CC BY
26DOI: 10.24412/2226-079X-2022-12435
Нейротоксическая CBE/MPTP модель паркинсонизма на мышах для оценки вклада дисфункции лизосом в патогенез болезни Паркинсона
А.К. Емельянов1, 2, М.М. Руденок3, А.С. Журавлев1, 2, Г.В. Байдакова4, П.В. Баранова4, И.Н. Рыболовлев3, М.А. Николаев1, 2, М.И. Шадрина3, Е.Ю. Захарова4, П.А. Сломинский, С.Н. Пчелина1, 2
1 ФГБУ "Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова"
НИЦ "Курчатовский институт", Гатчина 2 ФГБОУВО "Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова"Минздрава России 3 ФГБУ "Институт молекулярной генетики"НИЦ "Курчатовский институт", Москва 4 ФГБНУ "Медико-генетический научный центр им акад. Н.П. Бочкова", Москва
Болезнь Паркинсона (БП) - распространенное нейродегенеративное заболевание, при котором гибель нейронов обусловлена агрегацией белка а-синуклеина, а наиболее уязвимой популяцией клеток являются дофаминергические нейроны черной субстанции ствола мозга. Мутации в гене лизосомного фермента глюкоце-реброзидазы (GCase) являются наиболее распространенным генетическим фактором высокого риска развития БП, повышая риск заболевания в 7-8 раз во всех популяциях. В гомозиготном, а также в компаунд-гетерозиготном состоянии мутации в гене GCase (0ВА) приводят к развитию наследственного заболевания, относящегося к классу лизосомных болезней накопления, - болезни Гоше (БГ). В норме GСase расщепляет глюкозилцерамид на церамид и глюкозу. При дисфункции фермента в клетках накапливаются глюкозилцерамид и его производная лизосфин-голипид - глюкозилсфингозин. Наиболее распространенными мутациями в гене 0ВА являются замены L444P и N370S, отвечающие за 70% мутантных аллелей [1, 2]. В этом гене также описаны полиморфные варианты (Е326К, Т369М), которые не приводят к развитию БГ, однако ассоциированы с повышением риска развития БП в 2 раза [1, 3, 4]. Если при наличии мутаций остаточная ферментативная активность GCase составляет 5-17%, то полиморфные варианты ассоциированы со снижением ее активности порядка 50% [5, 6]. Молекулярный механизм
развития 0ВА-ассоциированной БП остается неизвестным, однако предполагается, что дисфункция лизосом может нарушать в клетках катаболизм а-синуклеина, включая его модифицированные формы. Изучение взаимосвязи накопления а-синуклеина и нарушения функции GCase является важным шагом в понимании патогенеза БП [7-9].
Изучение патогенеза как БП, так и БГ с помощью токсининдуцированных моделей является мощным инструментом для понимания молекулярных механизмов развития этих заболеваний. Многие годы "золотым стандартом" в моделировании БП служит специфический нейротоксин 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (МРТР), тогда как для моделирования БГ используется ковалентный селективный ингибитор GCase кондуритол-Р-эпоксид (СВЕ) [10-14]. Последний является прямым конкурентным и необратимым ингибитором GCase, который при введении обладает дозозависимым эффектом, при высоких концентрациях способен вызывать симптомы, подобные БГ 2-го типа, а при инъекциях с низкими дозами и долгосрочным курсом - вызывать симптомы паркинсонизма у животных [15, 16].
Целью настоящего исследования являлась оценка сочетанного эффекта МРТР и СВЕ на степень нейродегенерации, уровень активности GCase, лизосфинголипидов (HexSph), а также на уровень олигомерных и фосфорилированных
форм а-синуклеина в тканях различных отделов мозга экспериментальных животных (мышей).
В ходе проведенного исследования нами были созданы 3 животных модели (СВЕ, МРТР, СВЕ/МРТР) с введением умеренной дозы нейро-токсина МРТР [17] для выяснения степени его действия на фоне дисфункции лизосом, вызванной введением СВЕ. Для работы использовали самцов мыши линии С57ВЦ/6 в возрасте 5-6 нед, массой 22-26 г. Животные были разделены на 4 группы: контрольная группа (п = 5) с подкожным и внутрибрюшинным введением хлорида натрия (№С1); группа с подкожным введением МРТР и внутрибрюшинным введением №С1 (п = 5); группа с внутрибрюшинным введением СВЕ и подкожным введением №С1 (п = 5); группа с внутрибрюшинным введением СВЕ и подкожным введением МРТР (п = 5).
Для содержания мышей использовался виварий со свободным доступом к пище, воде и естественной сменой освещения. Экспериментальная работа с лабораторными животными осуществлялась в соответствии с принятыми протоколами по содержанию лабораторных животных и была одобрена этическим комитетом учреждения.
Животным в контрольной группе для каждой модели вводился 0,9% раствор №С1. В экспериментальных группах, включавших инъекции МРТР, токсин вводили подкожно в дозе 12 мг/кг дважды с интервалом 2 ч. Инъекции СВЕ производились внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг однократно одновременно со вторым введением МРТР. Вывод животных из эксперимента осуществляли через 5 и 14 дней после инъекций путем цервикальной дислокации с последующим извлечением лобной коры, стриатума, черной субстанции.
Для подтверждения того, что нами получены модели животных с МРТР-индуцированным паркинсонизмом, а также дисфункцией лизо-сом, была проведена оценка ферментативной активности GCase в различных отделах мозга экспериментальных животных и уровня дофамина в стриатуме с использованием методов масс-спектрометрии, проведены иммуногисто-химические исследования. Полученные данные свидетельствуют о том, что СВЕ способствовал снижению активности GCase в гомогенатах различных отделов мозга модельных животных более чем на 50% (рис. 1), а МРТР - снижению
¡г1
я
и о
ё о 3
80
60
40
20
р = 0,021
р = 0,113
I-1
р = 0,064
р = 0,009
I-1
р = 0,008
= 0,009 1 1 р = 0,008
г
р = 0,050 р = 0,034
н
1 р = 0,034
гЬ
I
1
Кортекс
Стриатум
.11 Черная субстанция
□ №01 □ СВЕ ПМРТР ■ СВЕ/МРТР Рис. 1. Активность ОС^е в различных отделах мозга экспериментальных животных при введении №С1 (контроль), СВЕ, МРТР и одновременном введении СВЕ и МРТР.
количества дофамина (таблица) в стриатуме животных на 5-й день после инъекций.
В результате проведенного исследования был отмечен потенциирующий эффект СВЕ и МРТР на снижение концентрации дофамина в стриа-туме модельных животных (см. таблицу), а именно: при введении нейротоксина модельным животным на фоне дисфункции GCase (группа СВЕ/МРТР) показано, что одновременное введение указанных соединений на 5-й день приводило к снижению концентрации дофамина в стриатуме мозга мышей на 14-й день по
Уровень дофамина в стриатуме мозга мышей при введении МРТР, СВЕ и одновременном введении СВЕ/МРТР
Группа Относительный уровень дофамина (отношение к уровню дофамина у мышей контрольной группы)
5 дней после инъекций 14 дней после инъекций
МРТР 0,61 1,14
Р 0,016 0,423
СВЕ 0,90 0,97
Р 0,076 0,749
СВЕ/МРТР 0,61 0,52
Р 0,047 0,004
^ № 2 * 2022
57
р = 0,034
Кортекс
Стриатум Черная субстанция
□ Nad □ СВЕ □ МРТР
IСВЕ/МРТР
Рис. 2. Концентрация лизосфинголипидов (Нех8рИ) в различных отделах мозга экспериментальных животных при введении №С1 (контроль), СВЕ, МРТР и одновременном введении СВЕ и МРТР.
(а)
180 кДа -
17кДа-
NaCl
СВЕ
МРТР
1 Анализируемые олигомерные формы а-синуклеина
Мономерный а-синуклеин
(б)
70
60
50
40
30
р = 0,05
р = 0,05
тг
т
№С1 МРТР СВЕ СВЕ/МРТР
Рис. 3. Уровень олигомерного а-синуклеина в лизатах ткани стриатума экспериментальных животных при введении №С1 (контроль), СВЕ, МРТР и одновременном введении СВЕ и МРТР: а - пример результатов вестерн-блоттинга; б -сравнительный график.
сравнению с введением МРТР, а также к выраженному разрушению дофаминергических нейронов на 14-й день после инъекции при окрашивании нейронов черной субстанции с использованием антител на тирозингидроксилазу. Оценка уровня дофамина проводилась при помощи метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-селективным времяпро-летным детектором высокого разрешения (ВЭЖХ-МС).
В то же время при проведении поведенческих тестов "Сила хватки" (GRIP-test) и "Открытое поле" [18, 19] как через 5 дней, так и через 14 дней не было выявлено моторных нарушений. Можно предположить, что для выявления подобных изменений требуется более длительный период наблюдения.
Также в настоящем исследовании с использованием ВЭЖХ-МС по разработанному нами ранее протоколу [20, 21] была проведена оценка ферментативной активности GCase и лизосфинголипидов (HexSph) в различных отделах мозга экспериментальных животных (лобная кора, стриатум, черная субстанция).
Было отмечено статистически значимое снижение активности GCase в лобной коре, стриату-ме и черной субстанции мозга мышей в группах СВЕ и СВЕ/МРТР по сравнению с контрольной группой (р = 0,009; р = 0,034; р = 0,013 и р = 0,009; р = 0,021; р = 0,113 соответственно). Был выявлен повышенный уровень HexSph в лобной коре, стриатуме и черной субстанции мозга мышей в группах СВЕ и СВЕ/МРТР по отношению к контрольной группе (р = 0,027; р = 0,034 и р = 0,014; р = 0,034; р = 0,014 соответственно). При этом уровень HexSph в лобной коре и стриатуме мозга мышей в группе СВЕ/МРТР был выше, чем в группе СВЕ (р = 0,043 и р = 0,034 соответственно) (рис. 2).
В настоящем исследовании с использованием метода вестерн-блоттинга было также оценено влияние МРТР и СВЕ на уровень олигомерных и фосфорилированных по сайту Ser129 форм а-синуклеина в клетках стриатума животных на 14-й день после инъекций. Обнаружено статистически значимое повышение уровня олиго-мерного а-синуклеина в лизатах ткани стриату-ма мозга мышей в группах как СВЕ, так и МРТР по сравнению с контрольной группой (р = 0,05) (рис. 3). Нормировка полученных результатов проводилась на общий белок.
В то же время не было выявлено изменений уровня олигомерного а-синуклеина как при сравнении группы СВЕ/МРТР с группой контроля, так и при сравнении групп СВЕ, МРТР и СВЕ/МРТР между собой (р > 0,05). Не было обнаружено изменений в уровне мономерного а-синуклеина, а также его фосфорилированных форм (р > 0,05).
Следует отметить, что к настоящему времени во многих исследованиях на культурах клеток, обработанных ингибитором GCase, на дофа-минергических нейронах, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, на ткани мозга пациентов с БГ и GBA-ассо-циированной БП, а также на генетически модифицированных с мутациями GBA мышах показана связь между снижением активности GCase, повышением уровня лизосфинголипидов и агрегацией а-синуклеина [22, 23]. Исходя из этих данных, всё больше исследователей склоняются к тому, что в основе развития БП у носителей мутаций в гене GBA лежит механизм прямой обратной связи, по которому снижение активности GCase и накопление ее субстратов могут способствовать олигомеризации а-синуклеина, в то время как сами по себе агрегированные формы этого белка могут приводить к снижению активности фермента [24]. В настоящем исследовании на модельных животных нами впервые показано влияние ингибирования функции GCase на накопление олигомерных форм а-синуклеина. Ранее в подобном исследовании было выявлено снижение активности GCase в кортексе, а также отсутствие изменений в стриа-туме уровня общего а-синуклеина при инъекции мышам СВЕ или СВЕ/МРТР; также было выявлено усиление нейродегенерации при одновременном введении нейротоксинов [25]. В другом исследовании авторами показано отсутствие влияния снижения функции лизосом в культивируемых нейронах кортекса мыши на накопление в них нерастворимых и фосфорилированных форм а-синуклеина [26].
В настоящем исследовании на модельных животных мы показали повышение уровня лизо-сфинголипидов (HexSph) в различных отделах мозга при дисфункции лизосом. Следует отметить, что снижение активности GCase может способствовать накоплению в клетке не только ее субстратов глюкозилцерамида и глюкозил-сфингозина, но и галактозилцерамида, который
данный фермент способен расщеплять до галактозы и церамида [24]. Кроме того, GCase может участвовать в переносе глюкозы от глюкозилце-рамида к холестерину с образованием гликози-лированного холестерина [27]. Эти данные свидетельствуют о том, что дисфункция GCase может приводить к накоплению в клетках различных липидов, конъюгированных с глюкозой, нарушая их работу. В последние годы обсуждается прямое влияние лизосфинголипидов на стабилизацию олигомерных форм a-синуклеина [22-24].
Таким образом, полученные в настоящем исследовании данные свидетельствуют о том, что инъекция MPTP модельным животным с дисфункцией лизосом усиливает накопление лизо-сфинголипидов в тканях лобной коры и стриату-ме мозга мышей, приводит к более выраженному снижению дофамина в стриатуме и развитию у животных ускоренной нейродегенерации.
Исследование поддержано грантом РНФ 20-1500262.
Список литературы
1. Emelyanov AK et al. Mutation analysis of Parkinson's disease genes in a Russian data set. Neurobiol. Aging. 2018;71:267.e7-10.
2. Sidransky E, Lopez G. The link between the GBA gene and parkinsonism. Lancet. Neurol. 2012;11(11):986-98.
3. Duran R et al. The glucocerobrosidase E326K variant predisposes to Parkinson's disease, but does not cause Gaucher's disease. Mov. Disord. 2013;28(2):232-6.
4. Mallett V et al. GBA p.T369M substitution in Parkinson disease: polymorphism or association? A meta-analysis. Neurol. Genet. 2016;2(5):e104.
5. Grace ME et al. Analysis of human acid beta-glucosidase by site-directed mutagenesis and heterologous expression. J. Biol. Chem. 1994;269(3):2283-91.
6. Horowitz M et al. The enigma of the E326K mutation in acid b-glucocerebrosidase. Mol. Genet. Metab. 2011;104(1-2):35-8.
7. Migdalska-Richards A et al. Oral ambroxol increases brain glucocerebrosidase activity in a nonhuman primate. Synapse. 2017;71(7):e21967.
8. Pchelina SN et al. Increased plasma oligomeric alpha-sy-nuclein in patients with lysosomal storage diseases. Neurosci. Lett. 2014;583:188-93.
9. Nuzhnyi E et al. Plasma oligomeric alpha-synuclein is associated with glucocerebrosidase activity in Gaucher disease. Mov. Disord. 2015;30(7):989-91.
10. Bezard E, Przedborski S. A tale on animal models of Parkinson's disease. Mov. Disord. 2011;26(6):993-1002.
11. Rudenok M et al. Expression analysis of genes involved in mitochondrial biogenesis in mice with MPTP-induced model of Parkinson's disease. Mol. Genet. Metab. Rep. 2020;23:100584.
12. Alieva AKh et al. Transcriptome profile changes in mice with MPTP-induced early stages of Parkinson's disease. Mol. Neurobiol. 2017;54(9):6775-84.
13. Mingazov ER et al. MPTP mouse model of preclinical and clinical Parkinson's disease as an instrument for transla-tional medicine. Mol. Neurobiol. 2018;55(4):2991-3006.
14. Farfel-Becker T et al. Animal models for Gaucher disease research. Dis. Model. Mech. 2011;4(6):746-52.
15. Manning-Bog A et al. Alpha-synuclein-glucocerebrosidase interactions in pharmacological Gaucher models: a biological link between Gaucher disease and parkinsonism. Neurotoxicology. 2009;30(6):1127-32.
16. Rocha EM et al. Sustained systemic glucocerebrosidase inhibition induces brain a-synuclein aggregation, microglia and complement C1q activation in mice. Antioxid. Redox. Signal. 2015;23(6):550-64.
17. Tanila H et al. Cognitive changes in mice following moderate MPTP exposure. Brain Res. Bull. 1998;45(6):577-82.
18. Lenihan JA et al. Decreased anxiety-related behaviour but apparently unperturbed NUMB function in ligand of NUMB protein-X (LNX) 1/2 double knockout mice. Mol. Neurobiol. 2017;54(10):8090-109.
19. Ковалев Г.И. и др. Сравнение поведения мышей в тестах открытого поля, закрытого и приподнятого крестообразных лабиринтов с помощью факторного анализа. Журн. высш. нервн. деят. им И.П. Павлова. 2019;69(1):123-30.
20. Pchelina S et al. Oligomeric a-synuclein and glucocerebrosidase activity levels in GBA-associated Parkinson's disease. Neurosci. Lett. 2017;636:70-6.
21. Pchelina S et al. Blood lysosphingolipids accumulation in patients with Parkinson's disease with glucocerebrosidase 1 mutations. Mov. Disord. 2018;33(8):1325-30.
22. Galvagnion C et al. Sphingolipid changes in Parkinson L444P GBA mutation fibroblasts promote a-synuclein aggregation. Brain. 2022;145(3):1038-51.
23. Zunke F et al. Reversible conformational conversion of a-synuclein into toxic assemblies by glucosylceramide. Neuron. 2018;97(1):92-107.e10.
24. Do J et al. Glucocerebrosidase and its relevance to Parkinson disease. Mol. Neurodegener. 2019;14(1):36.
25. Mus L et al. Development and biochemical characterization of a mouse model of Parkinson's disease bearing defective glucocerebrosidase activity. Neurobiol. Dis. 2019;124:289-96.
26. Gegg ME et al. Glucocerebrosidase deficiency promotes release of a-synuclein fibrils from cultured neurons. Hum. Mol. Genet. 2020;29(10):1716-28.
27. Marques ARA et al. Glucosylated cholesterol in mammalian cells and tissues: formation and degradation by multiple cellular beta-glucosidases. J. Lipid. Res. 2016;57(3):451-63.
