барьер очистных сооружений (рис. 4). Вот почему при оценке качества питьевой воды следует обращать внимание не только на количественные, но и на качественные (персистентные) характеристики выявленной бактериофлоры.
Использование разработанных методов в комплексе санитарно-гигиенических и экологических работ [10, 12, 14| позволило повысить точность определения фекального загрязнения водоемов, ускорить определение сапробности водоемов и состояния водных биоценозов.
Таким образом, полученные результаты показали, что факторы персистенции водных микроорганизмов достаточно широко распространены у штаммов природных популяций. Персистентные свойства микроорганизмов "маркируют" экологическую принадлежность бактерий. Эковариантные различия гидробионтов по параметрам персистентных характеристик могут быть использованы в качестве информативных критериев индикаторной значимости в работах санитарно-гигиенического и эко-
логического профиля. Ценность этих материалов существенна с прикладной точки зрения, так как они уже сегодня открывают широкие перспективы для проведения микробиологического мониторинга и экологических исследований природных водоемов.
Л итература
1. Бухарин О. В., Литвин В. Ю. Патогенные бактерии в природных экосистемах. — Екатеринбург, 1997.
2. Бухарин О. В., Соловых Г. Н., Немцева И. В. и др. // Гиг. и сан. - 1997. - № 5. - С. 57-59.
3. Бухарин О. В. Персистенция патогенных бактерий.
- М„ 1999.
4. Вассер С. П., Кондратьева Н. В. и др. Водоросли: Справочник. — Киев, 1989.
5. Гриценко В. А. Роль факторов персистенции в биологии экологии Escherichia coli: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. — Оренбург, 2001.
6. Кузнецов С. И., Дубинина Г. А. Методы изучения водных микроорганизмов. — М., 1989.
7. Купер Э. Сравнительная иммунология: Пер. с англ.
- М., 1980.
8. Маргелис Л. Роль симбиоза в эволюции клетки. — М„ 1983.
9. Мец/iep Д. Биохимия: Пер. с англ. — М., 1980. — Т. 1. - С. 127-129.
10. Мисетов И. А., Немцева Н. В. // Журн. микробиол.
- 2000. - № 4 (приложение). - С. 95-98.
11. Немцева Н. В., Алехина Г. П. // Там же. — 1996. — № 3. - С. 93-96.
12. Немцева Н. В., Алехина Г. П., Мисетов И. А. // Там же. - 1997. - № 4. - С. 120-123.
13. Немцева Н. В. // Там же. - С. 123-127.
14. Немцева Н. В., Мисетов И. А., Алехина Г. П. и др. // Гиг. и сан. - 1999. - № 4. - С. 9-11.
15. Шлегель Г. Общая микробиология: Пер. с нем. — М.. 1987.
16. Kolkwitz R-, Marsson М. // Rep. German. Rot. Soc. — 1908. - Bd 26a.
Поступила 21.12.01
Summary. The paper shows that in addition to the qualitative characteristics that are of rather informative value for evaluation of the sanitary and ecological conditions of environmental objects, there are suitable qualitative characteristics that may reveal the changes preceding irreversible changes in the natural environment. As such, the factors of persistence which are rather widely prevalent in aquatic microorganisms. By taking into account that the persistent properties of microorganisms label an ecological affiliation of bacteria, ecological type-specific differences of hydrobionts in persistent characteristics, they may be used as informative criteria for an indicator value in sanitary and ecological work. The value of these materials is great in the applied point of view as just now they open up vistas for microbiological monitoring and ecological studies of natural water reservoirs.
С КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2002 УДК 614.777:574.6351-078
Г. Н. Соловых, Е. М. Нефедова, Г. М. Устинова, Е. К. Раимова, Е. А. Рябцева, Е. И. Ушакова ЛИЗОЦИМ ГИДРОБИОНТОВ И ЕГО РОЛЬ В ПРОЦЕССАХ САМООЧИЩЕНИЯ ВОДОЕМОВ
Оренбургская государственная медицинская академия
Растущая потребность в чистой воде, отвечающей санитарным требованиям, выдвигает на первое место задачи изучения разнообразных механизмов процесса самоочищения водоемов, особое место среди которых занимают биологические: включение загрязняющих веществ в процессы обмена, их разрушения или перевод в другие нетоксичные формы соединений, а также антагонизм
различных групп гидробионтов и т. д. Среди множества биологически значимых факторов, принимающих участие в формировании гидробиоценозов, является лизо-цим [2, 3) — один из наиболее широко распространенных природных ферментов [4, 16, 17], обладающих антибактериальной активностью. В наших исследованиях показано, что у различных групп гидробионтов (бакте-
