Новые галотолерантные штаммыдеструкторы бифенила рода Rhodococcus Текст научной статьи по специальности «Экологические биотехнологии»

ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

2010 Биология Вып. 1 (1)

УДК579.87: 579.222.2: 579.222.4: 579.25

НОВЫЕ ГАЛОТОЛЕРАНТНЫЕ ШТАММЫ-ДЕСТРУКТОРЫ БИФЕНИЛА РОДА RHODOCOCCUS

Д. О. Егороваa, И. О. Коршуноваb, Е. Г. Плотниковаa,b

a Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13, e-mail: [email protected] b Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15, e-mail: [email protected]

Из образцов техногенно-минеральных образований солеразработок (Березники, Пермский край) выделено 6 штаммов-деструкторов бифенила. На основании морфо-физиологических свойств и анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК штаммы идентифицированы как Rhodococcus sp. Установлено, что штаммы используют в качестве единственного источника углерода и энергии ряд моно- и полиароматических соединений, а также их хлорированные и гидроксилиро-ванные производные. Показана способность штаммов использовать бифенил в качестве единственного источника углерода и энергии в условиях повышенного содержания хлорида натрия в среде.

Ключевые слова: засоленные почвы, почвенные бактерии, анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, Rhodococcus, биодеструкторы, галотолерантность, бифенил

Введение

Активное развитие химической и электротехнической промышленности в XX в. привело к загрязнению обширных территорий особо опасными для животных и человека соединениями ароматического ряда - полихлорированными бифенилами (ПХБ). Полихлорированные бифенилы отличаются повышенной устойчивостью к деструктивному действию физических и химических факторов (высокие и низкие температуры, воздействие кислот и щелочей). Согласно Стокгольмской Конвенции

(http://www.unep.org), полихлорированные бифенилы должны быть полностью выведены из производства; обширные территории, загрязненные данными пол-лютантами подлежат восстановлению, а ПХБ, находящиеся в местах складирования, должны быть утилизированы. Основную роль в разложении ПХБ в естественных условиях играет бактериальная микрофлора почв и донных отложений (Unterman, 1996; Pieper, 2005; Васильева, Стрижакова, 2007; Seeger, Pieper, 2010).

В течение последних десятилетий описано значительное количество бактерий, принадлежащих родам Pseudomonas, Burkholderia, Comamonas, Sphyngomonas, Rhodococcus, Bacillus, осуществляющих деструкцию ПХБ (Unterman, 1996; Seeger, Pieper, 2010). Стоит отметить, что известно лишь несколько штаммов, эффективно разлагающих широкий спектр полихлорированных бифенилов (Billingsley et al., 1997; Kim, Picardal, 2001; Pieper, 2005). Активность штаммов по отношению к ПХБ обусловливается наличием метаболических систем разложения незамещенного бифенила (Martinkova

et al., 2008; Seeger, Pieper, 2010). В связи с этим целесообразен поиск новых штаммов-деструкторов ПХБ на основе отбора штаммов, способных активно утилизировать бифенил.

В реальных условиях загрязнение окружающей среды носит комбинированный характер. Присутствие в почвах широкого спектра органических поллютантов, а также таких экстремальных факторов как повышенная минерализация, присутствие тяжелых металлов, высокий или низкий уровень рН - обусловливает стресс у бактерий и приводит к ингибированию процессов деструкции ароматических соединений (Martinkova et al., 2008). В связи с вышесказанным, бактерии, обладающие устойчивостью к стрессовым условиям среды и высокой деструктивной активностью по отношению к органическим поллютантам, представляют интерес для использования их в экобиотехнологиях.

Цель работы - изучение грамположительных бактерий-деструкторов бифенила, выделенных из техногенно-минеральных образований (Березники, Пермский край).

Материалы и методы

Среды и условия выделения штаммов-

деструкторов

В работе использовали минеральную среду Раймонда (г/л): NH4NO3 - 2.0, MgSO4 х 7H2O - 0.2, KH2PO4 - 2.0, Na2HPO4 - 3.0, Na2CO3 - 0.1, CaCl2 x 6H2O - 0.01 (Розанова, Назина, 1982) и ее модификации: а) с добавлением 5 г/л триптона и 2.5 г/л дрожжевого экстракта - в качестве полноценной среды; б) с добавлением FeSO4-7H2O - 0.001 г/л,

© Д. О. Егорова, И. О. Коршунова, Е. Г. Плотникова, 2010

50

MnSO4-5H2O - 0.002 г/л - в качестве минеральной среды при исследовании ростовых характеристик чистых культур. NaCl вносили в среды до конечной концентрации (%): 3, 5, 6, 9. Для получения агаризованных сред вносили агар («Sigma») 15 г/л.

Выделение штаммов деструкторов проводили методом накопительного культивирования. Образцы техногенно-минеральных образований (ТМО) (10 г/л) были помещены в 250 мл колбы с 100 мл основной среды Раймонда (3% NaCl) с бифенилом, в качестве ростового субстрата. Накопительные культуры инкубировали в течение 1 месяца на термокачалке (100 об/мин) при температуре 28°С. Чистые культуры штаммов-деструкторов выделяли путем высева из накопительных культур на ага-ризованную среду Раймонда с 3% NaCl с бифенилом, чистоту культур контролировали путем высева на полноценную агаризованную среду Раймонда (3% NaCl).

Определение таксономического положения

изолированных штаммов

Морфологические и физиологические признаки микроорганизмов изучали по общепринятым методикам (Методы..., 1983; Методы..., 1991). Амплификацию генов 16S рРНК проводили с использованием бактериальных праймеров 27F и 1492R (Tiirola et al., 2002). Секвенирование продуктов амплификации осуществляли с помощью набора реактивов DYEnamic ET Dye Terminator Cycle sequencing Kit на автоматическом секвенаторе MegaBASE 1000 (JSC GE Healthcare, США) согласно рекомендациям производителя. Полученные нуклеотидные последовательности анализировали с использованием программ CLUSTAL W (Thompson et al., 1994), TREECON (van de Peer, DeWachter, 1994), BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Поиск гомологичных последовательностей производили по базам данных GenBank

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и EzTaxon (http://www.eztaxon.org).

Ростовые характеристики штаммов

Ростовые характеристики штаммов изучали в жидкой минеральной среде Раймонда (3% NaCl) с бифенилом (1г/л) в качестве источника углерода и энергии. Штамм выращивали в колбах Эрленмейе-ра объемом 250 мл в 100 мл минеральной среды при температуре 28°С и аэрации на шейкере со скоростью 120 об/мин. Оптическую плотность культур измеряли на спектрофотометре BioSpec-mini (Shimadzu) при длине волны 540 нм. Расчет удельной скорости роста (д) культуры и время удвоения (td) производили по стандартным формулам.

Устойчивость бактерий к содержанию в среде культивирования NaCl

Устойчивость бактерий к содержанию в среде культивирования NaCl определяли на агаризован-ной и в жидкой минеральных средах с бифенилом (1 г/л) в качестве ростового субстрата. Концентрация хлорида натрия в среде составляла от 0 до 9%. Рост бактерий учитывали на седьмые сутки.

Субстратная специфичность штаммов

Субстратную специфичность штаммов изучали при выращивании на минеральной среде Раймонда с 3% NaCl (Плотникова и др., 2006). В качестве единственного источника углерода и энергии использовали фенантрен, нафталин, бифенил и ряд карбоновых кислот: бензойную, гентизиновую, пара-гидроксибензой-ную (ПГБК), 2- и 4-хлорбен-зойные (2ХБК, 4ХБК), ордао-фталевую.

Статистическая обработка результатов

Все эксперименты проводили в трехкратной повторности. Полученные данные обрабатывали с использованием стандартных пакетов компьютерных программ Microsoft Excel.

Результаты и обсуждение

Методом накопительного культивирования из образцов ТМО были выделены шесть штаммов бактерий. Штаммы ЕК-7, ЕК-8, ЕК-9, ЕК-10, ЕК-11 и ЕК-12 при росте на полноценной среде формировали круглые колонии с гладкой, блестящей поверхностью, непрозрачные, светло-бежевые, с гладким краем. Изолированные бактерии - аэробы, клетки неподвижные, не образуют спор, характеризуются выраженной каталазной активностью. Для исследуемых бактерий характерен трехстадийный морфогенетический цикл развития (кокки - палочковидные, нитевидные или ветвящиеся клетки - кокки).

У штаммов ЕК-7, ЕК-8, ЕК-9, ЕК-10 и ЕК-11 определены нуклеотидные последовательности фрагментов гена 16S рРНК длиной 666, 589, 511, 682 и 582 п.н., соответственно, и проведено их сравнение с гомологичными последовательностями, имеющимися в базах данных GenBank/EMBL/DDBJ и на сервере EzTaxon. Выявлена филогенетическая близость штаммов ЕК-7 и ЕК-10 с типовым штаммом Rhodococcus wratisla-vensis NCIMB 13082Т, штаммов ЕК-9, ЕК-11 - с Rhodococcus opacus DSM 43205T, штамма ЕК8 - с Rhodococcus percolatus MBS1T. На данном этапе исследований изолированные бактерии отнесены к роду Rhodococcus.

Изучена способность штаммов к росту моно- и полиароматических углеводородах (табл. 1). Известно, что представители рода Rhodococcus способны разлагать широкий спектр органических

поллютантов, в том числе, ароматические углеводороды и их хлорированные производные (Seto et al., 1995; Martinkova et al., 2008). Изолированные нами штаммы проявляли способность использовать в качестве единственного источника углерода и энергии моно- (бензойная, гентизиновая, орто-фталевая кислоты) и полиароматические (фенан-трен, нафталин, бифенил) углеводороды, а так же

их хлор- и гидроксипроизводные (4ХБК, 2ХБК, ПГБК). Установлено, что штаммы ЕК-7, ЕК-8, ЕК-9, ЕК-10 и ЕК-12 способны расти в жидкой минеральной среде Раймонда (3% №С1) с бифенилом в качестве единственного источника углерода и энергии (рисунок). Рост культур характеризовался непродолжительной подготовительной фазой.

Таблица 1

Рост штаммов рода Rhodococcus на ароматических субстратах

Штамм

Фенан-

трен

Бифе-

нил

Нафта-

лин

Бензоат

Г енти-

зат

о-

фталат

ПГБК

4ХБК

2ХБК

ЕК-7

++

++

++

+++

++

ЕК-8

++

++

++

++++

++

ЕК-9

++

++++

+++

++++

++++

+++

++

ЕК-10

++

+++

++

++

++

ЕК-11

++

+++

++

++

++

ЕК-12

++

++

+

++

++

+

++

«++++» - колонии размером более 0.3 см, «+++» - колонии размером 0.2-0.3 см, «++» - колонии размером 0.10.2 см, «+» - колонии размером менее 0.1 см.

+

+

+

+

+

+

+

+

ОП540

время, ч

Рост штаммов Rhodococcus sp. на бифениле (1г/л) в качестве единственного источника углерода и энергии при 3% NaCl в среде:

1 - ЕК-10; 2 - К-9; 3 - ЕК-12; 4 - ЕК-7; 5 - ЕК-8

Для всех исследуемых штаммов была отмечена значительная оптическая плотность культуры при достижении стационарной фазы роста (ОП540 1.01.2 ед.).

В табл. 2 приведены параметры роста родокок-ков в минеральной среде с бифенилом. Высокая удельная скорость роста штаммов свидетельствует об эффективном использовании бифенила в качестве ростового субстрата.

Физиологические характеристики роста исследуемых штаммов сопоставимы с таковыми параметрами описанного нами ранее штамма-деструктора ПХБ Rhodococcus ruber Р25 (=ИЭГМ 896) (Рыбкина, 2003).

Изучено влияние NaCl на способность изолированных штаммов использовать бифенил в качестве источника углерода и энергии (табл. 3).

Таблица 2 Ростовые характеристики штаммов-деструкторов бифенила

Штамм Удельная скорость роста, ч-1 Время удвоения, ч

ЕК-7 0.069±0.002 10.0±0.1

ЕК-8 0.053±0.002 13.0±0.2

ЕК-9 0.046±0.004 15.0±0.2

ЕК-10 0.064±0.003 10.5±0.1

ЕК-12 0.069±0.005 10.0±0.1

Установлено, что максимальный уровень минерализации, при котором штаммы проявляли свои деструктивные свойства, при культивировании в жидкой среде составил 5%, а на агаризован-ной - 6%. В литературе встречаются лишь единичные сведения по бактериальному разложению бифенила в условиях повышенной минерализации среды. Так известно, что штамм Dyella ginsengisoli LA-4 использовал бифенил как ростовой субстрат при содержании NaCl в среде до 3% и проявлял деструктивные свойства по отношению к данному субстрату при минерализации среды до 10% (Li et al., 2009). Для штаммов рода Rhodococcus способность расти на бифениле в жидкой минеральной среде, в присутствии высоких концентраций хлорида натрия описана впервые. В тоже время, известны факты разложения родококками бензола и нафталина в условиях повышенной осмолярности среды (Luz et al., 1997, Плотникова и др., 2001, 2006).

Следует отметить, что исследуемые штаммы растут в минеральных средах с бифенилом как в присутствии хлорида натрия, так и в его отсутствие. Данные результаты позволяют отнести исследуемые штаммы к галотолерантным микроорга-

низмам, по классификации Кашнера (Кашнер, 1981).

Таблица 3

Рост штаммов рода Rhodococcus на бифениле при различном содержании NaCl в среде

Штамм

Содержание NaCl в агаризованной среде, %

0

3

6

9

Содержание NaCl в жидкой среде, %

0

3

5

6

E^7

++++

++

++++**

E^8

++

E^9

++

E^10

++

E^11

++

E^12

++

+

* «++++» - колонии размером более 0.3 см, «+++» - колонии размером 0.2-0.3 см, «++» - колонии размером 0.10.2 см, «+» - колонии размером менее 0.1 см, «-» - нет роста, ** «++++» - ОП540 > 1.5; «+++» - ОП540 1.0-1.5; «++» -ОП540 0.5-1.0; «+» - ОП540 < 0.5; «-» - нет роста.

*

+

+

+

+

+

Заключение

На современном этапе развития технологий восстановления загрязненных территорий становится очевидным тот факт, что эффективная очистка почв возможно только при использовании в составе биопрепаратов бактериальных штаммов, проявляющих свои деградативные свойства в отношении поллютантов не только в оптимальных, но и в экстремальных условиях.

Выделенные галотолерантные штаммы Rhodococcus sp. ЕК-7, ЕК-8, ЕК-9, ЕК-10, ЕК-11 и ЕК-12 обладают широким спектром деградативной активности в отношении ароматических соединений. Установлено, что исследуемые штаммы используют в качестве ростовых субстратов как моно-, так и полиароматические углеводороды, а также их хлор- и гидроксипроизводные. Особый интерес представляет тот факт, что штаммы утилизируют бифенил в условиях осмотического стресса, вызванного повышенным содержанием хлорида натрия в среде культивирования.

Полученные результаты свидетельствуют о высоком потенциале описанных штаммов для использования в биотехнологиях очистки окружающей среды от ароматических соединений. Будут продолжены исследования по изучению деструктивных свойств изолированных штаммов Rhodo-coccus spp. в отношении полихлорированных бифенилов.

Работа поддержана грантами ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» и Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

Библиографический список

Васильева, Г.К. Биоремедиация почв и седиментов, загрязненных полихлорированными бифенилами / Г.К. Васильева, Е.П. Стрижакова // Микробиология. 2007. Т. 76. №6. С. 725-741. Кашнер, Д. Жизнь микробов в экстремальных условиях / Д. Кашнер. М.: Мир, 1981. 390 с.

Методы общей бактериологии / Под ред. Ф. Гер-хардт [и др.]. М.: Мир, 1983. Т. 1-3.

Методы почвенной микробиологии и биохимии: Учеб. пособие / Под ред. Звягинцева Д. Г. М.: Изд-во МГУ, 1991. 304 с.

Плотникова, Е.Г. Бактерии-деструкторы полицик-лических ароматических углеводородов, выделенные из почв и донных отложений района солеразработок / Е.Г. Плотникова, О.В. Алтын-цева, И.А. Кошелева [и др.] // Микробиология. 2001. Т. 70. С. 61-70.

Плотникова, Е.Г. Характеристика микроорганизмов, выделенных из техногенных почв Прикамья / Е.Г. Плотникова, Д.О. Рыбкина, Л.Н. Ананьина, О.В. [и др.] // Экология. 2006. №4. С. 261-268.

Розанова, Е.П. Уголеводородокисляющие бактерии и их активность в нефтяных пластах / Е.П. Розанова, Т.Н. Назина // Микробиология. 1982. Т. 51. С. 324-348.

Рыбкина, Д.О. Исследование аэробных бактерий, разлагающих полихлорированные бифенилы и хлорбензойные кислоты: Дис... канд. биол. наук: 03.00.07 / Рыбкина Дарья Олеговна. Пермь, 2003. 181 с.

Billingsley, K.A. Studies on the transformation of selected polychlorinated biphenyl congeners by Pseudomonas strain LB400 / K.A. Billingsley, S.M. Backus, O.P. Ward // Can. J. Microbiol. 1997. Vol. 43. P. 782-788.

Kim, S. Microbial growth on dichlorobiphenyls chlorinated on both rings as a sole carbon and energy source / S. Kim, F.W. Picardal // Appl. Environ. Microbiol. 2001. Vol. 64. P. 1953-1955.

Li, A. Characterization of a newly isolated biphenyl-degrading bacterium, Dyella ginsengisoli LA-4 / A. Li, Y. Qu, J. Zhou, F. Ma // Appl. Biochem. Biotechnol. 2009. Vol. 159. P. 687-695.

Luz, M. A Rhodococcus species that thrives on medium saturated with liquid benzene / M. Luz, F. Paje, A. Brett [et al.] // Microbiology. 1997. Vol. 143. P. 2975-2981.

Martinkova, L. Biodegradation potential of the genus Rhodococcus / L. Martinkova, B. Uhnakova, M.

Patek [et al.] // Environ. Int. 2009. Vol. 35. P. 162177.

Pieper, D.H. Aerobic degradation of polychlorinated biphenyls // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005. Vol. 67. P. 170-191.

Seeger, M. Genetics of biphenyl biodegradation and co-metabolism of PCBs / M. Seeger, D.H. Pieper // Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. Springer-Vergal, Berlin, Heidelberg, 2010. 4699 p.

Seto, M. A novel transformation of polychlorinated biphenyls by Rhodococcus sp. strain RHA1 / M. Seto, K. Kimbara, M. Shimura // Appl. Environ. Microbiol. 1995. Vol. 61. P. 3353-3358.

Thompson, J.D. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice / D.G. Higgins,

T.J. Gibson // Nucl. Acids Res. 1994. Vol. 22. P. 4673-4680.

Tiirola, M.A. Isolation and characterization of Novos-phingobium sp. Strain MT1, a dominant polychlo-rophenol-degrading strain in a groundwater bioremediation system / M.A. Tiirola, M.K. Mannisto, J.A. Puhakka, M.S. Kulomaa // Appl. Environ. Microbiol. 2002. Vol. 68. P. 173-180.

Unterman, R. A history of PCB biodegradation // Bioremediation. Principles and Applications / Eds. R.L. Crawford, D.L. Crawford. Cambridge University Press, New York, 1996. P. 209-253.

Van de Peer, Y. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment / Y. van de Peer, R. De Wachter // Comput. Appl. Biosci. 1994. Vol. 10. P. 569-570.

Поступила в редакцию 23.03.2010

New halo tolerant strains of the genus Rhodococcus - degraders of biphenyl

D. O. Egorova, candidate of biology, research scientist

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences, 614081,

Perm, Golev str, 13; [email protected]; (342)2446712

I. O. Korshunova, student

Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990; [email protected]

E. G. Plotnikova, candidate of biology, senior scientist

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences, 614081, Perm, Golev str, 13; [email protected]

Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990; [email protected]

Using a method of enrichment culture, six biphenyl-degrading bacterial strains have been isolated. The analysis of their morphology, physiology and 16S rDNA sequences indicated that these isolates belonged to the genus Rhodococcus. The strains were able to use mono- and polyaromatic hydrocarbons and its chloro- and hydroxyl-derivatives as a sole carbon and energy source. The strains were able to use biphenyl as a sole carbon and energy source in the presence of elevated levels of NaCl in the culture medium.

Key words: saline soils; soil bacteria; analysis of 16S rRNA gene; Rhodococcus', biodestructors; halotoler-ance; biphenyl.

Егорова Дарья Олеговна, кандидат биологических наук, научный сотрудник ГУ РАН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН»

Коршунова Ирина Олеговна, студент

ГОУВПО «Пермский государственный университет»

Плотникова Елена Генриховна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ГУ РАН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН»

ГОУВПО «Пермский государственный университет»