CC BY
6
40 20 О
-го -40 -so -во -too -120
я
Ос
Рис. 4. Характеристика степени очистки и вторичной контаминации потребляемой питьевой воды (ось ординат — в %).
I — простейшие, 2 — диатомовые, 3 — зеленые, 4 — эвгленовые, 5 — бактерии; а — доля микроорганизмов в питьевой воде после очистки до се поступления в разводящую сеть, б — доля микроорганизмов в питьевой воде, доставленной по разводящей сети к потребителю.
лять все микроводоросли из отобранных проб — достаточно выделить индикаторные виды, обладающие лизо-цимной и антилизоцимной активностью, у которых определяют сапробные индексы, вычисляют среднее значение и по нему судят о степени сапробности водоема. Это существенно упростило исследования, ограничивая их лизоиим-антилизоцимной частью альгосообщества, и ускорило определение сапробности водоема в 2—5 раз.
Известно, что качество воды во многом определяется составом населяющей ее микрофлоры. Установлено, что в процессе водоподготовки из воды элиминируются бактерии с низким уровнем персистентных свойств или их отсутствием [10). В итоге, как правило, изолируемые из проб питьевой воды штаммы бактерий, характеризуются АЛА и АКА. Сохранение бактерий с персистентным потенциалом можно объяснить их тесными симбиотичес-кими связями с другими гидробионтами, которые также преодолели барьер очистных сооружений (рис. 4). Вот почему при оценке качества питьевой воды следует обращать внимание не только на количественные, но и на качественные (персистентные) характеристики выявленной бактериофлоры.
Использование разработанных методов в комплексе санитарно-гигиенических и экологических работ [10, 12, 14| позволило повысить точность определения фекального загрязнения водоемов, ускорить определение сапробности водоемов и состояния водных биоценозов.
Таким образом, полученные результаты показали, что факторы персистенции водных микроорганизмов достаточно широко распространены у штаммов природных популяций. Персистентные свойства микроорганизмов "маркируют" экологическую принадлежность бактерий. Эковариантные различия гидробионтов по параметрам персистентных характеристик могут быть использованы в качестве информативных критериев индикаторной значимости в работах санитарно-гигиенического и эко-
логического профиля. Ценность этих материалов существенна с прикладной точки зрения, так как они уже сегодня открывают широкие перспективы для проведения микробиологического мониторинга и экологических исследований природных водоемов.
J1 итература
1. Бухарин О. В., Литвин В. Ю. Патогенные бактерии в природных экосистемах. — Екатеринбург, 1997.
2. Бухарин О. В., Соловых Г. Н., Немцева И. В. и др. // Гиг. и сан. - 1997. - № 5. - С. 57-59.
3. Бухарин О. В. Персистенция патогенных бактерий.
- М„ 1999.
4. Вассер С. П., Кондратьева Н. В. и др. Водоросли: Справочник. — Киев, 1989.
5. Гриценко В. А. Роль факторов персистенции в биологии экологии Escherichia coli: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. — Оренбург, 2001.
6. Кузнецов С. И., Дубинина Г. А. Методы изучения водных микроорганизмов. — М., 1989.
7. Купер Э. Сравнительная иммунология: Пер. с англ.
- М., 1980.
8. Маргелис Л. Роль симбиоза в эволюции клетки. — М„ 1983.
9. Мец/iep Д. Биохимия: Пер. с англ. — М., 1980. — Т. 1. - С. 127-129.
10. Мисетов И. А., Немцева Н. В. // Журн. микробиол.
- 2000. - № 4 (приложение). - С. 95-98.
11. Немцева Н. В., Алехина Г. П. // Там же. — 1996. — № 3. - С. 93-96.
12. Немцева Н. В., Алехина Г. П., Мисетов И. А. // Там же. - 1997. - № 4. - С. 120-123.
13. Немцева Н. В. // Там же. - С. 123-127.
14. Немцева Н. В., Мисетов И. А., Алехина Г. П. и др. // Гиг. и сан. - 1999. - № 4. - С. 9-11.
15. Шлегель Г. Общая микробиология: Пер. с нем. — М.. 1987.
16. Kolkwitz R-, Marsson М. // Rep. German. Rot. Soc. — 1908. - Bd 26a.
Поступила 21.12.01
Summary. The paper shows that in addition to the qualitative characteristics that are of rather informative value for evaluation of the sanitary and ecological conditions of environmental objects, there are suitable qualitative characteristics that may reveal the changes preceding irreversible changes in the natural environment. As such, the factors of persistence which are rather widely prevalent in aquatic microorganisms. By taking into account that the persistent properties of microorganisms label an ecological affiliation of bacteria, ecological type-specific differences of hydrobionts in persistent characteristics, they may be used as informative criteria for an indicator value in sanitary and ecological work. The value of these materials is great in the applied point of view as just now they open up vistas for microbiological monitoring and ecological studies of natural water reservoirs.
С КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2002 УДК 614.777:574.6351-078
Г. Н. Соловых, Е. М. Нефедова, Г. М. Устинова, Е. К. Раимова, Е. А. Рябцева, Е. И. Ушакова ЛИЗОЦИМ ГИДРОБИОНТОВ И ЕГО РОЛЬ В ПРОЦЕССАХ САМООЧИЩЕНИЯ ВОДОЕМОВ
Оренбургская государственная медицинская академия
Растущая потребность в чистой воде, отвечающей санитарным требованиям, выдвигает на первое место задачи изучения разнообразных механизмов процесса самоочищения водоемов, особое место среди которых занимают биологические: включение загрязняющих веществ в процессы обмена, их разрушения или перевод в другие нетоксичные формы соединений, а также антагонизм
различных групп гидробионтов и т. д. Среди множества биологически значимых факторов, принимающих участие в формировании гидробиоценозов, является лизо-цим [2, 3) — один из наиболее широко распространенных природных ферментов [4, 16, 17], обладающих антибактериальной активностью. В наших исследованиях показано, что у различных групп гидробионтов (бакте-
рий, микроводорослей, зоопланктеров) широко распространена лизоцимная активность [1, II, 14]. Показано, что лизоцим участвует в межпопуляционных взаимодействиях в гидробиоценозе, обеспечивая гидробионтам конкурентоспособность в борьбе за определенную экологическую нишу. Однако роль лизоиима в процессах самоочищения природных водоемов остается малоизученной. Поэтому целью данного исследования явилось изучение роли лизоцима гидробионтов в процессах самоочищения водоемов.
В лабораторных исследованиях были использованы штаммы Rhodococcus ruber ИЭГМ АС221, ИЭГМ АС382 и ИЭГМ AC7I из региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов, Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН [7], а также культуры Daphnia magna, Scenedesmus quadricauda. Определение числа сапрофитных и колиформных бактерий проводилось согласно «Унифицированным методам исследования качества вод» (1985 г.). Лизоцимная и ан-тилизоцимная активность бактерий определялась чашечным методом с использованием принципа отсроченного антагонизма по отношению к тест-культуре Micrococcus lysodeikticus |5|. Уровень лизоцимной активности зоопланктеров и фитопланктона устанавливали с помощью метода фотометрического (турбидиметрического) определения лизоцимной активности (8) с использованием суспензий живых и обработанных хлороформом |6) клеток индикаторной культуры Micrococcus lysodeikticus (штамм № 2665 ГНИИСКМБП им. Л. А. Тарасевича).
Скорость и качество биологической очистки воды зависит как от количества бактерий, так и от качественного состояния микробиоценоза [12]. Анализ данных по качественному составу микрофлоры р. Урал в районе Оренбурга показал, что доминирующими формами бактерий в реке являются палочки различной величины. В минимальном количестве встречается кокковая флора. Преобладание палочковидных и небольшое количество кокков в р. Урал свидетельствует о высоком содержании легкодоступного органического вещества и начальных этапах его минерализации [13]. Отличительной особенностью бакте-риопланктона является его высокая агрегированность на детрите, водорослях и высшей водной растительности. В видовом составе микрофлоры р. Урал на протяжении ряда лет отмечено широкое распространение видов Caulobacter subvibrioides, Caulobacter bacteroides, Artrobakterglobiformis [14], которые, поданным H. А. Лаптевой [10], предпочтительно усваивают легкодоступное органическое вещество. Утилизаторы трудноокисляемых углеводородов представлены нитчатыми формами Sphaerotilus natans и видами Rhodococcus sp. [15].
Таким образом, качественный состав бактерий отражает как характер загрязнения, так и степень процессов его деструкции, а через них процессов самоочищения водоема.
Поэтому для достижения цели работы на первом этапе проведена оценка роли экзогенного лизоцима в процессах формирования качественного состава сообщества бактерий — деструкторов, играющих ведущую роль в процессах самоочищения водоемов. Для решения этой задачи были поставлены модельные эксперименты по изучению влияния стандартного яичного лизоцима на динамику развития бактерий — деструкторов в водном биоценозе.
Анализ динамики развития бактериального сообщества речной воды в контрольной (без лизоцима) и опытной (с добавлением яичного лизоцима) пробах показал падение численности бактерий на протяжении первых 4 ч, а далее в контрольной пробе начался рост популяции сапрофитных бактерий, который к 12 ч от начала эксперимента привел к первому пику в численности сапрофитов (3550 ± 50 КОЕ/мл). В опытной пробе рост популяции также начался через 4 ч, но увеличение численности сапрофитов шло медленнее, чем в контроле, и первый пик был зафиксирован через 24 ч от начала эксперимента (28 ООО ± 1000 КОЕ/мл) (см. рисунок 1). В динамике развития
30000 г 25 ООО 20 ООО 15 ООО Ю ООО 5 ООО
Исход 4 в гг
Часы
Динамика развития микробных популяций в контроле (/) и в опыте (2).
По оси абсцисс — период наблюдения, по оси ординат — количество микроорганизмов (в КОЕ /мл)).
микробных популяций как в контрольной, так и в опытной пробе было прослежено 3 пика численности сапрофитов (в контроле: 12 ч — 3550 ± 50 КОЕ/мл, 3 сут — 3500 ± 150 КОЕ/мл, 6 суг - 2500 ± 100 КОЕ/мл; в опыте: 1 сут - 28 000 ± 1000 КОЕ/мл, 3 суг - 17 000 ± 1100 КОЕ/мл, 14 сут - 21 000 ± 1000 КОЕ/мл).
Таким образом, под действием лизоцима выявлены изменения в динамике развития микробного сообщества.
На протяжении всего эксперимента количество бактерий, способных расти на МПА с добавлением лизоцима, совпадало с общим числом сапрофитов, выращенных на среде без добавления лизоцима, а иногда и превышало его. Через 4 ч от начала эксперимента количество колоний, выросших на среде с добавлением лизоцима составляло 1000 ± 100 КОЕ/мл, а на среде без лизоцима их число не превышало 120 ± 10 КОЕ/мл. Аналогичная ситуация наблюдалась и на 7-е сутки. Все это позволяет высказать предположение о преобладании в популяции ли-зоцимустойчивых форм бактерий, занимающих экологическую нишу, освобождающуюся в результате гибели бактерий, чувствительных к лизоциму.
Динамика развития и структуры бактериоценоза, формирующегося под влиянием лизоцима (олыт), подтверждает высказанное предположение: при посеве опытных проб на МПА без добавления лизоцима численность сапрофитов на порядок превышает соответствующие показания в контроле: 28 000 ± 1000 и 3550 ± 50 КОЕ/мл. Следовательно, в бактериальном сообществе доминировали бактерии, устойчивые к лизоциму.
В структуре лизоцимустойчивого сообщества бактерий в речной воде присутствуют как лизоцимактивные, так и антилизоцимактивные формы бактерий. Под влиянием свободного лизоцима в этом сообществе отмечается снижение численности бактерий, способных продуцировать лизоцим, и увеличение численности антилизо-цимактивных бактерий и повышение уровня их активности (с 2—4 до 6—8 мкг/мл).
На следующем этапе работы были поставлены эксперименты по сокультивированию водорослей Scenedesmus quadricauda, обладающих лизоцимной активностью (0,38 ± 0,02 мкг/мл), и культур Rhodococcus ruber штаммы АС-221, не обладающих антилизоцимной активностью, АС-382, имеющих антилизоцимную активность 2 мкг/мл. Выбранная модель отражает характер взаимодействия водорослей с бактериями-деструкторами, являющимися одним из звеньев процесса самоочищения водоемов, в частности от углеводородов. Анализ этого взаимодействия позволит оценить участие лизоцима фитопланктона в процессах самоочищения.
Изменение уровня лизоцкмной активности у водорослей в зависимости от исходного уровня антилизоцимной активности бакте-рий (в мкг/мл)
Время исследования, ч Антилизоцимная активность Rhodococcus ruber, штамм АС-221 Лизоцимная активность Sceiiedesmus quadricauda Антилизоцимная активность Rhodococcus ruber, штамм АС-382 Лизоцимная активность Sceiiedesmus quadricauda
Исходно 0 0,38 ± 0,02 2 ± 0,01 0,38 ± 0,02
12 0 0,38 ± 0,02 2,5 ± 0,03 0,30 ± 0,01
24 0 0,38 ± 0,02 2,5 ± 0,02 0,22 ± 0,02
48 0 0,38 ± 0,02 3,4 ± 0.04 0,12 ± 0.03
72 0 0,38 ± 0,02 4,1 ± 0,02 0
Как видно из таблицы, в процессе сокультивирова-ния бактериальный штамм Rhodococcus ruber АС-221, не обладающий антилизоцимной активностью, под действием лизоцима водорослей элиминирует из миксткуль-туры, что может привести к снижению самоочищающей способности в биоценозе. В то же время антилизоцима-ктивный штамм Rhodococcus ruber АС-382 под действием лизоцима водорослей повышает уровень своей активности (с 2 до 4 мкг/мл), сохраняется в микробиоценозе и тем самым поддерживает его способность к самоочищению от углеводородов. При этом у водорослей лизо-цимная активность не фиксируется вовсе.
Таким образом, под воздействием лизоцима фитопланктона среди сапрофитных микроорганизмов, являющихся деструкторами в биоценозе, сохраняются бактерии, обладающие антилизоцимной активностью, которые и поддерживают способность водоема к самоочищению от органического вещества.
Известно, что для многих представителей зооценоза бактерии составляют основную часть "рациона" питания, а установленная способность некоторых представителей зооценоза продуцировать лизоцим [9, 14] и определила задачу следующего этапа: оценить роль эндогенного лизоцима зоопланктеров в формировании микробного сообщества.
После сокультивирования Daphnia magna, обладающих лизоцимной активностью 0,64 мкг/мл, со штаммами Rhodococcus ruber АС-221, не обладающими антилизоцимной активностью, а также со штаммом АС-382, имеющим уровень антилизоцимной активности 2 мкг/мл, отмечали рост числа зоопланктеров, численность бактерий либо оставалась на том же уровне, либо снижалась. При этом через 72 ч уровень эндогенного лизоцима в теле зоопланктеров сохранялся или снижался, составляя около 0,4 мкг/мл против 0,64 мкг/мл в контроле. Уровень антилизоцимной активности бактерий оставался равным 0. При сокультивировании зоопланктеров с изо-генным штаммом, имеющим уровень антилизоцимной активности 2 мкг/мл, эндогенный лизоцим у исследуемых зоопланктеров фотонефелометрически не обнаруживался, а антилизоцимная активность бактериальных клонов сохранялась на прежнем уровне.
Однако при сокультивировании этих же зоопланктеров с бактериями Rhodococcus ruber АС-71, обладающими высокой антилизоцимной активностью (6 мкг/мл), отмечено сохранение численности бактерий и уровня их активности, а иногда даже рост их числа. В популяции зоопланктеров наблюдалось замедление роста, и даже их гибель, лизоцимная активность у них не обнаруживалась, в то время как в контроле она по-прежнему сохранялась на уровне 0,64 ± 0,02 мкг/мл.
Таким образом, бактерии-деструкторы, имеющие высокий уровень антилизоцимной активности, оказываются устойчивыми к действию лизоцима зоопланктеров и сохраняются в микробиоценозе, тем самым поддерживая способность водоема к самоочищению.
Вы вод. Экспериментальное изучение показало, что лизоцим гидробионтов регулирует состав бактериоцено-за, сохраняя антилизоцимактивные формы с высоким уровнем активности (6—8 мкг/мл), что приводит к изме-
нению микробного сообщества водоема и отражается на процессах его самоочищения.
Литература
1. Алехина Г. П. Лизоцимная и антилизоцимная активность альгофлоры вводных биоценозах: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. — Оренбург, 1996.
2. Багнюк В. М, Новоженко Л. С., Закордонец О. А. // Микробиол. журн. - 1983. - Т. 45, № 2. — С. 15-21.
3. Багнюк В. М., Закордонец О. А. // Докл. АН СССР.
- 1980. - Т. 254, № 4. - С. 1018-1021.
4. Бухарин О. В., Вааиьев Н. В. Лизоцим и его роль в биологии и медицине. — Томск, 1974.
5. Бухарин О. В., Усвяцов Б. Я., Малышкин А. П., Нем-цева Н. В. // Журн. микробиол. — 1984. — № 2. — С. 27-28.
6. Бухарин О. В., Валышев А. В., Елагин Н. Н. и др. // Там же. - 1997. - № 4. - С. 117-120.
7. Ившина И. Б. Региональная профилированная коллекция алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.
— Екатеринбург, 1999.
8. Каграманова К. А., Ермольева 3. В. // Антибиотики.
- 1966. - Т. 11, № 10. - С. 9117-9119.
9. Карнаухова И. В. Лизоцимный фактор пресноводного двусторчатого люска Unio pictoruni: выделение, характеристика, функции: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. — Пермь, 2000.
10. Лаптевой Н. А., Дульцева О. А. // Инф. бюл. Института биологии внутренних вод. — 1986. — № 70. — С. 33-36.
11. Немцева Н. В. Микробиологическая характеристика биценотических взаимоотношений гидробионтов и ее значение в санитарной оценке водоемов: Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. — Челябинск, 1995.
12. Пшеничное Р. А., Колотвинов С. В. Основы построения системы генетического мониторинга природных популяций микрооорганизмов. — Свердловск, 1986.
13. Родина А. Г., Кузимицкая Н. К. // Труды Зоологического ин-та АН СССР. - М., 1968. - Т. 45.
14. Соловых Г. И. Система лизоцим—антилизоцим микроорганизмов в формировании водных сообществ пресных водоемов: Автореф. дис. ... д-ра биол. наук.
— Челябинск, 1995.
15. ФабарисоваЛ. Г. Разработка способа микробиологического контроля температуры тепловых сбросов электростанций в водоемы-охладители: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. — Оренбург, 2000.
16. Chung J. С. et al. // Arch. Biochem. - 1969. -Vol. 135. - P. 244-252.
17. Tripp M. R. U J. Parasitol. - 1967. - Vol. 47. -P. 745-753.
Поступили 21.12.01
Summary. Model experiments were carried out to study the effects of hydrobiont lysozyme on self-purifying processes of water reservoirs through its participation in the formation of a community of destructive microorganisms. Lysozyme-re-sistant forms have been found to lie at basis of bacterial cenosis of the Urals, among which there are lysozyme-active and anti-lysozyme-active ones, their population shows an inverse relationship. The exogenous lysozyme that enters the water reservoir in the period when there is a change in the dominant forms of hydrobionts affects the composition of bacterial cenosis by preserving anti-lysozyme-activity with a high activity (6-8 (g/ml), which causes a change in the microbial community of water reservoir, thus affecting the processes of its self-purification. The bacteria having ALA, which do maintain the capacity of a water reservoir for self-clearance from organic substance, persist under the action of endogenous lysozyme of phyto- and zooplankton among saprophytic microorganisms that are destructive agents in the biocenosis.
