Микробное разнообразие в глинисто-солевых шламах калийного предприятия (г. Березники, Пермский край) Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

2017 БИОЛОГИЯ Вып. 1

УДК 5 79.695:579.262:579.222.2

Е. С. Корсаковаab, Е. А. Шестаковаa, Т. А. Одинцоваc, Б. А. Бачуринc, Е. Г. Плотниковаab

a Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия b Пермский государственный национальный исследовательский университет, Пермь, Россия c Горный институт УрО РАН, Пермь, Россия

МИКРОБНОЕ РАЗНООБРАЗИЕ В ГЛИНИСТО-СОЛЕВЫХ ШЛАМАХ КАЛИЙНОГО ПРЕДПРИЯТИЯ (г. БЕРЕЗНИКИ, ПЕРМСКИЙ КРАЙ)

Из глинисто-солевых шламов предприятия БКПРУ-2 ПАО «Уралкалий» (г. Березники, Пермский край) выделено 138 штаммов бактерий, которые на основании морфологических и генетических особенностей были объединены в 28 морфогеномогрупп. Представители каждой группы были идентифицированы на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, сравнительное исследование которых показало принадлежность штаммов к классам Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria и Actinobacteria. Все обнаруженные бактерии являются галотолерантными, т.к. способны к росту на средах без добавления NaCl и с повышенной концентрацией соли (до 150 г/л). Большинство штаммов росли в щелочных условиях (рН 9.0) и использовали в качестве единственного источника углерода ряд моно- и полиароматических соединений, в том числе полициклические ароматические углеводороды, фталаты.

Ключевые слова: глинисто-солевые шламы; филогенетическое разнообразие; бактерии-деструкторы, ароматические соединения; фталаты.

E. S. Korsakovaa,b, E. A. Shestakovaa, T. A. Odintsovac, B. A. Bachurinc, E. G. Plotnikovaa,b

a Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms of the Ural Branch RAS, Perm, Russian Federation b Perm State University, Perm, Russian Federation c Mining Institute, UB RAS, Perm, Russian Federation

MICROBIAL DIVERSITY IN CLAY-SALT SLUDGE OF THE POTASH ENTERPRISE (BEREZNIKI, PERM KRAI)

From clay-salt sludge of the enterprise Berezniki-2 of OJSC "Uralkali" (Berezniki, Perm Territory) 138 bacterial strains were isolated and basing on morphological and genetic features have been combined in 28 morpho(genomo)groups. Representatives of each group have been identified while analyzing the nucleotide sequences of 16S rRNA gene, and comparative analysis showed that those strains belonged to the classes Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria and Actinobacteria. All the bacteria studied are halotolerant, because they are capable of growing on media without NaCl supplementation and with increased salt concentration (up to 150 g/l). Most strains grew in alkaline conditions (pH 9.0) and utilized several mono- and polyaromatic compounds as a sole source of carbon, including polycyclic aromatic hydrocarbons, phthalates.

Key words: clay-salt sludge; phylogenetic diversity; bacteria-destructors of aromatic compounds; phthalates.

Верхнекамское месторождение калийно-маг-ниевых и натриевых солей (ВМКМС) Пермского края является одним из крупнейших среди разрабатываемых в мире. В результате деятельности калийных комбинатов предприятий ПАО «Уралкалий» (г. Соликамск и Березники, Пермский край) образуются значительные объемы глинисто-солевых шламов и избыточных рассолов, которые хранятся в специальных гидротехнических сооружениях - шламохранилищах. Формирование состава

шламов определяется, в первую очередь, составом добываемого сырья, а также технологическими факторами последующей рудоподготовки и обогащения, что обусловливает присутствие в них, наряду с легкорастворимыми хлоридными минералами, широкого спектра тяжелых металлов и органических соединений [Бачурин, Одинцова, 2009]. Основным источником последних являются используемые технологические химические реагенты и продукты их трансформации, главными вещест-

© Корсакова Е. С., Шестакова Е. А., Одинцова Т. А., Бачурин Б. А., Плотникова Е. Г., 2017

70

вами преобразования которых являются полиэток-сильные соединения (полигликоли, полиоксиалка-нолы и их эфиры, диоксоланы, диоксаны и др.), гетероциклы, углеводородные структуры, включая полициклическую ароматику и фталаты [Бачурин, 2008; Бачурин, Одинцова, Первова, 2014].

По результатам эколого-геохимических исследований было обнаружено, что аккумулированные в глинисто-солевых шламах органические поллютанты служат мощными источниками загрязнения природных экосистем благодаря их высокой геохимической подвижности и могут рассматриваться как потенциальные вторичные источники контаминации гидросферы - высвобождение их из связанного состояния может происходить при выщелачивании отходов атмосферными осадками [Бачурин, Одинцова, 2006; Бачурин, 2012; Бачурин, Сметанников, Хохрякова, 2014]. В связи с этим при такой комплексной нагрузке абиотических факторов на территории шламохра-нилищ возникают условия для формирования уникальных сообществ галофильных и галотолерантных микроорганизмов, в том числе способных разлагать экотоксиканты.

Ранее из шламов района солеразработок ВМКМС были выделены и охарактеризованы бак-

терии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов и фталатов родов Rhodococ-cus, Pseudomonas, Arthrobacter, Bacillus [Плотникова и др., 2001, 2011; Ястребова и др., 2009; Пастухова и др., 2010; Корсакова, Пьянкова, Плотникова, 2013; Кандаурова, Ястребова, Плотникова, 2016]. Описаны новые таксоны архей и прокариот, выделенные из продуктов флотационного обогащения калийных минералов и техногенных вод шламохранилища ПАО «Уралкалий» [Реутских, Саралов, 2012; Саралов и др., 2012а, 20126; Saralov et al., 2013].

Цель настоящей работы - изучение бактериального сообщества глинисто-солевых шламов калийного предприятия БКПРУ-2 ПАО «Уралкалий» в г. Березники (Пермский край).

Материалы и методы исследования

Образцы шламов. В качестве материала для исследования были выбраны пять образцов, отобранных из шламохранилища калийного предприятия БКПРУ-2 ПАО «Уралкалий» (г. Березники) (табл. 1).

Таблица 1

Характеристика образцов глинисто-солевых шламов

№ образца шлама Регистрационный № Точка отбора, глубина отбора Минерализация, мг/кг ХБА*, мг/кг НП**, мг/кг

1 219/1 Шлам из шурфа № 1, 0.3 м 26400 902.5 312.5

2 220/2 Шлам из шурфа № 1, 0.5 м 26400 817.5 265.0

3 221/3 Шлам из шурфа № 2, 0.2 м 22650 932.5 340.0

4 222/4 Шлам из шурфа № 3, 0.2 м 35800 1111.0 349.0

5 222/5 Шлам из шурфа № 3, 0.4 м 43000 н.о.*** н.о.

породы органическим растворителем - хлороформом, без предварительной обработки соляной кислотой); НП -нефтепродукты; н.о. - не определяли [Бачурин, Одинцова, 2009].

Для выделения и роста микроорганизмов

была использована минеральная среда Раймонда (МСР) (Raymond, 1961) с добавлением NaCl (50 г/л). Агаризованные среды получали при добавлении агара («Sigma», США) в концентрации 15 г/л. Для приготовления богатой среды Раймонда (БСР) в МСР добавляли 5 г/л триптона («Fluka», США) и 2.5 г/л дрожжевого экстракта («Difco», США) в качестве ростовых субстратов.

Микробиологический анализ образцов шламов проводили общепринятыми методами посева почвенной суспензии на агаризованную БСР с последующим подсчетом колоний микроорганизмов (колониеобра-зующих единиц, КОЕ) и выделением бактерий из единичных колоний для идентификации [Методы ..., 1991]. Биоразнообразие и плотность видов бактерий-деструкторов оценивали с помощью индексов Шен-нона-Уивера, Симпсона и Менхиника, используя дифференцированный подсчет колоний, принадле-

жащих к разным морфо(геномо)типам [Широких и др., 2013; Орлова, 2013].

Способность бактерий разлагать ароматические углеводороды оценивали путем культивирования на агаризованной МСР (30 г/л №С1) при 28°С с добавлением моно(поли)ароматических углеводородов (<^1ика», США) в качестве единственного источника углерода и энергии. Нафталин, бифенил, бензол, толуол, фенол и дибутилфталат помещали на крышку перевернутой чашки Петри; орто-фталевую кислоту (о-ФК), бензойную (БК), пара-гидроксибензойную кислоты (ПГБК) вносили в среду до конечной концентрации 1 г/л, салициловую кислоту - до 0.5 г/л. Рост колоний бактерий на агаризованных средах с углеводородами оценивали по сравнению с ростом на агаризованных средах того же состава без субстратов (контрольный вариант). Колонии диаметром менее 1 мм оценивали как «+», 1-2 мм - «++», более 3 мм - «+++».

Рост микроорганизмов при изменении осмо-лярности среды. Изучение устойчивости микроорганизмов к NaCl (0-200 г/л) проводили на ага-ризованной среде БСР, оценивая размер выросших колоний.

Рост при разных значениях рН определяли при концентрации Na+ 0.8-0.85 М в буферных системах, приготовленных на основе БСР. Штаммы культивировались на чашках Петри на агаризо-ванной среде при рН 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0. Рост учитывали на седьмой день культивирования [Герхардт и др., 1983].

Рост при разных температурах. Штаммы культивировали на агаризованной БСР (30 г/л NaCl) при 10, 20, 28, 37 и 45°С. Рост учитывали на седьмой день культивирования.

ДНК-типирование полученных бактериальных изолятов проводили методом ВОХ-ПЦР (по-лимеразная цепная реакция повторяющихся BOX-элементов) с использованием праймера BOXA1R (5' -CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3') в соответствии с методикой [Versalovic et al., 1994]. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 1.5%-ном агарозном геле на 1 х ТВЕ буфере (89 мМ Трис-HCl, 89 мМ борная кислота, 2,5 мМ ЭДТА, рН 8.2) в течение 2 ч. при напряжённости электрического поля 5.7 V/см и анализировали полученные фрагменты.

Филогенетический анализ полученных изо-лятов был основан на определении нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК с применением набора реактивов Big Dye Terminator Cycle Se-

M

quencing Kit на автоматическом секвенаторе Genetic Analyser 35OOXL («Applied Biosystems», США) в Пермском государственном национальном исследовательском университете (кафедра ботаники и генетики растений). Полученные нуклеотид-ные последовательности были проанализированы с использованием программ CLUSTAL W, Sequence Scanner v. 2.O, Mega v. V.O. Поиск гомологичных последовательностей проводили по базам данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и EzTaxon (http://www. ezbiocloud.net).

Результаты и их обсуждение

Mетодом прямого высева на агаризованную БСТ с содержанием 5O г/л NaCl из образцов шла-мов было выделено l38 штаммов бактерий. Oтбор осуществлялся на основе различий в морфологии колоний микроорганизмов, растущих на агаризо-ванной среде. B результате были сформированы 34 морфологические группы, представители которых были взяты для проведения дальнейших исследований.

Проведена сравнительная характеристика представителей наиболее сходных морфогрупп с применением метода BOX-QUP. Анализ полученных BOX-QUP профилей фрагментов геномной ДНК исследуемых бактерий показал, что 22 штамма, близких по морфологическим признакам, принадлежат к l6 геномогруппам (рис. l). Согласно полученным результатам, выделенные штаммы бактерий были объединены в 28 морфогеномогрупп, далее обозначенных как репрезентативные операционные таксономические единицы (OTE).

M l2 13 l4 l5 l6 lV lS l9 2O M 2l 22

I II III II I IV I V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV XV XIII XVI Рис. 1. Электрофореграмма продуктов ВОХ-ПЦР штаммов бактерий, изолированных из образцов

шламов:

М - маркер O'GeneRuler™ 100 bp Plus DNA Ladder («Fermentas», Литва), 1 - В010; 2 - ВО11; 3 - ВО14; 4 -В022; 5 - В026; 6 - В036; 7 - В023; 8 - В08; 9 - В019; 10 - В034-1; 11 - В025; 12 - В09; 13 - В020; 14 -В035; 15 - В013; 16 - В027; 17 - В028; 18 - В029; 19 - В030; 20 - В031; 21 - В01; 22 - Rhodococcus sp. КТ723 (штамм-деструктор нафталина из рабочей коллекции Лаборатории молекулярной микробиологии и

биотехнологии ИЭГМ Ур0 РАН)

Была проведена статистическая оценка альфа-разнообразия представленных микробных сообществ с использованием индесов Шеннона-Уивера (придает б0льшее значение уникальным ОТЕ) и Симпсона (общим ОТЕ), показавшая примерно равные показатели биоразнообразия и выравнен-ности сообществ в исследуемых пробах. Однако, согласно проведенному анализу, образец шлама № 5 характеризуется гораздо б0льшим биоразнообразием уникальных ОТЕ по индексу Шеннона-Уивера (№ = 1.316) и меньшим значением общих ОТЕ (D=0.319) при сравнении с пробами № 1-4. Большое количество морфогеномогрупп, низкая численность изолированных бактерий и высокий уровнь минерализации (43000 мг/кг) данной пробы могут быть непосредственно связаны с присутст-

вием галотолерантных и галофильных форм микроорганизмов (табл. 1). Расчет плотности видов (видового богатства) в сообществе по индексу Менхиника фмп) показал, что наибольшее значение данного параметра выявлено в образце шлама № 2, в котором, в свою очередь, была обнаружена высокая численность бактерий (7.84 х105) и малое количество представленных морфотипов (табл. 2). Вероятно, что такие особенности связаны с параметрами данной пробы, а именно с отбором с глубины 0.5 м, на котором воздействие неблагоприятных биотических факторов снижается (в том числе вымывание бактерий из образца шлама атмосферными осадками), что обусловливает высокую численность обнаруженных бактерий.

Таблица 2

Анализ разнообразия микробных сообществ образцов шламов

Номер образца Количество ОТЕ Общая численность бактерий, КОЕ/1 г шлама Индекс Менхиника (DMn) Индекс Шенно-на-Уивера (H) Индекс Симпсона (D)

1 13 6.35*106 0.005 0.839 0.463

2 10 7.84*105 0.011 1.077 0.469

3 15 7.35*106 0.006 1.047 0.475

4 13 2.72*106 0.008 0.996 0.482

5 14 2.27*106 0.009 1.316 0.319

В результате сравнения последовательностей гена 16S рРНК (у 28 изолятов, представителей каждой морфогеномогруппы) с типовыми видами из базы данных EzTaxon (http://www.ezbiocloud.net) установлено, что 7 культур являются представителями класса Bacilli, 8 штаммов относятся к классу

Gammaproteobacteria, 11 штаммов - к классу nobacteria и 2 штамма - к классу Alphaproteobac-teria. Уровень сходства 16S рДНК изолятов с типовыми штаммами узаконенных видов находился в пределах 98.1-100% (табл. 3).

Таблица 3

Анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изолированных бактерий

№ штамма Типовой штамм № GenBank Сходство, % Количество нуклеотидов

ВО1 Rhodococcus wratislaviensis NCIMB 13082T Z37138 99.9 800

ВО2 Rhodococcus fascians DSM 20669T X79186 100 819

ВО3 Bacillus pumilus ATCC 7061T ABRX01000007 99.9 1426

ВО4 Bacillus firmus NCIMB 9366T X60616 99.3 908

ВО5 Bacillus thuringiensis ATCC 10792T ACNF01000156 100 915

ВО6 Bacillus safensis FO-036bT AF234854 99.9 935

ВО8 Pseudomonas xanthomarina KMM 1447T AB176954 98.7 1401

ВО9 Dietzia maris DSM 43672T X79290 99.8 904

ВО11 Pseudomonas xanthomarina KMM 1447T AB176954 99.0 1434

ВО13 Stenotrophomonas maltophilia ATCC 13637T AB008509 100 930

ВО18 Bacillus safensis FO-036bT AF234854 100 923

ВО19 Arthrobacter oxydans DSM 20119T X83408 100 1233

В020 Dietzia maris DSM 43672T X79290 99.9 887

ВО21 Arthrobacter oxydans DSM 20119T X83408 99.2 1388

ВО22 Pseudomonas xanthomarina KMM 1447T AB176954 99.0 1438

ВО23 Pseudomonas xanthomarina KMM 1447T AB176954 99.2 1404

ВО24 Pseudomonas xanthomarina KMM 1447T AB176954 99.2 1421

ВО25 Arthrobacter nicotianae DSM 20123T X80739 99.1 1387

ВО27 Stenotrophomonas maltophilia ATCC 13637T AB008509 99.2 769

ВО28 Paracoccus beibuensis JLT1284T EU650196 98.1 1330

В030 Paracoccus beibuensis JLT1284T EU650196 98.2 1330

ВО32 Pseudomonas monteilii CIP 104883T AF064458 99.5 927

ВО33 Bacillus vietnamensis 15-1T AB099708 99.0 604

Окончание табл. 3

№ штамма Типовой штамм № GenBank Сходство, % Количество нуклеотидов

ВО34-1 Arthrobacter oxydans DSM 20119 T X83408 100 1401

ВО35 Kocuria rosea DSM 20447 T X87756 99.7 972

ВО37 Micrococcus luteus NCTC 2665T CP001628 100 414

ВО38 Streptomyces somaliensis NBRC 12916T AB184243 100 1392

ВО141 Bacillus flexus IFO 15715T AB021185 100 722

В результате изучения биодеградационных свойств 28 штаммов (представителей сформированных ОТЕ) было выявлено семь наиболее активных штаммов-деструкторов (Arthrobacter spp. ВО19, ВО25, Bacillus spp. ВО4, ВО33, Kocuria sp. ВО35, Paracoccus sp. ВО28 и Rhodococcus sp. ВО1), обладающих широкой субстратной специфичностью и способных использовать в качестве единственного источника углерода и энергии такие соединения, как нафталин, бифенил, орто-фталевую, бензойную, пара-гидроксибензойную, салициловую кислоты, а также фенол, толуол и бензол. Стоит отметить, что большинство штаммов росли на моно- и полиароматических соединениях, но были также обнаружены бактерии (штаммы Rhodococcus sp. ВО1, Dietzia sp. ВО9, Arthrobacter spp. ВО25, ВО34-1, Bacillus sp. ВО33), использующие в качестве субстрата широко используемое в химической промышленности, труднораз-лагаемое и токсичное соединение - дибутилфталат (табл. 4).

Кроме того, было установлено, что все изолированные бактериальные культуры способны к росту на агаризованной среде как без добавления NaCl, так и с повышенной концентрацией соли (30-150 г/л), т.е. являются галотолерантными организмами [Кашнер, 1981]. Среди них присутствуют штаммы, обладающие способностью к росту при особенно высоких концентрациях хлорида натрия - до 150 г/л, а именно спорообразующие бактерии рода Bacillus (табл. 5).

Таблица 4

Рост бактерий на ароматических углеводородах на агаризованной МСР

Штамм Субстрат

Фен. Бен. Тол. Наф. Биф. о-ФК БК СК ПГБК ДБФ

Rhodococcus sp. ВО1 +++ ++ + +++ ++ +++ + ++ +++ ++

Rhodococcus sp. ВО2 - +++ ++ ++ ++ ++ + ++ +++ +

Bacillus sp. ВО3 + + + + + ++ + + + +

Bacillus sp. ВО4 +++ ++ ++ +++ +++ +++ ++ +++ ++ -

Bacillus sp. ВО5 + + - + + + - - - -

Bacillus sp. ВО6 ++ + + + + ++ + + - -

Pseudomonas sp. ВО8 + ++ - + + + + + + -

Dietzia sp. ВО9 - + ++ + + +++ +++ + - ++

Pseudomonas sp. ВО11 ++ ++ + ++ ++ +++ +++ ++ - -

Stenotrophomonas sp. ВО13 ++ + - ++ ++ ++ + ++ - -

Bacillus sp. ВО18 + + + ++ ++ ++ + + - -

Arthrobacter sp. ВО19 ++ + + ++ + +++ ++ ++ ++ -

Dietzia sp. B020 ++ ++ + + + - +++ ++ - +

Arthrobacter sp. ВО21 ++ ++ + + ++ + +++ ++ ++ -

Согласно полученным результатам, преимущественным значением среди выделенных бактериальных штаммов обладали представители классов Actinobacteria и Gammaproteobacteria, а именно -бактерии родов Dietzia (31.77%) и Stenotrophomo-nas (46.11%), соответственно (рис. 2). Что характерно, наибольшим многообразием таксономических групп характеризовались микроорганизмы класса Actinobacteria, среди которых доминирующее положение занимали изоляты, филогенетически близкородственные к бактериям рода Dietzia. Менее многочисленными были бактерии родов Arthrobacter, Kocuria, Micrococcus, Rhodococcus и Streptomyces (в порядке уменьшения количества КОЕ/1 г шлама).

46,11%

0,02% 1,90% 0,01% 0,01%

5'420,02% 9'73%

Е Rhodococcus sp. в Bacillus sp.

* SlenotropliomoiMS sp.

■ Dietzia sp. Artlirobacler sp. Pseudomonas sp.

■ Paracoccus sp.

• Micrococcus sp. ¡s Streptomyces sp. & Kocuria sp.

Рис. 2. Относительное содержание различных филогенетических групп (родов) бактерий классов Actinobacteria,_Alphaproteobacteria, Bacilli и Gammaproteobacteria

Окончание табл. 4

Штамм Субстрат

Фен. Бен. Тол. Наф. Биф. о-ФК БК СК ПГБК ДБФ

Pseudomonas sp. ВО22 ++ ++ - + ++ ++ + ++ + -

Pseudomonas sp. ВО23 + ++ - ++ ++ - +++ + + -

Pseudomonas sp. ВО24 + ++ - ++ + - +++ ++ + -

Arthrobacter sp. ВО25 +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ ++ +++ +++

Stenotrophomonas sp. ВО27 ++ ++ + + + + + + + -

Paracoccus sp. ВО28 +++ +++ + ++ ++ ++ +++ +++ + +

Paracoccus sp. ВОЗО + + + + + + - + + -

Pseudomonas sp. ВО32 ++ ++ - ++ ++ + + + +++ -

Bacillus sp. ВО33 ++ +++ + + + ++ + + + +++

Arthrobacter sp. ВО34-1 - + - + ++ ++ + + +++ +++

Kocuria sp. ВО35 +++ ++ ++ ++ ++ ++ + + + -

Micrococcus sp. ВО37 +++ + - ++ ++ ++ + + + -

Streptomyces sp. ВО38 +++ + - ++ ++ ++ +++ ++ ++ -

Bacillus sp. ВО141 ++ - - ++ +++ +++ ++ ++ ++ -

Примечание. Фен. фталевая кислота; БК ■ ДБФ - дибутилфталат.

- фенол; Бен. - бензол; Тол. - толуол; Наф. - нафталин; Биф. - бифенил; о-ФК - орто-бензойная кислота; СК - салициловая кислота; ПГБК - пара-гидроксибензойная кислота;

Таблица 5

Рост бактерий в присутствии различных концентраций NaCl

Концентрация NaCl (г/л), среда БСР

Штамм Без NaCl 30 50 60 70 80 90 100 120 150

Rhodococcus sp. ВО1 +++ +++ +++ +++ +++ ++ ++ + - -

Rhodococcus sp. ВО2 ++ +++ + + - - - - - -

Bacillus sp. ВО3 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +

Bacillus sp. ВО4 +++ +++ +++ +++ ++ ++ + ++ + -

Bacillus sp. ВО5 +++ +++ +++ +++ + - - - - -

Bacillus sp. ВО6 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ +

Pseudomonas sp. ВО8 +++ +++ ++ + + + + - - -

Dietzia sp. ВО9 + +++ ++ ++ +++ + + - - -

Pseudomonas sp. ВО11 +++ +++ +++ +++ ++ ++ + + - -

Stenotrophomonas sp. ВО13 +++ +++ +++ + + + + - - -

Bacillus sp. ВО18 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +

Arthrobacter sp. ВО19 +++ +++ ++ + + + + - - -

Dietzia sp. ВО20 + +++ ++ ++ + + + - - -

Arthrobacter sp. ВО21 +++ +++ ++ + - - - - - -

Pseudomonas sp. ВО22 ++ +++ ++ ++ + + + - - -

Pseudomonas sp. ВО23 ++ +++ ++ ++ ++ ++ + + - -

Pseudomonas sp. ВО24 ++ +++ ++ ++ ++ ++ + + - -

Arthrobacter sp. ВО25 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ -

Stenotrophomonas sp. ВО27 +++ +++ + - - - - - - -

Paracoccus sp. ВО28 +++ +++ ++ ++ ++ + + - - -

Paracoccus sp. ВОЗО +++ +++ + + - - - - - -

Pseudomonas sp. ВО32 +++ +++ ++ + - - - - - -

Bacillus sp. ВО33 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +

Arthrobacter sp. ВО34-1 +++ +++ ++ + - - - - - -

Kocuria sp. ВО35 +++ +++ +++ +++ +++ ++ + + - -

Micrococcus sp. ВО37 +++ +++ +++ +++ +++ ++ + + + -

Streptomyces sp. ВО38 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ -

Bacillus sp. ВО141 +++ +++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ -

Примечание. «+» - слабый рост, «++» - средний рост, «+++» - хороший рост, «-» - отсутствие роста бактерий.

Также был исследован диапозон роста бактерий при различных значениях рН в среде культивирования и при различной температуре. Установлено, что значительная часть изолятов (Bacillus spp.

ВО3, ВО4, ВО5, ВО18, Rhodococcus sp. ВО2, Arthrobacter sp. ВО25, Pseudomonas sp. ВО32) способна к эффективному росту при рН среды от 6,0 до 9,0. Штамм Rhodococcus sp. ВО1 характеризо-

вался ростом в более широком диапазоне значений рН среды (от 5,0 до 9,0).

У ряда исследуемых штаммов (Bacillus spp. ВО3, ВО18, ВО141, Pseudomonas spp. ВО11, ВО14, ВО26, Paracoccus sp. B030 и Kocuria sp. ВО35) была отмечена способность к росту в диапазоне температур от +10°С до 45°С (с оптимумом роста 28°С), относящая их к термотолерантным микроорганизмам. При температуре ниже 10°С рост культуры не наблюдался или был незначительным.

Интересен тот факт, что среди изолированных бактерий встречаются штаммы, сходные по филогенетическому положению с одним и тем же типовым штаммом бактерий, но отличающиеся по ВОХ-ПЦР профилям фрагментов геномной ДНК, субстратной специфичности, а также способности к росту на средах с различными значениями pH и концентрации NaCl. Так, например, выявлено 5 штаммов (ВО8, ВО11, ВО22, ВО23, ВО24), которые имеют наибольший процент сходства по нук-леотидной последовательности гена 16S рРНК с типовым видом Pseudomonas xanthomarina KMM 1447T, но при этом существенно различаются по утилизации ароматических соединений (табл. 4), а штамм Pseudomonas sp. ВО11 может эффективно использовать в качестве единственного источника углерода орто-фталевую кислоту.

Заключение

В результате исследования микробного сообщества образцов глинисто-солевых шламов из шла-мохранилища БКПРУ-2 ПАО «Уралкалий» (г. Березники, Пермский край) получены новые данные по филогенетическому разнообразию культивируемых бактерий района Верхнекамского месторождения солей. Выделено 138 штаммов бактерий-деструкторов различных ароматических углеводородов, в том числе фталатов. Филогенетический анализ показал принадлежность изолированных штаммов к трем классам: Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria и Actinobacteria; десяти родам: Arthrobacter, Bacillus, Dietzia, Kocuria, Micrococcus, Paracoccus, Pseudomonas, Rhodococcus, Stenotrophomonas и Streptomyces. При изучении их биодеградационных свойств выявлено семь наиболее активных штаммов-деструкторов, способных использовать в качестве ростового субстрата различные углеводороды: нафталин, бифенил, фенол, толуол и бензол, бензойную, пара-гидроксибензойную, салициловую кислоты, а также фталаты (орто-фталат, дибутил-фталат). Кроме того, показано, что все изоляты являются галотолерантами (растут в присутствии 100-150 г/л NaCl), а ряд из них - алкалафилами (растут в диапазоне значений рН до 9.0).

Таким образом, установлено, что в районах шламохранилищ сформированы уникальные мик-

робные сообщества, в состав которых входят соле-устойчивые бактерии-деструкторы ароматических соединений, являющихся одними из характерных экотоксикантов отходов калийного производства. Выявленные активные галотолерантные бактерии-деструкторы фталатов, моно(поли)ароматических углеводородов перспективны для дальнейшего изучения и использования при создании новых биотехнологий ремедиации территорий с высокой минерализацией и контаминацией стойкими органическими загрязнителями.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 1644-590968 р_а и Программами УрО РАН «Молекулярная и клеточная биология» (проект №15-4-413) и «Фундаментальный базис инновационных технологий оценки, добычи и глубокой комплексной переработки стратегического минерального сырья» (проект №15-11-5-24).

Библиографический список

Бачурин Б.А. Эколого-геохимическая характеристика отходов калийного производства // Горный журнал. 2008. Т. 10. С. 88-91. Бачурин Б.А. Эколого-геохимические аспекты выщелачивания техногенно-минеральных образований горного производства // Материалы Всероссийской конференции с участием иностранных ученых «Геологическая эволюция взаимодействия воды с горными породами». 2012. С. 199-202.

Бачурин Б.А., Одинцова Т.А. Органическая геохимия техногенеза горнопромышленного профиля // Минералогия техногенеза. 2006. Т. 7. С. 265284.

Бачурин Б.А., Одинцова Т.А. Отходы горнообогатительного производства как источники эмиссии органических поллютантов // Горный информационно-аналитический бюллетень. 2009. Вып. 7. С. 374-380. Бачурин Б.А., Одинцова Т.А., Первова Е.С. Эколо-го-геохимическая характеристика флотореаген-тов // Материалы II-й Всероссийской научной виртуальной онлайн-конференции «Химическая наука: современные достижения и историческая перспектива». 2014. С. 17-22. Бачурин Б.А., Сметанников А.Ф., Хохрякова Е.С. Эколого-геохимическая оценка продуктов переработки глинисто-солевых шламов калийного производства // Современные проблемы науки и образования. 2014. № 6. С. 1-8. Герхардт Ф. и др. Методы общей бактериологии. М.:

Мир. 1983. Т. 1-3. Кандаурова Ю.М., Ястребова О.В., Плотникова Е.Г. Бактерии-деструкторы орто-фталевой кислоты, выделенные из района добычи и перера-

ботки калийных солей (г. Березники, Пермский край) // Материалы XIV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биодиагностика состояния природных и природно-техногенных систем». Киров, 2016. С. 329-332.

Кашнер Д. Жизнь микробов в экстремальных условиях. М.: Мир. 1981. 365 с.

Корсакова Е.С., Пьянкова А.А., Плотникова Е.Г. Бактерии-деструкторы стойких органических загрязнителей - эфиров фталевой кислоты, как основа для создания новых экобиотехнологий // Известия Самарского научного центра РАН. 2013. Т. 15, № 3 (5). С. 1633-1636.

Методы почвенной микробиологии и биохимии: учеб. пособие / под ред. Д.Г. Звягинцева. М.: Изд-во МГУ, 1991. 304 с.

Орлова Ю.С. Использование индексов биологического разнообразия для анализа альгофлоры бассейна р. Алатырь // Вестник Мордовского университета. 2013. Т. 3/4. С. 53-57.

Пастухова Е. С. и др. Бактерии-деструкторы орто-фталевой кислоты, выделенные из отходов калийного производства // Вестник Пермского университета. Сер. Биология. 2010. Вып. 3. С. 24-29.

Плотникова Е.Г. и др. Бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов, выделенные из почв и донных отложений района солеразработок // Микробиология. 2001. Т. 70, № 1. С. 61-69.

Плотникова Е.Г. и др. Галотолерантные бактерии рода Arthrobacter - деструкторы полициклических ароматических углеводородов // Экология. 2011. № 6. С. 459-466.

Реутских Е.М. Саралов А.И. Exiguobacterium sp. RS34 - галоалкалотолерантная факультативно анаэробная неспорообразующая бактерия порядка Bacillales из шламохранилища калийного рудника // Вестник Пермского университета. Сер. Биология. 2012. Вып. 3. С. 49-53.

Саралов А.И. и др. Arhodomonas recens sp. nov. -умеренно галофильная гаммапротеобактерия из рассолов флотационного обогащения калийных минералов // Микробиология. 2012а. Т. 81, № 5. C. 630-637.

Саралов А.И. и др. Halarchaeum solikamskense sp. nov. - термо-толерантный нейтрофильный га-лоархаеон из пенных продуктов флотационного обогащения калийных минералов // Микробиология. 2012б. Т.81, № 5. C. 638-644.

Широких И.Г и др. Численность и структура комплексов почвенных актиномицетов в районе возможного влияния химически опасного объекта // Почвоведение. 2013. Т. 7. С. 860-866.

Ястребова О.В. и др. Разнообразие бактерий, выделенных из района разработок месторождения

калийных солей Верхнекамья // Вестник Пермского университета. 2009. Вып. 10 (36). Биология. С. 124-129.

Raymond R.L. Microbial oxidation of n-paraffinichydrocarbons.// Developments in Industrial Microbiology. 1961. Vol. 2, № 1. P. 23-32.

Saralov A.I. et al. Haloferax chudinovii sp. nov., a halophilic archaeon from Permian potassium salt deposits // Extremophiles. 2013. Vol. 17(3). P. 499-504.

Versalovic J. et al. Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction // Methods in Molecular and Cellular Biology. 1994. Vol. 5(1). P. 25-40.

References

Bachurin B.A. [Ecological and geochemical characteristics of the potash production wastes]. Gornyj zurnal, V. 10 (2008): pp. 88-91. (In Russ.).

Bachurin B.A. [Ecological and geochemical aspects of leaching technogenic mineral formations mining production]. Materialy Vserossijskoj konfer-encii "Geologiceskaja ёvoljucija vzaimodejstvija vody s gornymi porodami" [Materials of all-Russian conference with participation of foreign scientists "The geological evolution of the interaction of water with rocks"]. 2012, pp. 199-202. (In Russ.).

Bachurin B.A., Odintsova T.A. [Organic Geochemistry of mining technogenesis profile]. Mineralogija technogenesa, V. 7 (2006): pp. 265-284. (In Russ.).

Bachurin B.A., Odintsova T.A. [Wastes from mining and processing industry as sources of emission of organic pollutants]. Gornyj informacionno-analiticeskij bjulleten', Iss. 7 (2009): pp. 374-380. (In Russ.).

Bachurin B.A., Odintsova T.A., Pervova E.S. [Ecological and geochemical characteristics of flotation agents]. Chimiceskaja nauka: sovremennye dostizenija i istoriceskaja perspektiva [Materials of the II-nd All-Russian scientific virtual online conference " Chemistry: advancements and historical perspective"]. 2014, pp. 17-22. (In Russ.).

Bachurin B.A., Smetannikov A.F., Khokhryakova E.S. [Ecological and geochemical evaluation of clay-salt slurries of potash ore production]. Sovremennye problemy nauki i obrazovanija, N 6 (2014): pp. 1-8. (In Russ.).

Gerhardt F. Metody obscej bakteriologii [Methods of General bacteriology]. Moscow, Mir Publ., 1983. V. 1-3. (In Russ.).

Kandaurova Yu.M., Yastrebova O.V., Plotnikova E.G. [The bacteria-destructors of ortho-phthalic acid, isolated from the area of extraction and processing of potassium salts. Berezniki, Perm region]. Biodiagnostika sostojanija prirodnych i prirodno-technogennych sistem [Materials of XIV All-Russian scientific-practical conference with

international participation "Biodiagnostics of natural and man-made-technogenic systems"]. Kirov, 2016, pp. 329-332. (In Russ.).

Korsakova E.S., Pyankova A.A., Plotnikova E.G. [Bacteria-destructors of persistent organic pollutants - phthalic acid esters, as a basis for the creation of new ecobiotechnology]. Izvestija Samar-skogo naucnogo centra RAN, V. 15, N 3(5) (2013): pp. 1633-1636. (In Russ.).

Kushner, D.J. Zizn' mikrobov v ekstremal'nych us-lovijach [Microbial Life in Extreme Environments]. Moscow, Mir Publ., 1981. 365 p. (In Russ.).

Orlova Yu.S. [The use of indices of biological diversity for analysis of algal flora of the Alatyr river basin] Vestnik Mordovskogo universiteta, V. 3/4 (2013): pp. 53-57. (In Russ.).

Pastukhova E.S., Egorova D.O., Yastrebova O.V., Plotnikova E.G. [Bacteria-destructors of ortho-phthalic acid isolated from the potassium production wastes]. Vestnik Permskogo universiteta. Ser. Biologija, Iss. 3 (2010): pp. 24-29. (In Russ.).

Plotnikova E.G., Altyntseva O.V., Kosheleva I.A., Puntus I.F., Filonov A.E., Gavrish E.U., Demakov V.A., Boronin A.M. [Bacteria Decomposing Poly-cyclic Aromatic Hydrocarbons Isolated from Soil and Bottom Sediments in the Region of Salt Mines]. Mikrobiologija, V. 70, N 1 (2001): pp. 61-69. (In Russ.).

Plotnikova E.G., Yastrebova O.V., Anan'ina L.N., Dorofeeva L.V., Lysanskaya V.Ya., Demakov V.A [Halotolerant bacteria of the genus Arthrobacter degrading polycyclic aromatic hydrocarbons]. Ecologija, N 6 (2011): pp. 502-509. (In Russ.).

Raymond R.L. Microbial oxidation of n-paraffinichydrocarbons. Developments in Industrial Microbiology, V. 2, N 1 (1961): pp. 23-32.

Reutskikh E.M., Saralov A.I. [Exiguobacterium sp. RS34 - haloalkalitolerant facultatively anaerobic non-sporulating bacterium of Bacillales order isolated from sludge warehouse of potash mining].

Vestnik Permskogo universiteta. Ser. Biologija, Iss. 3 (2012): pp. 49-53. (In Russ.).

Saralov A.I., Reutskikh E.M., Kuznetsov B.B., Ba-slerov R.V., Panteleeva A.N., Suzina N.E. [Ar-hodomonas recens sp. nov., a halophilic alkane-utilizing hydrogen-oxidizing bacterium from the brines of flotation enrichment of potassium minerals]. Mikrobiologiya, V. 81, N 5 (2012): pp. 582-588. (In Russ.).

Saralov A.I., Reutskikh E.M., Baslerov R.V., Kuznetsov B.B. [Halarchaeum solikamskense sp. nov., a thermotolerant neutrophilic haloarchaeon from the foamy products of flotation enrichment of potassium minerals]. Mikrobiologiya, V. 81, N 5

(2012): pp. 589-595. (In Russ.).

Saralov A.I., Baslerov R.V., Kuznetsov B.B. Haloferax chudinovii sp. nov., a halophilic ar-chaeon from Permian potassium salt deposits. Ex-tremophiles, V. 17 (3) (2013): pp. 499-504.

Shirokikh I.G., Tovstik E.V., Dabagh E.V., Ashikhmina T.Y. [The size and structure of the complexes of soil actinomycetes in the area of possible influence of a chemical dangerous object]. Pocvovedenie, V. 7

(2013): pp. 860-866. (In Russ.).

Versalovic J. et al. Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction // Methods in Molecular and Cellular Biology. 1994. V. 5(1). P.25-40.

Yastrebova O.V., Ananyina L.N, Pastukhova (Korsakova) E.S., Plotnikova E.G. [The study of bacteria, isolated from the salt mining of Upper-Kama potassiummagnesium salt deposit]. Vestnik Perm-skogo universiteta, Iss. 10 (Biology) (2009): pp. 124-129. (In Russ.).

Zvyagintsev D.G.. ed. Metody pocvennoj mikrobi-ologii i biochimii [Methods of Soil Microbiology and Biochemistry: Textbook]. Moscow: Moscow State University Publ., 1991. 304 p. (In Russ.).

Поступила в редакцию 26.12.2016

Об авторах

Корсакова Екатерина Сергеевна, кандидат биологических наук, младший научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН ORCID: 0000-0002-6907-7562 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13; [email protected]; (342)2808431 доцент кафедры ботаники и генетики растений ФГБОУВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» 614990, Пермь, ул. Букирева, 15

About the authors

Korsakova Ekaterina Sergeyevna, candidate of biology, junior researcher of laboratory of molecular microbiology and biotechnology Institute of Ecology and Genetics of Microorganism UB RAS ORCID: 0000-0002-6907-7562 13, Golev str., Perm, Russia, 614081; korsakovaekaterina08@gmail; (342)2808431 associate professor of the Department of botany and plant genetics

Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990

Шестакова Елена Анатольевна, инженер лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии

ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН ORCID: 0000-0002-3494-2886 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13; [email protected]; (342)2808431

Одинцова Татьяна Анатольевна, кандидат технических наук, старший научный сотрудник лаборатории геоэкологии горнодобывающих регионов

ФГБУН Горный институт УрО РАН ORCID: 0000-0001-8316-9327 614007, г. Пермь, ул. Сибирская, 78-а; eco_chemi@mi-perm. ги; (342)2160196

Бачурин Борис Александрович, кандидат геолого-минералогических наук, доцент, заведующий лабораторией геоэкологии горнодобывающих регионов ФГБУН Горный институт УрО РАН ORCID: 0000-0001-7200-2986 614007, г. Пермь, ул. Сибирская, 78-а; [email protected]; (342)2167502

Плотникова Елена Генриховна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии

ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН ORCID: 0000-0002-0107-0719 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13; [email protected]; (342)2808431 профессор кафедры ботаники и генетики растений

ФГБОУВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» 614990, Пермь, ул. Букирева, 15

Shestakova Elena Anatol'evna, engineer of laboratory of molecular microbiology and biotechnology

Institute of Ecology and Genetics of Microorganism UB RAS ORCID: 0000-0002-3494-2886 13, Golev str., Perm, Russia, 614081; [email protected]; (342)2808431

Odintsova Tatiana Anatoljevna, Candidate of Technical Sciences, senior scientist researcher of the laboratory of geoecology mining regions Mining institute UB RAS ORCID: 0000-0001-8316-9327 78A, Sibirskaya str, Perm, Russia, 614007; eco_chemi@mi-perm. ru; (342)2160196

Bachurin Boris Aleksandrovich, candidate of geological-mineralogical sciences, associate of professor, head of the laboratory of geoecology mining regions Mining institute UB RAS ORCID: 0000-0001-7200-2986 78A, Sibirskaya str, Perm, Russia, 614007; [email protected]; (342) 216-75-02

Plotnikova Elena Genrikhovna, doctor of biology,

leading researcher of laboratory of molecular

microbiology and biotechnology

Institute of Ecology and Genetics of

Microorganism UB RAS

ORCID: 0000-0002-0107-0719

13, Golev str., Perm, Russia, 614081;

[email protected]; (342)2808431

professor of the Department of botany and plant

genetics

Perm State University.

15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990