CC BY
0
УДК 615.322 DOI: 10.24412/2071-6176-2024-2-65-76
НИЗКОЧАСТОТНАЯ УЛЬТРАЗВУКОВАЯ ЭКСТРАКЦИЯ ПОЛИСАХАРИДОВ ИЗ БИОМАССЫ LAMINARIA DIGITATA
А.А. Хитров, Д.А. Гармонов, О.С. Корнеева, М.Г. Сульман, Е.В. Ожимкова, О.В. Манаенков
Бурые морские водоросли являются перспективным источником уникальных биологически активных веществ. Особого внимания заслуживают их водорастворимые полисахариды: ламинараны и фукоиданы. Данные биополимеры проявляют целый ряд физиологических активностей, включая иммуномодулирующую, антибактериальную, антиоксидантную, пребиотическую и т. д. Один из способов переработки биомассы бурых морских водорослей с целью получения полисахаридов может включать в себя низкочастотную ультразвуковую экстракцию, от параметров которой и будет зависеть выход целевых веществ. В данной работе использовано ультразвуковое воздействие с частотой 20 кГц для интенсификации экстракции полисахаридных компонентов из биомассы Laminaria digitata.
Ключевые слова: экстракция, полисахариды, ультразвук, Laminaria digitata.
Полисахариды бурых морских водорослей являются перспективным сырьем для сельскохозяйственной, косметической, пищевой, фармацевтической промышленности [1]. Одним из способов их получения является обработка биомассы водорослей различными растворителями, например, водой, кислотными и щелочными растворами. Существующие на сегодняшний день методы экстракции полисахаридных комплексов из Laminaria digitata характеризуются высокой трудоёмкостью и низкой эффективностью вследствие образования высоковязких растворов. Одним из способов интенсификации экстракционного процесса является применение низкочастотного ультразвукового воздействия. Ограничения использования ультразвуковой экстракции биологически активных веществ из растительной биомассы заключаются, в основном, в необходимости индивидуального подбора условий воздействия для каждого вида сырья. В случае экстракции целевых компонентов из биомассы бурых морских водорослей также необходимо учитывать такой фактор как сезон сбора, поскольку он напрямую влияет на содержание полисахаридов в Laminaria digitata [2]. Целью представленной работы являлось изучение ультразвуковой экстракции полисахаридных комплексов из биомассы Laminaria digitata, собранной в районе Соловецкого архипелага в период с 5 по 20 июня 2023 года.
Характеристика биомассы Laminaria digitata. Бурая морская водоросль порядка Laminariales Laminaria digitata имеет широкое распространение в прибрежных зонах Белого моря. Данная макроводоросль имеет тканевый таллом, который может достигать до 5
метров в длину и 50 сантиметров в ширину. Макроводоросль Laminaria digitata является уникальным возобновляемым источником витаминов, жиров и минералов, но особую ценность имеют полисахаридный комлпекс [3], который может составлять до 56,4% сухого веса биомассы [1].
Полисахаридный комплекс Laminaria digitata представлен следующими биополимерами: ламинараном, альгиновой кислотой, фукоиданом, целлюлозой, Р-1,3-1,4-глюканами. Кроме того, биомасса данной макроводоросли богата D-маннитом.
Стоит отметить, что Laminaria digitata также содержит белки, минералы, макроэлементы и липиды. Сложный состав биомассы Laminaria digitata значительно усложняет процесс экстракции целевых биологических активных соединений [1].
При переработке биомассы бурых морских водорослей с целью получения полисахаридного комплекса также необходимо учитывать сезон сбора растительного материала, что обусловлено ярко выраженной сезонностью развития Laminaria digitata. Установлено, что наибольшее содержание полисахаридов наблюдается в 2-летних бурых морских водорослях, которые были собраны в конце промыслового сезона, что соответствует сентябрю [4].
Ультразвуковая экстракция. Весьма перспективным методом интенсификации экстракционных процессов, позволяющим совместить в одном процессе физические и химических воздействия, является ультразвуковое воздействие на субстраты в жидкой среде. Основным действующим фактором ускорения процессов в жидких средах под действие ультразвука является кавитация, которая сопровождается образованием в жидкости пульсирующих пузырьков, заполненных газом.
Кавитационные процессы сопровождаются разогревом парогазвой смеси в пузыре в ряде случаев до 8000-12000 К, а также возникновением ударных волн и высоких давлений, что приводит к диспергированию частиц, интенсификации массообменных процессов, деполимеризации высокомолекулярных соединений и образованию макрорадикалов [5].
Параметром, с помощью которого можно охарактеризовать ультразвуковое воздействие, является интенсивность. Интенсивность ультразвука, рассеиваемая на кончике ультразвукового волновода, рассчитывается по формуле (1) и выражается в Вт/см2:
Т 4XP
I=-2' С1)
nxD2
где P - мощность, поданная на ультразвуковой волновод за 1 секунду (Вт); D - диаметр волновода (см).
Однако ультразвуковое воздействие может привести не только к повышению эффективности экстракции и увеличению выхода целевых компонентов, но и к разрушению биологически активных веществ, перешедших в раствор. Например, получение ультразвукового гидролизата
водорослей возможно путем варьирования параметров ультразвукового воздействия. Как правило, для гидролиза растительной биомассы применяют высокоинтенсивную обработку [6].
Также стоит отметить, что на данный момент ультразвуковое воздействие активно используется в технологиях переработки бурых морских водорослей [7].
Материалы и методы
Биомасса Laminaria digitata. 2-годичная бурая морская водоросль Laminaria digitata была собрана в Белом море в районе Соловецкого архипелага в период с 5 по 20 июня 2023 года. Высушена на открытом воздухе до постоянной массы. Для исследования сухой талом был измельчен механическим способ и отобрана фракция со средним размером частиц 75-100 мкм. На рис. 1 представлена карта района сбора биомассы Laminaria digitata.
Рис. 1. Район сбора биомассы Laminaria digitata
Низкочастотная ультразвуковая обработка. Из биомассы бурой морской водоросли Laminaria digitata при постоянном перемешивании был приготовлен 10 %-й водный раствор [60 минут при температуре 20 °С, скорость перемешивания 1000 об/мин]. Далее полученный гомогенный раствор разделен на аликвоты объемом 47,5 см3 как средний допустимый для используемого ультразвукового зонда. Обработка образцов осуществлялась с помощью ультразвукового гомогенизатора с рабочей частотой 20 кГц. В качестве излучающего устройства использован зонд, основные параметры которого приведены в табл. 1.
Таблица 1
Основные параметры ультразвукового излучателя
№ п/п Параметр Значение
1 Наименование излучателя МБ 73
2 Диаметр излучателя 3 мм
3 Тип излучателя Плоский
4 Допустимый обрабатываемый объем 5-90 мл
5 Максимальная амплитуда 308 мкм
Ультразвуковой гомогенизатор в автоматическом режиме регистрирует энергию, сообщенную излучателю. Пересчет энергии в мощность для расчета интенсивности осуществлялся по формуле (2).
E
P= -, (2)
т
где Е - энергия, сообщения излучателю (Дж); х - время ультразвукового воздействия (с).
Измерение динамической вязкости. Определение динамической вязкости осуществлялось с помощью ротационного вискозиметра, снабженного шпинделем. Для измерения выбрана скорость вращения шпинделя 20 об/мин, время измерения 60 секунд. Перед измерением пробы были выдержаны в электрическом суховоздушном термостате при температуре 25,0 °С в течение 45 минут. Определение динамической вязкости осуществлялось при температуре 25,0+0,1 °С.
Определение концентрации свободной Б-глюкозы. Определение содержания свободной Э-глюкозы осуществилось ферментативным способом. Для этого был использован коммерческий набор. Сущность метода заключается в определении разности поглощения подготовленной аликвоты образца до и после обработки смесью ферментов. Схемы реакций, используемых в данном методе, представлены на рис. 2.
Э-глюкоза
АТФ
Гексокиназа
АДФ
Э-глюкозо-б-фосфат НАДФ
Глюкозо-6-фостфат-дегидрокиназа
^НАДФЖН) Э-глюконо-б-фосфат
Рис. 2. Сущность ферментативного метода определения Б-глюкозы
Определение изменения поглощения образцов осуществлялось на спектрофотометре. Для измерения разницы оптических плотностей были выбраны кварцевые кюветы с длиной оптического пути 10 мм. Для проведения анализа использована длина волны 340,0 нм, что соответствует максимуму поглощения НАДФH(H+), который образуется в результате реакции, катализируемой глюкозо-6-фосфат-дегидрокиназой (рис. 2). Подготовка проб и проведение анализа осуществлялось согласно методике производителя к набору.
Определение гидродинамического диаметра водорастворимых частиц. Изучение светорассеяние коллоидных частиц осуществлялось на автоматическом анализаторе размеров частиц с лавинным детектором и с углом анализа 90 Диапазон работы прибора принадлежит диапазону от 10 до 3000 нм.
Частичное отделение водорастворимых соединений от нерастворимых осуществилось центрифугированием проб при 10000 об/мин в течение 10 минут. Затем надосадочная жидкость, содержащая нерастворимые частицы, была разбавлена в 10 раз и отфильтрована через нестерильный нейлоновый шприцевой фильтр с размером пор 0,2 мкм. Таким образом была получена фракция полисахаридов, содержащая исключительно водорастворимые полисахариды.
Результаты и их обсуждение
Обработка аликвот рабочего 10 %-го водного раствора водоросли Laminaria digitata низкочастотным ультразвуковым излучением была проведена в трех режимах, отличающихся между собой интенсивностью и амплитудой ультразвукового воздействия (получены три серии образцов 1, 2 и 3), которое рассчитано по формуле (1) с учетом пересчета сообщенной системе энергии в мощность ультразвукового воздействия по формуле (2). Параметры обработки аликвот объемом 47,5 см3 низкочастотным ультразвуком представлены в табл. 2.
Таблица 2
Параметры низкочастотного ультразвукового воздействия
№ с/о № о/а Время обработки, с Мощность, Вт Интенсивность, Вт/см2 Амплитуда, мкм
1 300
1 2 600 25,55 361,64 49,28
3 900
4 300
2 5 600 35,10 496,82 98,56
6 900
7 300
3 8 600 56,20 795,47 150,92
9 900
Для исходного 10%-го водного раствора биомассы Laminaria digitata и каждой опытной пробы определена динамическая вязкость. Результаты определения динамической вязкости представлены в табл. 3.
Таблица 3
Динамическая вязкость до/после ультразвукового воздействия
№ с/о № о/а ц, мПахс
Исходный раствор 2590+30
1 2630+30
1 2 3150+30
3 3710+40
4 2710+30
2 5 4640+50
6 3430+30
7 5300+50
3 8 7470+70
9 6720+70
Также для исходного раствора и каждой опытной пробы определена концентрация D-глюкозы. D-глюкоза может входить в состав следующих биополимеров бурых морских водорослей, основными из которых являются - ламинараны, фукоиданы, целлюлоза [1].
Ламираны - гомополисахариды, основная цепь которых состоит из остатков D-глюкозы, соединенных между собой (-1,3-гликозидными связями. Также основные цепи ламинаров имеют разветвление, представляющее собой остатки D-глюкозы, соединённые (3-1,6-гликозидными связями с основными цепями. В свою очередь, основные цепи ламинаранов также различны по строению. На данный момент описаны M- и G-цепи ламинаринов, который отличаются между собой строением восстанавливающего конца. M-цепь характеризуется тем, что на восстанавливающем конце находится 1 Ю-замещенный D-маннит [8]. Ламинараны характеризуются относительно небольшой молекулярной массой, которая, как правило, для 2-х годичных бурых морских макроводорослей не превышает 10 кДа. Содержание ламинаранов может достигать до 35 % от сухой биомассы бурых морских водорослей и зависит от сезона и места сбора [1]. Фрагмент структурной формулы ламинарана, разветвлённого гомополисахарида, представлен рис. 3, фрагменты структурных формул G-цепи (А) и M-цепи ламинаранов представлены на рис. 4.
Рис. 4. Фрагменты структурной формулы О-цепи (А) и М-цепи (В)
ламинаранов
Фукоиданы - сульфатированные гетерополисахариды, основные цепи которых состоят из остатков L-фукозы. Строение фукоиданов разнообразно. В основном, они представлены полисахаридами, основная цепь которых образована а-1,3-гликозидными связями, но встречаются и разветвленные фукоиданы, в которых наблюдается чередование а-1,3- и а-1,4-гликозидных связей в основной цепи. В случае с чередованием гликозидных связей не установлена четкая зависимость их соотношения, но, в основном, встречаются фукоиданы с соотношением гликозидных связей 1:1 [9]. Фрагмент структурной формулы главной цепи фукоидана, разветвлённого строения, представлен на рис. 5.
Рис. 5. Фрагмент структурной формулы главной цепи фукоидана
разветвленного строения
Строение боковых цепей фукоиданов разнообразно. Помимо сульфатных групп, ионов металлов и других радикалов они могут быть представлены следующими моносахаридами и их производными: галактозой, маннозой, рамнозой, глюкозой, ксилозой, глюкуроновой кислотой, К-ацетилглюкозамином [10]. Содержание фукоиданов может составлять до 28,3 % от сухой массы [1].
Целлюлоза - гомополисахарид, состоящий из остатков Э-глюкозы, соединенных Р-1,4-гликозидными связями. Нерастворим в воде. В клетках бурых морских макроводорослей выполняет структурную функцию. Содержание целлюлозы в биомассе представителей класса РИаеорИуееае характеризуется независимостью от сезона сбора, но для разных видов может составлять от 1 до 13 % от сухой массы [11]. Структурная формула целлюлозы представлена на рис. 6.
Рис. 6. Структурная формула целлюлозы
Результаты определения свободной Э-глюкозы растворе и в каждой опытной пробе представлены в табл. 4.
в исходном
Содержание свободной Б-глюкозы
Таблица 4
№ с/о № о/а Содержание Э-глюкозы, г/100г
Исходный раствор 0,044+0,001
1 0,044+0,001
1 2 0,043+0,001
3 0,045+0,001
4 0,044+0,001
2 5 0,045+0,001
6 0,045+0,001
7 0,044+0,001
3 8 0,045+0,001
9 0,049+0,001
Таким образом, установлено, что деструкция целевых веществ, содержащих Э-глюкозу, происходит при низкочастотном ультразвуком
воздействии, характеризующимся интенсивностью в 795,47 Вт/см2 и продолжительностью в 15 минут. Данный процесс сопряжен со снижением динамической вязкости.
Для установления закономерностей процесса фракционирования полисахаридных комплексов был определен средний гидродинамический диаметр частиц фракции водорастворимых полисахаридов и их мультимодальное распределение (табл. 5).
Таблица 5
Гидродинамический диаметр фракции водорастворимых
полисахаридов
№ с/о № о/а Гидродинамический диаметр, нм
Исходный раствор 1250+30
1 1190+10
1 2 1410+50
3 1600+30
4 1500+20
2 5 1180+20
6 1170+20
7 1310+10
3 8 860+20
9 737+7
Результаты определения мультимодального распределения частиц фракции водорастворимых полисахаридов представлены на рис. 7.
Установлено, что низкочастотное ультразвуковое воздействие, характеризующееся интенсивностью 361,64 Вт/см2 (опытные пробы 1, 2, 3), приводит к увеличению выхода целевых биологически активных веществ без изменения их структуры.
В свою очередь, для серии опытов с интенсивностью 496,82 Вт/см2 (опытные пробы 4, 5, 6) наблюдается увеличение выхода частиц, гидродинамический диаметр которых принадлежит среднему диапазону значений, что свидетельствует о фракционировании водорастворимых полисахаридов, содержащихся в биомассе макроводоросли Laminaria digitata. Также процесс фракционирования сопряжен с уменьшением динамической вязкости.
Рис. 7. Графическая зависимость интенсивности рассеяния света от мультимодального диаметра частиц
Низкочастотное ультразвуковое воздействие с интенсивностью 795,47 Вт/см2 (опытные пробы 7, 8, 9) характеризуется деструкцией целевых биологически активных веществ. Данный процесс включает в себя как фракционирование, так и последующий гидролиз биополимеров.
Заключение
Таким образом, установлено, что при использовании низкочастотного ультразвукового воздействия с интенсивностью 361,64 Вт/см2 происходит экстракция водорастворимых полисахаридов, содержащихся в биомассе бурой морской водоросли Laminaria digitata, без разрушения целевых веществ. Повышение интенсивности воздействия приводит к деструкции полисахаридных компонентов.
Полученные экспериментальные данные будут использованы при дальнейшем изучении переработки биомассы бурых морских водорослей.
Выражаем благодарность ООО НПО «Биомедицинские инновационные технологии» за предоставление материала для исследования, аналитического оборудования и финансовую поддержку.
Список литературы
1. Brown Algae Carbohydrates: Structures, Pharmaceutical Properties and Research Challenges / L. Yanping, Z. Yuting, Z. Ye [et al.] // Marine drugs. 2021. V. 19. № 11. 34822491.
2. Mapholi Z., Goosen N. J. Optimization of fucoidan recovery by ultrasound-assisted enzymatic extraction from South African kelp, Ecklonia maxima // Ultrasonics Sonochemistry. 2023. V. 101. 106710.
3. Combined effect of dietary Laminaria digitata with alginate lyase on plasma metabolites and hepatic lipid, pigment and mineral composition of broilers / M.M. Costa, P.A. Lopes [et al.] // BMC veterinary research. 2022. 18: 153. 35477456.
4. Репина О.И., Муравьева Е.А., Подкорытова А.В. Динамика химического состава промысловых бурых водорослей Белого моря // Труды ВНИРО. 2004. № 70. С. 93-99.
5. Дьякова Н.А., Костылева А.А. Ультразвуковая экстракция: применение и перспективы в технологии фитопрепаратов (обзор) // Традиционная медицина. 2022. Т. 1. № 67. С. 11-19.
6. Optimization of ultrasound assisted extraction of bioactive components from brown seaweed Ascophyllum nodosum using response surface methodology / S.U. Kadam, B.K. Tiwari, T.J. Smyth [et al.] // Ultrasonics Sonochemistry. 2015. V. 23. P. 308-316.
7. Патент RU 2 733 116 C1. Способ получения пищевого гелеобразного концентрированного продукта из морских бурых водорослей / Хитров А.А., Басарыгин А.С. Опубл. 29.09.2020. Бюл. № 28.
8. Laminarans and 1,3-P-glucanases // R.V. Usoltseva, A.A. Belik, M.I. Kusaykin [et al.] // International journal of biological macromolecules. 2020. 32663561.
9. Fucoidan a sulfated polysaccharide from brown algae is a potent modulator of connective tissue ptoteolysis / K. Senni, F. Guenichy, A. Foucault-Bertraud [et al.] // Archives of Biochemistry and Biophysics. 2006. V. 445. P. 56-64.
10. Zhao D., Xu X. Bioactivity of fucoidan extracted from Laminaria japonica using a novel procedure with high yield // Food Chemistry. 2018. V. 245. P. 911-918.
11. Nanocrystalline cellulose from Arctic brown algae Laminaria digitata and Saccharina latissima / K. Bogolitsyn, A. Parshina, L. Aleshina [et al.] // Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre. 2024. V. 31. 100416.
Хитров Анатолий Анатольевич, аспирант, khitrov@wrxompany, Россия, Воронеж, Воронежский государственный университет инженерных технологий,
Гармонов Даниил Андреевич, студент, dgarmonov@npobit.com, Россия, Тверь, Тверской государственный технический университет,
Корнеева Ольга Сергеевна, профессор, д-р биол. наук, зав. каф. биохимии и биотехнологии, biotehvguit@mail.ru, Россия, Воронеж, Воронежский университет инженерных технологий,
Сульман Михаил Геннадьевич, профессор, д-р хим. наук, зав. каф. биотехнологии, химии и стандартизации, science@sci-ence.tver.ru, Россия, Тверь, Тверской государственный технический университет,
Ожикова Елена Владимировна, доц., канд. хим. наук, доцент каф. биотехнологии, химии и стандартизации, eozhimkova@mail.ru, Россия, Тверь, Тверской государственный технический университет,
Манаенков Олег Викторович, доц., канд. хим. наук, доцент каф. биотехнологии, химии и стандартизации, ovman@yandex.ru, Россия, Тверь, Тверской государственный технический университет
LOW-FREQUENCY ULTRASONIC EXTRACTION OFPOLYSACCAHARIDES
FROM LAMINARIA DIGITATA
А.А. Khitrov, D.A. Garmonov. O.S. Komeeva, M.G. Sulman, E.V. Ozhimkova,
O.V. Manaenkov
Brown seaweed is a promising source of unique biologically active substances. Their water-soluble polysaccharides deserve special attention: laminarin and fucoidan. These biopolymers exhibit a number of physiological activities, including immunomodulatory, antibacterial, antioxidant, prebiotic, etc. One of the methods of processing brown algae biomass in order to obtain polysaccharides may include low-frequency ultrasonic extraction, the parameters of which will determine the yield of the target substances. In this work, ultrasonic exposure with a frequency of 20 kHz was used to intensify the extraction ofpolysaccharides of components from Laminaria digitata biomass.
Key words: extraction, polysaccharides, ultrasound, Laminaria digitata.
Khitrov Anatoly Anatolyevich, postgraduate student, khitrov@wr. company, Russia Voronezh, Voronezh State University of Engineering Technologies,
Garmonov Daniil Andreevich, student, dgarmonov@ npobit.com, Russia, Tver. State Technical University,
Korneeva Olga Sergeevna, doctor of biological sciences, Head of Biochemistry and Biotechnology Department, biotehvguit@,mail.ru, Voronezh, Russia, Voronezh University of Engineering Technologies,
Sulman Mikhail Gennadievich, doctor of chemical sciences, Head of Biotechnology, Chemistry and Standardization Department, science@,sci-ence.tver.ru, Russia, Tver, Tver State Technical University,
Ozhimkova Elena Vladimirovna, candidate of chemical sciences, eozhimkova@mail.ru, Russia, Tver, Tver State Technical University,
Oleg Viktorovich Manaenkov, candidate of chemical sciences, ovman@yandex.ru, Russia,Tver, Tver State Technical University
