CC BY
10
гиена и санитария 1/2011
Методы гигиенических исследований
С КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ. 2011 удк 614.777:579.842.!4)-078
В. В. Алеитя', О. 77. Папосовец', П. В. Журавлев', С. М. Суханова2, И. А. Голубенко2, А. Е. Недачин3, Ю. Г. Taiiaeea3, Т. 3. Артемова3, Е. К. Г\inn3, Н. Н. Буторина3, А. В. Загайнова3, М. М. Швагер4, Т. В. Митрофанова4
НОВЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ОБНАРУЖЕНИЮ И КОЛИЧЕСТВЕННОМУ УЧЕТУ САЛЬМОНЕЛЛ ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ
'ФГУН Ростовский НИИ микробиологии и паразитологии Роспотребнадзора, Ростов-на-Дону; гФГУН Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича Роспотребнадзора; 3ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина РАМН, Москва; ''ФГУЗ Центр гигиены и эпидемиологии в Ростовской области Роспотребнадзора, Ростов-на-Дону
В статье приведены данные по использованию методических приемов обнаружения и количественного учета сальмонелл в водных объектах с применением новой жидкой питательной среды. В экспериментальных и натурных исследованиях показано преимущество ее использования по сравнению со средами накопления, широко применяемыми в практическом здравоохранении. Установлено, что питательная среда не только накапливает биомассу, но и обеспечивает восстановление биологических свойств некультивируемых форм сальмонелл. Использование питательной среды в практических лабораториях позволит унифицировать методические подходы к исследованию водных объектов различной степени биологического загрязнения и получать сопоставимые результаты анализов.
Ключевые слова: учет сальмонелл, питательная среда, водные объекты
V. V. Aleshnya, О. P. Panasovets, P. V. Zhuravlev, S. М. Sukhanova, í. A. Golubenko, Ye. A. Nedachin, Yu. G. Talayera, Т. Z. Artemova, E. К. Gipp, N. N. Butorina, A. V. Zagainova, M. M. Shvager, Т. V. Mitrofanova. — NEW METHODOLOGICAL APPROACHES TO THE DETECTION AND QUANTITATIVE REGISTRATION OF SALMONELLA IN THE STUDY OF WATER OBJECTS
The paper gives data on the use of techniques to detect and register Salmonella in the water objects, by applying a new liquid nutrient medium. Experimental and field studies have shown its advantage over the accumulation media widely used in practical healthcare. It has been ascertained that the nutrient medium not only accumulates biomass, but also provides the restoration of the biological properties of uncultivated Salmonella species. The use of the nutrient medium at practical laboratories makes it possible to unify guidelines for the examination of water objects with varying degrees of biological pollution and to obtain the comparable results of analyses.
Key words: Salmonella registration, nutrient medium, water objects
До настоящего времени в действующих нормативных документах критерием эпидемической безопасности в отношении возбудителей острых кишечных инфекций (ОКИ) воды различного вида водопользования и сточных вод являются общие (ОКБ) и термотолерантные (ТКБ) колиформные бактерии [11 — 13]. Однако информативность этих показателей в отношении загрязнения водной среды патогенными энтеробактериями, в частности сальмонеллами как наиболее устойчивыми из патогенных представителей этого семейства, вызывает сомнение.
Алешня В. В. — д-р мед. наук, проф., вед. науч. сотр.; Журавлев П. В. — канд. мед. наук, зав. лаб. микробиологии; Панасовец О. П. — канд. биол. наук, науч. сотр. (гоб-tovniimp@mail.ru); Талаева Ю. Г. — д-р мед. наук, проф., консультант лаб. санитарной микробиологии и паразитологии; Недачин А. Е. — канд. мед. наук, зав. лаб. санитарной микробиологии и паразитологии; Артемова Т. 3. — канд. биол. наук, науч. сотр. лаб. санитарной микробиологии и паразитологии; Гипп Е. К. — канд. мед. наук, науч. сотр. лаб. санитарной микробиологии и паразитологии; Загайнова А. В. — мл. науч. сотр. лаб. санитарной микробиологии и паразитологии; Буторина Н. И. — науч. сотр. лаб. санитарной микробиологии и паразитологии (milkbacterialab@list.rii).
По данным ряда авторов [1,7], сальмонеллы обладают большей устойчивостью во внешней среде по сравнению с кишечными палочками, не всегда полностью уничтожаются дозами дезинфицирующих средств, используемых для обеззараживания питьевой воды централизованного водоснабжения и сточных вод, а также могут переходить в некуль-тивируемое состояние (НС). В хлорируемых сточных водах некультивируемые формы (НФ) сальмонелл составляют до 31% от их общего количества [16]. Сальмонеллы в НФ были зарегистрированы через 7 дней пребывания в воде поверхностных водоемов [2]. Сальмонеллы в НС утрачивают способность расти на питательных средах, обычно применяемых в практических лабораториях, но сохраняют при этом свои патогенные свойства [3].
Учитывая незначительное количество сальмонелл в водных источниках по сравнению с сопутствующей микрофлорой, для их выделения из водной среды используют среды накопления. Широко применяемые в практике среды накопления (магниевая и селенитовая) оказывают подавляющее действие не только на сопутствующую микрофлору, но и на наименее устойчивые серовары сальмонелл.
В связи с вышеизложенным была поставлена задача разработать питательную среду и эффектив-
ный метод выделения сальмонелл из воды различной степени бактериального загрязнения. Для этого разработали готовую к применению питательную среду для накопления сальмонелл (патент на изобретение № 2312136, ТУ 9385-001-01898776-2008, Регламент производства № 01898776-05— 2008, инструкция по применению № 01-11/206— 08, утвержденная Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Они-щенко от 18.12.08) и методику ее применения. В качестве источника питания использовали экстракт кормовых дрожжей (ФСП 42-0010-5883—04), в качестве ингибиторов сопутствующей микрофлоры — бриллиантовый зеленый и кристаллический фиолетовый в концентрациях, не вызывающих угнетение сальмонелл |4, 9|.
В эксперименте доказали способность разработанной среды восстанавливать биологические свойства сальмонелл, утрачиваемые при неблагоприятных условиях пребывания в воде.
Из всего многообразия факторов, известных в настоящее время и влияющих на переход сальмонелл в НС, для исследования выбрали повышенную температуру (получение НФ бактерий в короткий промежуток времени), пониженную температуру и отсутствие питательных веществ (воспроизведение в лабораторных условиях сапрофитной фазы существования сальмонелл в природных водоисточниках).
Для изучения способности сред накопления (разработанной нами среды, магниевой и селенитовой) восстанавливать биологические свойства сальмонелл, подвергшихся воздействию неблагоприятных факторов, культуры S. typhimurium 9640 и S. paratyphi В 8006 перевели в НС. НФ сальмонелл получили следующими методами:
— взвеси культур сальмонелл в дистиллированной воде (в концентрации 102 и 107 КОЕ/мл) прогревали на водяной бане при температуре 56°С в течение 3—4 и 12—14 мин в зависимости от исходной дозы заражения |15];
— сальмонеллы в концентрации 102 и 107 КОЕ/ мл выдерживали в дистиллированной воде при температуре 6°С в течение 38 и 108 сут соответственно [10].
Некультивируемыми считали сальмонеллы, которые теряли способность образовывать колонии на питательном агаре (мясопептонный агар — МПА) при "прямом" посеве 0,1 мл и последующей инкубации при температуре 37°С в течение 24 ч (контроль).
Суспензию, содержащую сальмонеллы, полученную указанными выше способами, по 1 мл вносили параллельно в 9 мл каждой из сравниваемых сред накопления. Для подсчета выросших колоний через 24 ч инкубации при температуре 37°С высевали по 0,1 мл суспензии из сред накопления на МПА.
При сравнении восстанавливающей способности трех сред накопления после воздействия повышенной температуры — 56°С (табл. 1) выявили, что рост тест-штаммов сальмонелл с использованием среды наблюдался после 4 мин (концентрация 102 КОЕ/мл) прогревания с накоплением биомассы до 106 раз и после 14 мин (концентрация 107 КОЕ/мл) — до 108 раз при отсутствии роста в контроле. Магниевая и селенитовая среды обеспечивают незначительное накопление биомассы лишь в случае присутствия в среде клеток в вегетативном состоянии. Селенитовая среда после 3-минутного прогревания суспензии клеток (концентрация 102 КОЕ/мл) даже при наличии сальмонелл в вегетативном состоянии не позволяла их обнаружить. При полном переходе сальмонелл в НС их накопления не отметили ни в магниевой, ни в селенитовой средах.
Аналогичная ситуация наблюдалась и при реверсии клеток сальмонелл, подвергшихся воздействию пониженной температуры и состояния "голода". После полного перехода сальмонелл в НС восстановление свойств произошло лишь в разработанной нами среде. Так, накопление биомассы в 103 раз на данной среде отметили уже после того, как в контроле сальмонеллы не регистрировались: на 38-е сутки для S. typhimurium 9640 и на 35-е сутки для S. paratyphi В 8006 (начальная доза заражения 102 КОЕ/мл). Увеличение начальной концентрации клеток сальмонелл до 107 КОЕ/мл приводило к увеличению сроков их пребывания в вегетативном состоянии. В контроле полный переход клеток S. paratyphi В 8006 в НС произошел на 95-е сутки, a S. typhimurium 9640 — на 108-е сутки. И в этом случае магниевая и селенитовая среды не позволяли обнаружить сальмонеллы, находящиеся в НС, тогда как предлагаемая среда позволила не только восстановить их свойства, но и накопить биомассу до 108 раз.
Культуры сальмонелл, выращенные на предлагаемой среде после воздействия неблагоприятных факторов, имели типичные культурально-морфо-логические, биохимические и серологические свойства исходных культур.
Таблица 1
Сравнение восстанавливающей способности разных сред накопления при воздействии на сальмонеллы повышенной температуры 56*С (М ± т)
Концентрация клеток, КОЕ/мл Время прогревания, мин Контроль на МПА, КОЕ/мл S. typhimurium 9640, КОЕ/мл Контроль на МПА, КОЕ/мл S. paratyphi 8006, КОЕ/мл
разработанная среда магниевая среда селенитовая среда разработанная среда магниевая среда селе-нии-товая среда
I02 3 50,3 ± 15,2 3,0- 106 ± 1,0- 104 3,0- 103 ± 4,0- 10г 0 44,3 ± 12,6 3,0- 106 ± 2,0- 105 3,0- 103 ± 3,0- 102 0
4 0 2,0- 10' ± 3,0- 105 0 0 0 2,0- 10' ± 2,0- 105 0 0
10' 12 200,5 ± 93,4 3,0- 10* ± 2,0- 10' 0 0 189,2 ± 87,4 6,0- 10« ± 1,0- 10' 0 0
14 0 2,0- 10» ± 1,0- 10' 0 0 0 5,0- I07 ± 2,0- 10' 0 0
[гиена и санитария 1/2011
Среда прошла испытания в ФГУН ГИСК им. Л. А. Тарасевича Роспотребнадзора по физико-химическим и биологическим показателям. Исследования показали, что готовая к применению среда стерильна, обеспечивает через 22 ± 2 ч инкубации при температуре 37 ± ГС увеличение количества сальмонелл (накопление) не менее чем в 105 раз и ингибирует рост сопутствующей микрофлоры в 100 раз. Эти показатели (среда должна обеспечивать накопление тест-штамма S. paratyphi В 506 не менее чем в 105 раз и подавлять рост тест-штамма Е. coli 3912/41 (055:К59) не менее чем в 100 раз) были заложены в утвержденную нормативно-техническую документацию на производство "Питательной среды для накопления сальмонелл, готовой к применению".
В ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина РАМН были проведены испытания для оценки специфической активности и ингибирующих свойств питательной среды на музейных и свежевыделенных штаммах. Для исследований взяли 8 культур микроорганизмов, полученных из коллекции ФГУН ГИСК им. Л. А. Тарасевича Роспотребнадзора (Salmonella typhi 1196, Salmonella paratyphi В 506, Salmonella paratyphi В 8006, Salmonella typhimurium 301, Salmonella typhimurium 9640, Escherichia coli 3912/41 (055:K59), Escherichia coli 675, Staphylococcus aureus 6538 — рАТСС) и 6 свежевыделенных культур из воды открытого водоема (Salmonella anatum, Salmonella infantis, Salmonella derby, Salmonella typhimurium, Salmonella london, Enterococcus faecalis). Качество среды накопления оценивали в сравнении с магниевой средой.
Данные табл. 2 свидетельствуют, что показатель эффективности накопления сальмонелл в испытуемой среде, составляющий Ю5—106, соответствует показателям, заложенным в ТУ, и в целом он несколько выше, чем в магниевой среде (103—10"). Наиболее низкий показатель накопления (103) имели свежевыделенные из водоема S. derby и S. infantis при посеве в магниевую среду. Среды различаются также и по отношению к сопутствующей микрофлоре. Ингибирующие свойства магниевой среды по отношению к Е. faecalis и Е. coli 3912/41
(055:К59) — музейный штамм, используемый для контроля ингибирующей способности питательных сред для накопления сальмонелл, — ниже, чем у испытуемой среды в 46,1 и 416 раз соответственно.
Согласно нормативным документам, действующим в Российской Федерации, исследования на отсутствие сальмонелл как наиболее устойчивых патогенных представителей семейства ЕтегоЬаае-пасеае проводятся по эпидемиологическим показаниям, при ухудшении санитарно-гигиенической обстановки, при превышении нормативов по ОКБ и ТКБ в повторно отобранных пробах, при выборе новых источников водоснабжения и в других ситуациях по решению центров Госсанэпиднадзора (учитывают отсутствие сальмонелл в 1 л воды)-
Исследованию подлежат:
— вода питьевая централизованных систем питьевого водоснабжения [12];
— вода нецентрализованных систем питьевого водоснабжения (колодезная, родниковая, из артезианских скважин) [11];
— вода питьевая, расфасованная в емкости [13];
— вода открытых водоемов (в местах водозаборов, зон рекреаций и селитебной территории) [6,
п];
— сточная вода до и после очистки [5, 11].
На сегодняшний день отсутствует единая схема для выделения сальмонелл из водной среды. С целью повышения эффективности их обнаружения рекомендовано одновременно использовать несколько сред накопления с разными селективными и ингибиторными свойствами с последующим пересевом на твердые селективные питательные среды. Такой подход не позволяет получать сопоставимые результаты анализов [7, 8].
Нами разработаны методические приемы по определению сальмонелл в воде титрационным методом, который основан на накоплении бактерий при посеве определенных объемов в разработанную питательную среду с последующим высевом на 2—3 чашки с висмут-сульфит-агаром и идентификацией выросших колоний по культуральным, биохимическим и серологическим тестам.
На базе трех бактериологических лабораторий в Ростове-на-Дону, Азове и Цимлянске апробирова-
Таблица 2
Показатели эффективности накопления сальмонелл в разработанной и магниевой средах (М ± т)
Разработанная среда Магниевая среда
Тест-штамм "нулевой" посев, КОЕ/мл через 24 ч инкубации, КОЕ/мл показатель эффективности накопления "нулевой"посев, КОЕ/мл через 24 ч инкубации, КОЕ/мл показатель эффективности накопления
S. paratyphi В 8006 53,3 ± 4,8 151,0 I06± 4,4- 10' 2,8 10' 53,3 ± 4,8 265,0 10s ± 32,3 •10s 4,9 10'
S. paratyphi В 506 80,8 ± 7,3 177,1 • 10" ± 10,0 • 10' 2,1 10' 80,8 ± 7,3 113,3 • 10' ±4,8 10' 1,4 10'
S. typhi 1196 55,0 ± 9,7 248,3 • 10'± 27,4 • 10' 4,5 10' 55,0 ± 9,7 256,0 10s ± 37,1 •105 4,6 105
S. typhimurium 301 85,0 ± 8,1 140,3 106 ± 3,4- 10' 1,6 10' 85,0 ± 8,1 123,3 • 10' ± 6,5 10' 1,4 10'
S. typhimurium 9640 88,3 ± 8,1 250,0- I06± 14,5 • 10' 2,8 10' 88,3 ± 8,1 200,0 • 10' ± 9,7 106 2,2 106
S. anatum 60,0 ± 6.4 211,6- 10" ± 33,8 • 10' 3,5 10' 60,0 ± 6,4 405,0 • 105 ± 12,9 • 105 6,7 10s
S. derby 90,0 ± 4,8 15,1 10" ± 1,- С 1,7 105 90,0 ± 4,8 2,2- 105 ± 4,8- I04 2,4 103
S. london 65,0 ± 8,0 130,0 10' ± 8,1 10' 2,0 10' 65,0 ± 8,0 106,6 10' ± 8,1 105 1,6 105
S. typhimurium 86,6 ± 8,0 295,0 10' ± 4.8- 10' 2,9 10' 86,6 ± 8,0 81,6 10'±8,1 • 106 9,4 10s
S. infantis 35,6 ± 2,5 26,3- 10' ± 1,5- 10' 7,3 I05 35,6 ± 2,5 2,7- 10s ± 0,43 • 10' 7,6 103
Таблица 3
Сравнительная оценка выделения сальмонелл из водных объектов с использованием двух сред накопления
Количество положительных проб НВЧ/1000 мл Количество сероваров Количество выделенных культур
Объект исследования Количество проб разработанная среда магниевая среда разработанная магниевая разработан- магниевая разработанная среда магниевая
абс. % выделения абс. % выделения среда среда ная среда среда среда
Вода открытых 64 45 70 10 15,6 36,5 ± 10,4 3,39 ±1,01 18 5 109 9
водоемов В, С, D, Е В
Сточная водадо 28 28 100 28 100 5997 ± 2022,4 150 ± 25,8 36 17 124 50
очистки В, С, D, Е В, С, D, Е
Сточная вода 28 19 67 15 53 683 + 156,5 18,5 ± 2,9 18 И 80 42
после очистки В, С, D, Е В, С, D
Питьевая вода 36 1 2,7 0 0 4* Н.о. 1 В Н.о. 1 Н.о.
Примечание. Н.о. — не обнаружено; * — обнаружено в одной пробе с индексом 4 в 1000 мл.
на разработанная нами методика для выделения сальмонелл из воды различной степени биологического загрязнения с использованием "Питательной среды для накопления сальмонелл, готовой к применению" в сравнении с сухой коммерческой магниевой средой для обнаружения патогенных энте-робактерий (ТУ 9229-072-00419785—97), которая до настоящего времени считалась наиболее результативной при выделении сальмонелл из водных объектов.
Исследовали 64 пробы воды открытых водоемов (Цимлянское водохранилище и р. Дон), 56 проб хозяйственно-бытовых сточных вод, 36 проб питьевой воды. При этом использовали следующие схемы посевов:
— при исследовании питьевой воды — 3 объема по 100 мл, 3 объема по 10 мл и 3 объема по 1 мл;
— при исследовании воды открытых водоемов — 2 объема по 100 мл, 2 — по 10 мл, 2 — по 1 мл и по 2 объема из разведений от Ю-1 до Ю-3; если предполагается значительное загрязнение водоема, ряд разведений может быть продолжен до 10"5;
— при исследовании сточных вод до очистки — 2 объема по 1 мл и 2 — из разведений от Ю-1 до Ю-7, после очистки — 2 объема по 100 мл, 2 — из разведений от Ю-1 до Ю-3.
Воду в объеме 100 мл высевали во флаконы со 100 мл среды, 10 мл — во флаконы с 10 мл среды, 1 мл и последующие разведения — в пробирки с 9 мл среды. Количество сальмонелл в 1000 мл (наиболее вероятное число — НВЧ) рассчитывали по таблицам Хоскинса—Мура.
Данные табл. 3 свидетельствуют, что использование "Питательной среды для накопления сальмонелл, готовой к применению", помимо увеличения процента выделения и НВЧ, повышает количество выделенных культур и серотипов сальмонелл.
Таким образом, результаты, полученные в ходе как экспериментальных, так и натурных исследований, показали, что разработанная нами среда не только позволяет накапливать биомассу сальмонелл, но и обеспечивает реверсию их утраченных
свойств при воздействии стрессовых факторов. Использование питательной среды в практических лабораториях дает возможность унифицировать методические подходы к выделению сальмонелл из водных объектов различной степени биологического загрязнения и получать сопоставимые результаты анализов.
Литература
1. Алешня В. В.. Журавлев П. В., Головина С. В. и др.//Тезисы V Международного конгресса ЭКВАТЕК. — М., 2002. — С. 705.
2. Бойцов А. Г., Ластовка О. Н. // Гиг. и сан. — 2003. — № 3.
- С. 76-77.
3. Гинсбург А. Л., Романова Ю. М. // Журн. микробиол. — 1997. - № 3. - С. 116-121.
4. Головина С. В., Панасовец О. П., Ааешня В. В. и др. // Гиг. и сан. - 2008. - № I. - С. 77-78.
5. МУ 2.1.5. 800—99. Организация Госсанэпиднадзора за обеззараживанием сточных вод: Метод, указания. — М., 2000.
6. МУК 4.2.1884—04. Санитарно-микробиологичсский и са-нитарно-паразитологический анализ воды поверхностных водных объектов: Метод, указания. — М., 2005.
7. Недачин А. Е., Артемова Т. 3., Иванова Л. В. и др. // Гиг. и сан. - 2007. - № 5. - С. 36-39.
8. Онищенко Г. Г. // Гиг. и сан. — 2006. — № 4. — С. 3—7.
9. Панасовец О. П., Нетрусов А. И., Головина С. В. и др. // Журн. микробиол. — 2007. — № 4. — С. 56—58.
10. Романова Ю. М., Алексеева Н. В., Гинсбург А. Л. // Журн. микробиол. — 1997. — № 4. — С. 35—41.
11. СанПиН 2.1.5.980—00. Гигиенические требования кохранс поверхностных вод. — М., 2000.
12. СанПиН 2.1.4.1074—01. Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества. — М., 2002.
13. СанПиН 2.1.4.1116—02. Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды, расфасованной в емкости. Контроль качества. — М., 2002.
14. СанПиН 2.1.4.1175—02. Гигиенические требования к качеству воды нецентрализованного водоснабжения. Санитарная охрана источников. — М., 2003.
15. Шелохович А. И., Кудрякова Т. А., Соколенке А. В. и др. // Сборник материалов пробл. комиссии Научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ "Холера и патогенные для человека вибрионы". — Ростов-на-Дону. 2005 - № 18. - С. 98-101.
16. Oliver J. D„ DagherM., Linden К. //J. Waterand Hlth. - 2005.
- Vol. 3, N 3. - P. 249-257.
Поступила 07.04.09
