CC BY
9УДК 615.9+616-001.8:618.3]:616.8-092.9
В.А. Вокина, Л.М. Соседова, В.С. Рукавишников, Н.Л. Якимова, А.В. Лизарев
НЕЙРОТОКСИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ ТОЛУОЛА НА ФОНЕ ПРЕНАТАЛЬНОГО ГИПОКСИЧЕСКОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА БЕЛЫХ КРЫС
ФГБУ «Восточно-Сибирский научный центр экологии человека» СО РАМН, Ангарск
Проведено сравнительное исследование влияния толуола на показатели поведения, когнитивные способности и биоэлектрическую активность головного мозга белых крыс с нормальным течением эмбрионального развития и на фоне пренатальной гипоксии. Моделирование пре-натальной гипоксии осуществляли путем подкожного введения самкам белых крыс раствора нитрита натрия в дозе 50 мг/кг на 13—14 день гестации. Потомство, полученное от данных самок, в возрасте 2,5—3 месяцев подвергали воздействию толуола в концентрации 560 мг/м3, 4 часа в день, 5 дней в неделю, в течение 4 недель. После экспозиции у животных оценивали структуру индивидуального и внутривидового поведения в тестах «открытое поле» и «чужак-резидент», показатели когнитивных способностей при обучении в «радиальном лабиринте», а также проводили электроэнцефалографическое обследование с применением слуховых и зрительных вызванных потенциалов. Показано, что острое гипоксическое воздействие на ранних этапах органогенеза оказывает влияние на последствия интоксикации толуолом, являясь при этом отягощающим фактором.
Ключевые слова: толуол, пренатальная гипоксия, белые крысы, поведение, электроэнцефалография.
VA. Vokina, L.M. Sosedova, V.S. Rukavishnikov, N.L. Yakimova, A.V. Lizarev. Neurotoxic effect of toluene on background of prenatal hypoxic brain damage to white rats
East-Siberian Scientific Center of Human Ecology, Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Angarsk
Comparative study covered influence of toluene on behavioral parameters, cognitive abilities and brain bioelectric activity in white rats with normal embryonic development or with prenatal hypoxia. Prenatal hypoxia was simulated by subcutaneous injection of 50 mg/kg sodium nitrite into female white rats on day 13—14 of gestation. The offspring at the age of 2,5—3 months was exposed to toluene (concentration of 560 mg/m3, 4 hours per day, 5 days per week, over 4 weeks). After the exposure, the animals were estimated for individual and intraspecific behaviour in «open field» and «resident-intruder» tests, for cognitive abilities in «radial maze» training, EEG with visual and auditory evoked potentials. Acute hypoxia at early stages of organogenesis appeared to be burdening factor and to influence consequences of toluene intoxication.
Key words: toluene, prenatal hypoxia, white rats, behaviour, electroencephalography.
Особое внимание на современном этапе уделяется проблемам влияния негативных факторов в прена-тальный период, которые могут приводить к задержке физического развития, нарушению процессов адаптации и формированию различных неврологических и психических нарушений [4,5,7,8,11]. Рост перинатальной патологии, ведущее место в которой занимает внутриутробная гипоксия и асфиксия в родах, неизбежно приводит к повышению в популяции числа лиц с различной неврологической и соматической патологией, при этом особую значимость приобретают исследования влияния пренатальных факторов, в частности гипоксии, на чувствительность организма к действию нейротоксичных веществ. Изучение роли пренатального повреждения мозга в
процессе формирования повышенной индивидуальной чувствительности к действию нейротоксичных веществ позволит прогнозировать персональный риск развития патологического процесса при действии химических факторов в онтогенезе.
Одним из широко распространенных веществ, тропных к нервной системе, является толуол. Многочисленные исследования посвящены изучению ней-ротоксических свойств данного соединения, в то же время механизмы, лежащие в основе патологических процессов, и факторы, оказывающие влияние на проявления интоксикации при воздействии толуола, до сих пор окончательно не изучены [6,9,10,12].
Целью настоящего исследования являлось изучение влияния толуола на белых крыс с нормальным
течением эмбрионального развития и в условиях моделирования пренатального гипоксического повреждения головного мозга.
Материалы и методики. Экспериментальные исследования проведены на 40 беспородных белых крысах-самках и 120 самцах их половозрелого потомства массой 180—240 г. Фиксированный срок беременности определяли общепринятым методом по наличию сперматозоидов во влагалищных мазках. Моделирование пренатальной гипоксии осуществляли путем подкожного введения беременным самкам крыс раствора нитрита натрия в концентрации 50 мг/кг на 13—14-й день гестации. Самки контрольной группы получали инъекции физиологического раствора в том же режиме. За два дня до предполагаемой даты родов крыс рассаживали в отдельные клетки. Крысята всех групп были отсажены от матерей и разделены по полу на 30-й день жизни. В дальнейшем из полученного потомства в эксперименте использовались только самцы. В возрасте 2,5—3 месяцев половину контрольных животных и животных с пренатальной гипоксией подвергали динамическому ингаляционному воздействию толуола в затравочных камерах объемом 200 л, в концентрации 560± 2,6 мг/м3 (150 ррт), 4 часа в день, 5 дней в неделю, в течение 4 недель. Крысам контрольной группы в том же режиме в камеры подавался чистый воздух.
В итоге было сформировано 3 группы крыс (по 30 особей в каждой): 1) контрольные животные; 2) животные с нормальным течением эмбрионального развития, подвергавшиеся воздействию толуола в половозрелом возрасте; 3) крысы, перенесшие гипоксию на 13—14-й день эмбрионального развития и подвергавшиеся воздействию толуола в половозрелом возрасте.
Через неделю после окончания затравки проводили обследование двигательной, ориентировочной активности, эмоционального состояния, когнитивных способностей животных с использованием следующих тестов: «открытое поле», «чужак-резидент», «вращающийся стержень», «радиальный лабиринт», а также электроэнцефалографическое обследование (ЭЭГ) с применением зрительных и слуховых вызванных потенциалов (ЗВП и СВП). Исследование ритмической электрической активности коры головного мозга животных проводили через 4 недели после окончания экспозиции. Стереотаксические манипуляции выполняли с использованием координат стереотаксиче-ского атласа мозга взрослой крысы под анестезией (кетамин внутрибрюшинно 0,15 мл/100 г, рометар внутрибрюшинно 0,075 мл/100 г массы). Электроды вживляли в сенсомоторную и зрительную зоны коры головного мозга белых крыс. Индифферентный электрод вживляли в носовые кости. Регистрацию ритмической электрической активности коры головного мозга белых крыс проводили на 3—4-й день после вживления электродов с использованием многофункционального комплекса для исследования ЭЭГ и ВП
«Нейрон-Спектр-4» (ООО «Нейрософт», Россия) совместно с врачом-неврологом клиники Института, д-ром мед. наук Е.В. Катамановой.
Все экспериментальные животные получены путем собственного воспроизводства в виварии ФГБУ «ВСНЦ ЭЧ» СО РАМН и содержались на стандартном рационе. Работа выполнена с соблюдением правил гуманного отношения к животным в соответствии с требованиями «Международных рекомендаций по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (ВОЗ, Женева, 1985 г.) и «Правилами лабораторной практики» (Приказ Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. №708н).
Статистический анализ результатов исследования проводился с использованием пакета прикладных программ Statistka 6.1. (StatSoft) (лиц № AXXR004E642326FA). Для принятия решения о виде распределения признаков использовали W-кри-терий Шапиро — Уилка. Для сравнения несвязанных групп применяли U-критерий Манна — Уитни. Нулевые гипотезы об отсутствии различий между группами отвергали при достигнутом уровне значимости соответствующего статистического критерия р<0,05. Результаты представлены в виде медианы и интерквантильного размаха (Me (LQ;UQ)).
Результаты исследований и их обсуждение. Воздействие толуола на белых крыс с нормальным течением эмбрионального развития (группа №2) приводило к повышению двигательной активности при тестировании в «открытом поле». У животных наблюдалось статистически значимое возрастание общего числа пересеченных квадратов и суммарной длительности «локомоций» по сравнению с контрольной группой. Уровень ориентировочно-исследовательской активности у животных данной группы был снижен, что выражалось в снижении числа и длительности актов «обнюхивание» и количества «заглядываний в отверстия». Изменений в эмоциональном поведении животных, которые оценивались по количеству и длительности таких актов движения, как «груминг», «фризинг» и «движение на месте», зафиксировано не было. В то же время наличие выходов в центр арены в группе крыс, подвергавшихся воздействию толуолом, свидетельствовало об анксиолитическом эффекте данного соединения в используемой дозе (р=0,01).
При сравнении показателей поведения экспонированных толуолом крыс с нормальным течением эмбрионального развития и с пренатальной гипоксией (группы №№2 и 3) принципиальных отличий по показателям исследовательской и двигательной активности в «открытом поле» не выявлено. В то же время у животных, подвергавшихся пренатальной гипоксии (группа №3), после воздействия толуола уровень тревожности значительно превышал показатели контроля, о чем свидетельствовало повышение числа актов «фризинг».
При тестировании животных в «радиальном лабиринте» использовалась схема для раздельного анализа двух категорий пространственной памяти — референтной, хранящей информацию об освоении лабиринта в целом, и рабочей, ответственной за сохранение информации в пределах одного опыта. Ошибкой референтной памяти считали посещение отсека лабиринта, который был закрыт при обучении и открывавшийся только в условиях тестирования. Ошибкой рабочей памяти — повторное посещение подкрепляемого отсека. Нарушение способности к пространственной ориентации наблюдалось во всех опытных группах. У животных контрольной группы при окончании обучения не наблюдалось ошибок рабочей памяти, в то время как в группах №2 и №3 данный показатель составлял соответственно 0,33±0,14 и 0,4±0,16. Число ошибок референтной памяти в группе экспонированных толуолом крыс с нарушенным гипоксией течением эмбриогенеза (группа №3) превышало показатели контрольной группы и группы №2, однако статистически значимых отличий по данному показателю не было выявлено. У этих же особей наблюдалось статистически значимое снижение количества последовательно посещенных подкрепляемых отсеков лабиринта по сравнению с группой контроля (3,1±0,31 и 3,7±0,12 соответственно, р = 0,049).
Исследование координации и выносливости животных с помощью теста «вращающийся стержень» не обнаружило значимых отличий во времени удер-
Показатели слуховых и зрительных вызванных
жания на стержне между результатами белых крыс исследуемых групп. Следовательно, наблюдаемые при тестировании в «открытом поле» и радиальном лабиринте изменения двигательной активности не были опосредованы нарушением координации и физической выносливости. Более вероятной причиной данных изменений могли являться морфологические и нейромедиаторные перестройки в тканях головного мозга крыс.
Характер зоосоциальных контактов изучали в тесте «чужак — резидент». Было выявлено, что воздействие толуола в половозрелом возрасте (группа №2) не приводило к изменению структуры внутривидового взаимодействия. Однако интоксикация толуолом у животных, подвергавшихся острому гипоксиче-скому воздействию на 13—14-е эмбриональные сутки (группа №3), привела к неадекватной патологической агрессии. Так, длительность агрессивного поведения данных особей значимо превышала показатели групп №1 и №2 и составила соответственно 9,6 (0;23,1); 0 (0;3,2) и 0 (0;2).
Результаты электроэнцефалографического обследования показали, что влияние толуола на характеристики вызванных потенциалов животных (группа №2) характеризовалось снижением амплитуды пика N1 слухового (р=0,023) и амплитуды пика Р2 зрительного ответов (р=0,046) относительно показателей контрольной группы (табл.). Изменений латентности основных пиков ЗВП и СВП не было выявлено.
Таблица
потенциалов головного мозга белых крыс (Me
Характеристика диапазонов
№ N 1 P 2 N 2 P 3
группы Латентность, мс / Амплитуда, мкВ
Слуховые вызванные потенциалы
1 72 (71; 80) 111 (108; 119) 151 (149; 166) 238 (265; 257)
35 (8; 70) 11 (5; 34) 15 (11; 25) 17 (15; 28,5)
2 81 (77; 83) 120 (113; 126) 151 (148; 175) 234 (212; 253)
4 (1; 14) 1 8(2; 26) 18 (3; 26) 4 (2; 25)
3 170 (134;198) 12 227 (205;261) 12 296 (251;309) 12 336 (313;341) 12
19 (7; 37) 2 11 (4; 36) 16 (11; 28) 21 (6; 37)
Зрительные вызванные потенциалы
1 72 (68; 82) 108 (105;120) 155 (143; 168,5) 205 (198; 233)
19 (5; 34) 17 (12,5; 23) 5 (4; 16) 19 (3,5; 31)
2 72 (68; 83) 107 (106;116) 154 (144;160) 232 (221; 256)
7(4; 10,5) 5 (2,5; 19) 1 5,5 (4,5; 9,5) 8 (6; 13)
3 167 (105;202) 12 218 (178;252) u 300 (238;308) 12 340 (302;345) 12
15 (10; 25) 2 6 (4; 17,5) 8 (6; 18,5) 18 (11; 30,5) 2
Примечания: Над чертой — латентность (мс), под чертой — амплитуда (мкВ); 1 — различия статистически значимы по сравнению с контролем при р<0,05; 2 — различия статистически значимы по сравнению с группой №2 при р<0,05.
При проведении стимуляционных проб у экспонированных толуолом животных, подвергавшихся пренатальной гипоксии (группа №3), наблюдалось статистически значимое повышение латентности всех основных пиков ЗВП и СВП (р<0,003) по сравнению с группами №1 и №2. Кроме того, у данных животных амплитуды пика N1 слухового ответа и N1 и Р3 зрительного ответа значительно превышали показатели животных группы №2 (р<0,05, табл.).
Анализируя полученные результаты, можно сделать вывод о том, что действие толуола на индивидуальное поведение животных сопровождалось повышением локомоторной и снижением исследовательской активности, которые не имели зависимости от условий пренатального развития. Анксиолитический эффект данного соединения был выражен при действии на животных как с нарушенным, так и с нормальном течением эмбрионального развития.
Резкое повышение агрессивности у экспонированных толуолом особей с пренатальной гипоксией свидетельствует не только о важной роли раннего постимплантационного периода в формировании внутривидового поведения, но и о необходимости дальнейших исследований толуол-индуцированного повышения внутривидовой агрессивности. Литературных данных об экспериментальных исследованиях влияния толуола на агрессивность в доступной литературе нами не обнаружено. Результаты клинических обследований лиц, намеренно употребляющих толуолсодержащие смеси в качестве наркотического средства, показали, что наряду с нарушением сознания и двигательного поведения, у данного контингента нередко появляется тенденция к агрессивным действиям, однако в данном случае следует принимать во внимание более высокие уровни экспозиции (от 7500 мг/м3 и выше), чем в настоящем исследовании [3]. Кроме того, возникновение и течение агрессивного поведения может быть связано с такими свойствами нервной системы, как эмоциональность и активность [2,13]. В данном исследовании вполне закономерно агрессивный тип поведения сопровождался повышением двигательной активности у животных.
Проведение электроэнцефалографического исследования с применением зрительных и слуховых вызванных потенциалов показало, что у экспонированных толуолом животных с пренатальной гипоксией наблюдалось повышение амплитуды пиков N1 и Р3 зрительного и N1 слухового ответа и повышение латентности основных пиков ЗВП и СВП. Наблюдаемое повышение амплитуды может происходить при повышении судорожной активности мозга [1]. Исходя из приведенных результатов можно предположить, что наряду с нарушением проведения нервного импульса по зрительным и слуховым путям, о чем свидетельствовало повышение латентности, воздействие толуола на фоне
гипоксического повреждения мозга приводит к снижению судорожного порога у крыс. В зарубежной литературе встречаются данные о способности толуола снижать судорожный порог при остром действии в высоких дозах, а также о появлении эпилептических очагов у лиц, употребляющих то-луолсодержащие смеси [10,12].
Результаты настоящего исследования свидетельствуют, что гипоксическое повреждение головного мозга в период эмбрионального развития является фактором риска развития патологического процесса при интоксикации толуолом. Можно предположить, что возникающие на фоне прена-тального гипоксического поражения ЦНС постоянные изменения метаболизма нервной системы оказывают влияние на повышение индивидуальной чувствительности организма к действию нейроток-сичных веществ.
Выводы. 1. Пренатальная гипоксия является отягощающим фактором при интоксикации толуолом у белых крыс. 2. Интоксикация толуолом у белых крыс вызывает дисрегуляцию показателей слуховых и зрительных вызванных потенциалов, нарастающую у животных с пренатальной гипоксией. 3. Особенностью патологического процесса в ЦНС при интоксикации толуолом у белых крыс с пренатальной гипоксией является резко выраженная агрессивность.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ (см. References пп. 7-13)
1. Гнездицкий В.В. Обратная задача ЭЭГ и клиническая электроэнцефалография: учеб. Для врачей. Таганрог: ТРТУ,
2000. — 640 с.
2. Кудрявцева Н.Н. // Успехи физиологических наук.
— 2001. — №4. — С.23-34.
3. Осколок Л.Н., Терентьев А.А. // Фундаментальные исследования. — 2011. — №10, ч. 2. — С. 340-344.
4. Отеллин В.А., Хожай Л.И., Ватаева Л.А., Шиш-ко Т.Т. // Рос. физиол. журн. — 2011. — №10. — С. 1092-1100.
5. Самсыгина Г.А. // Педиатрия. — 1996. — №5. — С. 74-77.
REFERENCES
1. Gnezditskiy V.V. Reverse EEG task and clinical electroencephalography. Textbook for doctors. Taganrog:
TRTU; 2000: 640 p. (in Russian).
2. Kudriavtseva N.N. Uspekhi fiziologicheskikh nauk. 2001; 4: 23-34 (in Russian).
3. Oskolok L.N., Terent'ev A.A. Fundamental'nye issledovaniya. 2011; 10, part 2: 340-344 (in Russian).
4. Otellin VA., Khozhai L.I., Vatayeva L.A., Shishko T.T. Ros. fiziol. zhurn. 2011; 10: 1092-1100 (in Russian).
5. Samsygina G.A. Pediatria. 1996; 5: 74-77 (in Russian).
6. Bowen S.E., Wiley J.L., Balster R.L. // Eur.J. Pharmacol. — 1996. — №312. — P.131—136.
7. Yoshimasu K., Barbaresi W. J., Colligan R. C. et al. // Pediatrics. — 2010. — №126(4). — P. 788-795.
8. GMlan H. M, Huleihel M. // Dev. Sci. — 2006. — №.9(4). — P. 38-49.
9. Hillesfors-Berglund M., Liu Y., von Euler G. // Toxicol. — 1995. — №100. — Р. 185-194.
10. Riegel A.C. // Pharmacol. Biochem. Behav. — 1999. — №62. — P.399-402.
11. Sandman C. A., Davis E. P., Buss C., Glynn L.M. // I.J. of Peptides. — 2011. — №1. — P.9.
12. Schaumburg H.H., Spencer P.S. Toluene. Experimental and Clinical Neurotoxicology. New York: Oxford University
Press, 2000. — P. — 1183-1189.
13. Wilson J.D., George F.W., Griffin J.E. // Science. — 1981. — Vol.211. — №4488. — P. 1278-1284.
Поступила 06.03.2014
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Вокина Вера Александровна,
мл. науч. сотр. ФГБУ «ВСНЦ ЭЧ» СО РАМН, канд. биол. наук. E-mail: vokina.vera@gmail.com.
Соседова Лариса Михайловна,
зав. лаб. токсикологии ФГБУ «ВСНЦ ЭЧ» СО РАМН, д-р мед. наук, проф. E-mail: sosedlar@mail.ru.
Рукавишников Виктор Степанович,
директор ФГБУ «ВСНЦ ЭЧ» СО РАМН, член-корр. РАМН, E-mail: imt@irmail.ru.
Якимова Наталья Леонидовна,
науч. сотр. ФГБУ «ВСНЦ ЭЧ» СО РАМН, канд. биол. наук. E-mail: tox_ lab@mail .ru.
Лизарев Александр Викторович,
ст. науч. сотр. ФГБУ «ВСНЦ ЭЧ» СО РАМН, канд. мед. наук. E-mail: tox_ lab@mail .ru.
УДК 577.1:616-001.34
Г.М. Бодиенкова, С.И.Курчевенко
РОЛЬ НЕЙРОТРОФИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ В ФОРМИРОВАНИИ ВИБРАЦИОННОЙ БОЛЕЗНИ
ФГБУ «Восточно-Сибирский научный центр экологии человека» СО РАМН, Ангарск
Исследованы сывороточные концентрации нейротрофических факторов (нейротрофиче-ский фактор головного мозга — BDNF и цилиарный (глиальный) нейротрофический фактор — CNTF) у рабочих виброопасных профессий (стажированные работники без признаков нарушения здоровья от воздействия вибрации, пациенты с профессиональной полинейропатией конечностей и пациенты с вибрационной болезнью). Установлено, что воздействие производственной вибрации приводит к возрастанию концентрации BDNF и CNTF в сыворотке крови во всех обследуемых группах. Возрастание концентрации нейротрофических факторов на ранних стадиях формирования патологии свидетельствует об их протективном действии, включении компенсаторно-защитных механизмов. В то время как высокие уровни BDNF и CNTF у пациентов с вибрационной болезнью, по-видимому, указывают на происходящие нейродеструктивные процессы в нервной системе.
Ключевые слова: нейротрофический фактор головного мозга, цилиарный нейротрофический фактор, рабочие, вибрация.
G.M. Bodienkova, S.I. Kurchevenko. The role of neurotrophic factors in formation of vibration disease
«East-Siberian Scientific Center of Human Ecology», Siberian Branch of the RAMS, Angarsk
The authors studied serum levels of neurotrophic factors (brain-derived neurotrophic factor BDNF and ciliary neurotrophic factor CNTF) in workers exposed to vibration (workers with long length of service and without health disorders caused by vibration, patients with occupational limbs polyneuropathy, and vibration disease patients). Findings are that occupational vibration induces increased BDNF and CNTF serum levels in all groups examined. Increased levels of neurotrophic factors at early stages of pathologic process indicate their protective action, action of compensatory protective mechanisms. However, high levels of BDNF and CNTF in vibration disease may point to neurodestructive processes in nervous system.
Key words: brain-derived neurotrophic factor, ciliary neurotrophic factor, workers, vibration.
