CC BY
19
СОЛОВЙОВ А.1., ЗЕЛЕНСЬКИЙ С.М.
ДУ «1нститут фармакологи та токсикологи АМН Украни», м. Кив
НОВi ПЩХОДИ ДО ФАРМАКОЛОПЧНО1 КОРЕКЦП АРТЕРiАЛЬНОÍ ГiПЕРТЕНЗií
ПРОГРАМА ПРОФ1ЛАКТИКИ АГ В УКРА1Н1
ПРОГРАММА ПРОФИЛАКТИКИ АГ В УКРАИНЕ
АРТЕРИАЛЬНАЯ
Р ГИПЕРТЕНЗИЯ
Мета роботи полягала у формуваннi теоретично! та експериментально! бази для створення принципо-во нових л1карських засоб1в та щдхода для лжування артерДально! ппертензц рiзного генезу.
Артерiальна ппертензДя (АГ) продовжуе домДнува-ти серед серцево-судинних захворювань та основних причин смертностi i втрати працездатносп населення, незважаючи на штенсивш дослщження патогенезу та створення щлого ряду нових л1карських препарата (шпбпори анг1отензинперетворюючого ферменту та блокатори симпатично! нервово! системи, Са2+-блокатори, дДуретики, Р-блокатори тощо). Тривалий час основну роль у розвитку генералДзованого вазо-спазму приписували нейрогенним впливам. На даний час стало зрозумлим, що головна, якщо не виршаль-на, роль в його розвитку належить мiсцевим регуля-торним механДзмам, локалiзованим на р1вн1 ефектор-них елемент1в, тобто ендотелДю та гладеньких м'язДв (ГМ) судинно! ст1нки.
Довгий час вважалося, що головною умовою для розвитку скорочення як судинних, так i всДх 1нших гладеньком'язових клiтин (ГМК) е зростання кон-центрацц iонiв Са2+ у моплазмД [Са2+].. Однак хоча скорочення судинних ГМК шщюеться Са2+, його юльысть не завжди пропорцiйна амплпущ тотчного скорочення м'яздв, оскДльки воно може модифдку-ватися багатьма Дньшими факторами, що регулюють фосфорилювання легких ланцюпв мозину або актив-нДсть фосфатаз. Це явище опосередковуеться змднами так звано! чутливосп (спорщненосп) скоротливих та/ або регуляторних бтыв скоротливого апарату до Са2+ або Са2+-чутливДстю скоротливого апарату [1—3]. Як з'ясувалося в останнД роки, однею Дз ключових ланок у цих механДзмах е регуляторний фермент про-тешиназа С (ПКС), що мае велику юльысть бДлкдв-мдшеней у судинних ГМК, регулюючи чутливДсть !х скоротливих елеменпв до Са2+, Донний обмдн через сарколему, а також впливаючи на тонус ГМК через змдни фДзДологДчно! активносп ендотелальних клДтин [1—6]. НеобхДдно зауважити, що цей надзвичайно широкий спектр регуляторно! да ПКС на тонус судинно! стшки повною мрою проявляеться за умов розвитку ппертензивних стандв рДзного генезу, при яких вона залучена до формування ппертонусу ГМК. ДослД-
дження в цьому напрямку вважаються перспективни-ми, оскДльки наведен результати показують, що змдни активносп ПКС можуть бути одним з основних меха-нДзмдв, вщповщальних за розвиток гтпертензц.
Дан клшДчних та експериментальних дослщжень показують, що юшзукта впливи викликають зна-чш змДни вазомоторно! активносп, що спричиняють розвиток складних захворювань, таких як артерДаль-на ппертензДя, Дшемчна хвороба серця та ДншД. Вста-новлено, що при да ютзуючо! радацц зменшуеться ендотелшзалежне розслаблення судинно! стшки та збДльшуеться судинний тонус, що пов'язане з при-гтченням КО-залежного компоненту вазодилагацц та збДльшенням чутливосп скорочувального апарату гладеньких м'язДв судин до кальцДю [7—10]. ВДдомо, що навДть одноразове опромДнення щурДв викликае значне Д тривале пщвищення артерДального тиску. Однак клиинт та молекулярш механДзми розвитку цьо-го патологДчного процесу залишаються не розкрити-ми. Стае зрозумДлим, що хоча ендотелш Д е найбДльш радДочутливим та легко вразливим компонентом судинно! стДнки, Дснують Д ДншД механДзми радДацДй-ного впливу на судини, що пов'язанД з можливДстю прямого впливу ютзуючого опромДнення на скорот-ливДсть гладеньком'язових клДтин судин ендотелДй-незалежним шляхом [7, 8]. Один Дз можливих шляхДв збДльшення судинного тонусу пов'язаний зД змДнами трансмембранного потенцДалу гладеньких м'язових клДтин, у регуляцц якого важливу роль вщцрають ка-лДевД канали, зокрема Са2+-залежнД К+-канали велико! провщносп (ВКСа) [10, 11].
ПКС прямо залучена також до процесу апоптозу гладеньком'язових Д ендотелДальних клДтин у судин-нДй стшцД [12], який, у свою чергу, значною мДрою за-лежить вДд присутносп стовбурових клДтин. МезенхД-мальн стволовД клДтини (МСК) — це плюрипотентт клДтини, здатнД диференцюватися в цДлий ряд клДтин-них популяцш. Вони легко Дзолюються Д культивують-ся, перемщаються в мсця уражень Д мають здаттсть до артерюгенезу [13]. За всДма цими ознаками вони мають бути альтернативою в лкуванш судинних дис-функцш рДзного генезу. Водночас немае жодних даних про використання !х для лДкування судинних уражень, у тому числД пов'язаних Дз дДею надлишку реактивних
форм кисню, зокрема при да ютзуючо1 радаацц. У да-ному досл1дженн1 така спроба була зроблена.
Вщкриття явища РНК-штерференцц (РНК1) дало надю на створення принципово нових пщходаБ до лкування артер1ально! гшертензи. Технолог1я РНК — один 1з найсучаснших високоспециф1чних метода щльово1 генотерапц, суть якого полягае в пригйчен-н експресц певного гена на стада трансляцц чи по-рушенн його транскрипцц (посттранскрипцшний сайленсинг). Реатзащя цього процесу вщбуваеться за допомогою коротких (21—23 нуклеотиди) дволанцю-гових штерферуючих РНК ^ККА), як1, маючи комп-лементарну послщовйсть до молекули-мшей siRNA мРНК, активують б1лков1 системи кштини (Dicer, RISC), що забезпечують 11 селективну деградацю.
На сьогодй ведома структура генш (вщповщно 1 siRNA) багатьох молекул, яи беруть участь у розви-тку щлого ряду патологш чи запускають його. Забло-кувавши siRNA цих молекул-мшеней за допомогою РНК-штерференцц, можна досягти хоча б ослаблення прогресування захворювання. В останй роки ведуть-ся активй дослщження препарата на основ1 siRNA проти В1Л, раку пщшлунково1 залози, макулярно! дистрофц тощо. I хоча вони навряд чи стануть пана-цеею, однак створення девого й ефективного лкар-ського засобу буде досить важливим кроком на шляху розробки метода генно! терапи. Головною перепоною при створенй лшб на основ1 siRNA е проблеми 1х адресно! доставки в необхщй кштини оргайзму. Одним 1з перспективних методов виршення даного питання е використання р1зних транспортних нано-комплекав (у тому чист лтосом).
Чи не найважлившою сферою використання властивостей РНК-штерференцц е функцюнальна ге-номка. Важливим завданням, яке постало перед люд-ством у зв'язку з описанням геномш багатьох оргайз-м1в, е з'ясування рол кожного гена 1, вщповщно, рол р1зноман1тних бткових молекул, що беруть участь у розвитку патолойчних стайв. Виршення дано1 проблеми можливе через «блокування» гейв, 1 якщо райше на пошук вдалого способу (за допомогою ан-тисмислових олионуклеотида, хМчних 1нг1б1тор1в, шляхом внесення необхщно1 мутацц в зиготу) та його реайзацю потр1бен був час вщ деюлькох мюящб до року, то за допомогою технологи РНК-штерференцц практично з будь-яким геном любого оргашзму (послщовшсть нуклеотидв якого вщома) цю процедуру можна здшснити протягом 1—2 тижЙБ, при цьо-му значно пщвищивши специф1чн1сть блокування. Отже, РНК-штерференщя була обрана нами як щ-струмент для розкриття можливого мехайзму розвитку артер1ально1 гшертензи.
Таким чином, у даному дослщженй ставилося за мету: синтезувати нов1 сполуки, що здатй розсла-
блювати гладеньк1 м'язи судин за вщсутносп зни-ження внутршньокштинного кальцю, тобто роз-робити новий клас антигшертензивних препарата Са2+-десенситайзер1в; розробити методику видлення, культивування дорослих мезенхшальних стовбуро-вих кштин для нормалзування функцц ендотелю 1 гладеньком'язових кштин судин щурв з артер1альною гшертенйею; розробити та застосувати метод блокування «гасшня» експресц гейв протешюнази С для корекцц судинних дисфункцш при артер1альнш гшертензи за допомогою siRNA-iндукованого сайленсингу гейв дельта4зоформи протешюнази С та встановити його терапевтичну ефективйсть на щурах з генетич-но-дегермiнованою артер1альною гшертенйею.
При проведенй дослщжень були використай методи вивчення трансмембранних юнних стру-мiБ у гладеньком'язових кштинах судин, одночасно1 реестрацц скоротливо1 активносп та концентрацц юйзованого кальцю [Са2+]. у м1оплазм1 ГМК, а також методи вивчення експресц юнних каналiБ, ферментiБ та siРНК-iндукованого сайленсiнгу генiБ, що коду-ють експресю юнних каналiБ та ферментних систем в ГМК.
Са2+-десенситайзери
У хода дослщжень було синтезовано та пщдано первинному фармаколопчному аналзу (вивчення гостро1 токсичносп та фармакодинамiки) групу хМч-них сполук, що мають здатнiсть розслаблювати гла-денькi м'язи судин без супутнього зниження [Са2+]., так званi кальцiевi десенситайзери. Встановлено, що такi властивостi мають блокатори Rho- та С-юнази. Дослщження проводились зi сполуками з ряду похщ-них iндолiзинy
У дослщах використовувався метод, що базуеться на одночасйй реестрацii внутршньокштинно1 кон-центрацii юйб кальцiю [Са2+]i та скоротливо1 актив-ност1 ГМ сегментiБ кровоносних судин. На вщмшу в!д досл!д]Б на сынованих препаратах вiн дозволяе спосте-рiгати за кореляцiею змiн Д[Са2+^ та скоротливо1 реак-цii ГМ судин iз цiлiсною мембраною ГМК, що бтьш реалiстично в^дображае змши кальцiевоl чутливостi скоротливого апарату ГМ судин та/чи регуляторних б1лк]в ГМК пщ впливом синтезованих речовин. Ви-користовувався двохвильовий флуоресцентний метод вимiрiв концентрацii iонiБ кальцiю iз застосуванням барвника Fura-2, що базуеться на стввщношенш, яке пов'язуе величину [Са2+^ з в^дношенням iнгенсив-носп флюоресценцii при опромiненнi досл^джувано-го об'екту ультрафiолегом з довжиною хвилi 340 нм (1з40пт) та 380 нм (138опт) вiдповiдно — Ratio (340/380).
На рис. 1, 2 зображеш реакцiя ГМ сегменгiБ кровоносних судин на два з таких синтезованих десенситай-зерiв пщ кодовими назвами № 4 та № 72.
оэ 1,2 со
о
со
га
а 1,0
0,8-
PE, 10-7 моль/л
№ 4, 10-5 моль/л
^Сила
/ [Са2+],
10
6 r
c
1С
4||
0
300 600 700 1200 1500
Грудний BiAqrn аорти Час, с
1,2
3 0,8
0,7
10
8
о л>
4 3
Z
0
0 300 600 900 120015001800 2100 2400
Грудний вщдш аорти Час, с
Рисунок 1. Орипнальна крива скорочення та р1вня [Ca2+]: у гладеньком'язових клтинах де-ендотелзованих судин грудного Bi^rny аорти щyрiв на фон активаци фенлефрином (PE, 1о-7 моль/л) при ди сполуки з кодовою назвою № 4 у концентрацп 10-5 моль/л
Сполука № 4 викликала розслаблення в серед-ньому на 49,8 ± 5,9 % щодо максимального значен-ня скорочення фенилефрином з одночасним змен-шенням рiвня [Ca2+], лише на 24,4 ± 8,0 %. Осыльки таке зменшення рiвня [Ca2+], за час д! сполуки ста-тистично в1рогтдно не вщр1знялось вщ контрольних записiв, це дозволяе зробити висновок, що розсла-блююча д1я сполуки № 4 обумовлена тльки !! Са2+-десенситизуючими властивостями.
Сполука № 72 викликала розслаблення сегменпв судин з одночасним пщвищенням рiвня [Ca2+]., що свщчить про наявнсть у не! Са2+-десенситизуючих властивостей.
Для проведення токсикологiчних дослджень було обрано три речовини з найбтьш вираженою вазоди-лататорною дею. Гостра токсичтсть субстанцш була вивчена вщповщно до методу up-and-down. У досль дженнях використовувались миш1. Для вах дослджу-ваних бюлойчно активних сполук ЛД50 було бтьше нж 2000 мг/кг, а отже, за вищевказаним параметром токсичносп !х можна вщнести до одте! групи — вщ-носно нешюдливих речовин.
AopocAi Me3eHxiMOAbHi CTOB6ypOBi КАГГИНИ людини
У даному дослщжент не ставилося завдання надати морфолойчт або шунопстохМчт докази учасп трансплантованих МСК у процесах диферен-щаци ендотелальних або гладеньком'язових клтин, тобто !х хоумшгу. З практично! точки зору нам ви-даеться бтьш важливим i переконливiшим подати докази здатносп МСК реально впливати на ключовi параметри функцiонально! активностi ефекторних елеменпв судинно'! стiнки (тобто ендотелiоцитiв i
Рисунок 2. Оригнальна крива скорочення та р1вня [Са2+]: у гладеньком'язових клтинах де-ендотелзованих судин грудного вiддiлу аорти щурiв на фон активаци фенлефрином
(РЕ, 10-7 моль/л) при дп сполуки з кодовою назвою № 72 у концентрацп 10-5 моль/л
мюципв) — ендотелшзалежне розслаблення Д калД-еву провщтсть клДтинних мембран, яка е головним шляхом регуляци вазодилататорного потенщалу судинно! стшки. Давно вДдомо, що нормальне функщ-онування ендотелДю е ключовим фактором регуля-цД! кровообДгу, а калДева провДднДсть визначае рДвень мембранного потенщалу ГМК Д, вщповщно, рДвень !х тонДчно! напруги.
ДорослД мезенхшальй стовбуровД клДтини (ДМСК) людини було тестовано на щурах з артерД-альною ппертензДею, що шдукована дДею ютзуючого опромДнення (у дозД 6 Грей) [14]. На рис. 3 показано ефект вДдновно! дД! трансплантацД! МСК на прикладД ацегилхолт-шдукованого (АЛ-шдукованного) розслаблення ГМ щурДв контрольно! групи та опромше-них щурДв.
Встановлено, що ДМСК людини, одноразово трансплантованД опромДненим щурам на 7-й день шс-ля д! радащ! в дозД (16—20) х 106 клДтин, не тльки ма-ють яскраво виражену здатнДсть вщновлювати ендоте-лш-залежне Асh-iндуковане розслаблення в судинах опромДнених щурДв, а й можуть нормалДзувати калДеву провщтсть у гладеньком'язових клДтинах судинно! стшки через Са2+-залежш К+-канали велико! провщ-носп (рис. 4), тобто нормалДзувати вазодилататорний потенщал, порушений унаслщок опромшення, а та-кож нормалДзувати пДдвищений артерДальний тиск.
siRNA-iндукований сайленсiнг гетв
Нами була вперше зроблена спроба використати феномен РНК-шгерференщ! для зниження артерД-ального тиску у щурДв з генетично детермДнованою та шдукованою дДею опромДнення ппертенйею [15, 16]. На рис. 5—7 вщображеш основы отриманД результа-ти впливу б1ККА на рДвень експресц дельта-Дзоформи ПКС (рис. 5), ендотелшзалежне розслаблення (рис. 6)
8
6
2
2
0
С 40 1
<■ £ 30 5 > £ 20 0 га 3 10 г 1 0 < —■—Контроль -•- 6 Гр -А- 6 Гр + ДМСК
......
-100 -50 Э 50
Мембранний потенщал, мВ
Рисунок 3. Вплив ДМСК на ендотелйзалежне розслаблення, викликане ацетилхолном, сег-менлв аорти, отриманих вд здорових i опро-мнених тварин на 30-й день тсля опромнення.
Сегменти судин попередньо скорочувались артеренолом у концентрацп 10-6 моль/л
та артерiальний тиск у щур1в iз генетично детермшо-ваною ппертенйею (рис. 7).
Було вивчено також вплив блокування експресп ген1в 8-ПКС малими 1нтерферуючими РНК на актившсть Са2+-залежних К+-канал1в велико! про-вщносп (ВКСа, maxi-K-канали), яи е одними з голо-вних регулятор1в гладеньком'язового тонусу судин та кров'яного тиску, що вщповщають за дилататорний потенцiал ГМ судин.
Вщомо, що амплiтуца струмiв ВКСа-каналiв у спонтанно ппертензивних щур1в зменшуеться, що вказуе на зниження вазодилататорного потенщалу гладеньких м'язiв. Було встановлено, що амплпуда струмiв ВКСа-каналiв у спонтанно ппертензивних щур1в, як i у здорових щурiв пiсля iонiзуючого ви-промiнювання, зменшуеться, що вказуе на зниження вазодилататорного потенщалу гладеньких м'яз1в. Введення siRNA, специфiчних до 8-ПКС, призве-
Рисунок 4. Вплив ДМСК на вольт-амперн характеристики вих'щних кал1евих струм'в у ГМК опром'шених щур1в
ло до майже повного вщновлення функцюнування ВКСа-канал1в, про що свщчить збiльшення амплiтуди вихщних струм1в ВКСа-канал1в у гладеньком'язових клгтинах (рис. 8).
Встановлено, що пщвищення р1вня розслаблення у спонтанно ппертензивних щур1в пiсля введення siRNA 8-ПКС свщчить про часткове вщновлення ме-ханiзмiв, як1 вiдповiдають за ендотелшзалежне розслаблення гладеньких м'язiв.
Найбiльш важливо, що iнтегральний показник стану серцево-судинно! системи у щурiв зi спонтанною гiпертензiею — артерiальний тиск — значною мiрою знизився шсля блокування гену 8-ПКС малими штерферуючими РНК, що дае пщстави вва-жати доцтьним використання методу блокування гешв протешйнази С за допомогою малих штерфе-руючих РНК з метою корекцц судинних дисфунк-цш при генетично детермшованш артер1альнш п-пертензи.
Рисунок 5. Вплив siRNA на рiвень експресп 8-ПКС в аорт спонтанно ппертензивних щурiв
Рисунок 6. Ендотелйзалежне розслаблення гладенькихм'яз'в аорти спонтанно ппертензивних щурiв при блокуваннi експресп гешв 8-ПКС за допомогою siRNA
Рисунок 7. Динамка артер1ального тиску у спонтанно ппертензивних щур1в тсля бло-кування експресн ген1в 8-ПКС за допомогою siRNA
Список лггератури
1. Soloviev A., Bershtein S. The contractile apparatus in vascular smooth muscle cells of spontaneously hypertensive rats possess increased calcium sensitivity: the possible role of protein kinase C// J. Hypertens. — 1992. — 10. — 131-136.
2. Soloviev A., Basilyuk O. Evidence for decrease in myofilament responsiveness to Ca2+ during hypoxia in spontaneously active vascular smooth muscle in rats // Exper. Physiol. — 1993. — Vol. 18. — P. 395-402.
3. Soloviev A., Parshikov A., Stefanov A. et al. Evidence for the involvement of protein kinase C in depression of endothelium-dependent vascular responses in spontaneously hypertensive rats // J. Vasc. Res. — 1998. — 35. — 325-331.
4. Soloviev A., Tiskin S, Parshikov A. et al. Depression ofendo-thelium-dependent relaxation despite normal release of nitric oxide in the aorta of spontaneously hypertensive rats: possible role ofprotein kinase C// Endothelium-Derived Hyperpolarizations /Ed. by P. Vanhoutte. — Harwood Academic Publishers, 1999. — 289-296.
5. Kizub I., Pavlova A., Soloviev A. Proteine kinase C modulates myofilaments Ca2+-sensitivity in vascular smooth muscle: possible role in vasospasm development // J. of Muscle Res. and Cell Motil. — 2005. — Vol. 26, № 1. — P. 70.
6. Kizub I., Pavlova A., Johnson, Soloviev A., Zholos A. Rho kinase and protein kinase C involvement in vascular smooth muscle myofilament calcium sensitization in arteries from diabetic rats // Br. J. Pharmacol. — 2010. — 159. — 1724-1731.
7. Soloviev A., Tishkin S., Zelensky S. et al. Ionizing radiation altersmyofilament calcium sensitivity in vascular smooth muscle: potential role for protein kinase C // Am. J. Physiol. Integr. Comp. Physiol. — 2005. — 289. — R755-R762, 205.
8. Soloviev A., Tishkin, S., Parshikov A., Ivanova I., Gon-charov E, Gurney A. Mechanisms of endothelial dysfunction after ioniz,ed radiation: selective impairment of the nitric oxide component of endothelium-dependent vasodilation // Br. J. Pharmacol. — 2003. — 138. — P. 837-844.
9. Soloviev A., Stefanov A., Tishkin S. et al. Saline containing phosphatidylcholine liposomes possess the ability to restore endothe-
Рисунок 8. Орипнальн1 записи змни н-тегральних трансмембранних струм'в у
гладеньком'язових клтинах аорти щур1в з артер1альною г1пертенз1ею при блокуванн експресп siRNA 8-ПКС: А — контроль, Б — спонтанно гiпертензивнi щури та В — спонтанно ппер-
тензивн щури тсля введення siRNA 8-ПКС
Malfunction damaged resulting from gamma-radiation // J. Physiol. Pharmacol. — 2002. — Vol. 53. — P. 707-712.
10. Soloviev A., Tishkin S., Ivanova I. et al. Functional and molecular consequences of ionizing irradiation on large conductance Ca2+ activated K+ channels in rat aorta smooth muscle cells // Life Science. — 2009. — № 84. — P. 164-171.
11. Kizub I., Pavlova A., Ivanova I., Soloviev A. Protein kinase C-dependent inhibition of BKCa current in rat aorta smooth muscle cells following у-irradiation // Int. J. Radiat. Biol. — 2010. — 86. — 291-299.
12. Steinber R., Harari O. et al. A protein kinase C-antiapop-tocic kinase signaling complex protects human vascular endothelial cells against apoptosis through induction of Bcl-2 // The J. of Biol. Chem. — 2007. — 282. — 32288-32297.
13. Kinnaird T., Stabile E., Burnett M.S., Lee C.W., Barr S., Fuchs S., Epstein S.E. Marrow-derived stromal cells express genes encoding a broad spectrum of arteriogenic cytokines and promote in vitro and in vivo arteriogenesis through paracrine mechanisms // Circ. Res. — 2004. — 94. — P. 678-685.
14. Soloviev A., Prudnikov I., Tsyvkin V. et al. Electrophysio-logical and contractile evidence the ability of human mesenchymal stromal stem cells to correct vascular malfunction in rats after ionizing irradiation // The J. of Physiol. Sci. (Japan). — 60. — 2. — 161-172.
15. Soloviev A., Tishkin S., Kyrychenko S. et al. siRNA-tar-geted to C-kinase gene expression restores BKCa activity and en-dothelium-dependent relaxation in rats with arterial hypertension. Proced. of The Main Meeting of the Physiol. Soc, PHYSIOLOGY 2010, 30June — 2 July, University of Manchester, UK. — P. 57.
16. Soloviev A., Kyrychenko S., Novokhatska T. et al. The role of protein kinase C in vascular dysfunction following vascular dysfunction following ionized irradiation and essential hypertension development: pharmacological correction with a target-specific siRNA // Abstr. of the 5th Annual Protein Kinases in Drug Discovery conf., May 27-28, 2010, Boston, USA..
Отримано 12.01.11 □
