Нейропротективная роль gdnf в формировании памяти у дрозофилы Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Никитина Е.А., Медведева А.В., Долгая Ю.Ф.,

Савватеева-Попова Е.В.

НЕЙРОПРОТЕКТИВНАЯ РОЛЬ GDNF В ФОРМИРОВАНИИ ПАМЯТИ У ДРОЗОФИЛЫ

Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург, Россия

Проблема разработки терапевтических стратегий для лечения нейродеге-неративных заболеваний человека, развивающихся в пожилом возрасте и сопровождающихся прогрессивной потерей памяти (деменцией), таких, как болезни Альцгеймера, Хантингтона и Паркинсона, становится все более насущной. Однако ее решение осложнено тем, что биохимические и морфологические маркеры этих болезней поддаются изучению только на посмертных образцах мозга пациентов. Поэтому для познания механизмов этиопатологии нейродеге-неративных заболеваний и выработки терапевтических стратегий необходимо привлечение модельных объектов.

В экспериментальных клинических исследованиях показано, что предлагаемые средства лечения в основном паллиативны. Более эффективна доставка в очаг нейродегенерации стволовых клеток-продуцентов нейротрофических факторов (НТФ) при трансплантационной хирургии. В России член-корр. РАН Л.И. Корочкиным (Москва) был предложен новый подход, основанный на использовании хит-шокового (hs) промотора дрозофилы, который реагирует на температуру тела млекопитающих как на шоковый раздражитель и потому приводит к постоянной экспрессии сцепленного с ним гена для какого-либо НТФ (Korochkin et al., 2004). Была проведена успешная ксенотрансплантация нейроэктодермальных эмбриональных клеток трансгенной линии Drosophila, содержащих человеческий ген глиального нейротрофического фактора gdnf, в затылочную область мозга взрослых крыс. GDNF - трофический фактор для развивающихся допаминовых нейронов (дегенерируют при болезни Паркинсона), мотонейронов, норадреналиновых, а также симпатических и парасимпатических сенсорных нейронов. Таким образом, этот фактор роста может быть эффективным при лечении многих нейродегенеративных заболеваний. Использование дрозофилы в качестве модели облегчает познание молекулярногенетических, биохимических и морфологических основ развития нейродегене-ративных процессов, сопровождаемых прогрессивной потерей памяти и открывает возможность поиска стратегий их терапии.

Для выявления роли GDNF в формировании памяти у дрозофилы в норме и при стрессорном воздействии температурным шоком (ТШ) была использована трансгенная линия, несущая под hs-промотором дрозофилы ген человека для GDNF. В качестве контроля использовали линию дикого типа Canton S (CS).

Нами разработана экспериментальная схема, позволяющая оценивать у имаго последствия действия ТШ на разных стадиях развития нервной системы

с использованием поведенческих и иммуно-цитохимических тестов (рис. 1) (Никитина и др., 2003).

0 дни развития

Р 4 1 1 иеталорА о:

У ч

эмбргон личинка шзедкукппка куколка инаго

Т1П2 TUI

тіш

Рис. 1. Схема воздействия ТШ на разных стадиях развития дрозофилы.

Для индукции гена gdnf под hs промотором использовалось температурное воздействие в период формирования структур мозга, ответственных за оль-факторное обучение (ТШ1, конец эмбриональной - начало личиночной стадии, момент формирования грибовидных тел) и формирования памяти (ТШ2, стадия предкуколки, формирование центрального комплекса), а также на стадии имаго за один час до опыта (ТШ). Способность к обучению и сохранению памяти исследовалась при выработке условно - рефлекторного подавления ухаживания. 5-суточного самца тестируемой линии, не имеющего опыта полового поведения, помещали в экспериментальную камеру из оргстекла (диаметр - 15 мм, высота - 5 мм) с оплодотворенной 5-суточной самкой Canton S и оставляли на 30 минут. Обучение и память тестировали сразу (0 мин) и через 3 часа (180 мин) после тренировки, используя новых оплодотворенных самок Canton S в возрасте 5 суток. Контролем служили самцы, не имеющие опыта полового поведения (Kamyshev et al., 2002). Параллельно у взрослых мух перечисленных линий до и после температурного воздействия согласно схеме эксперимента иммуно-флуоресцентными методами проводили выявление GDNF и LIMK1 на срезах мозга.

У CS способность формирования памяти не зависит от стадии действия ТШ. За исключением ТТТТ2, уровень свечения GDNF не меняется при ТШ1 и ТШ как в центральном комплексе мозга, так и зрительной системе (рис. 2).

У GDNF-трансгенных мух в норме и после ТШ1 (формирование грибовидных тел) обнаружены резкие дефекты З-часовой памяти, при этом уровень экспрессии GDNF ниже наблюдаемого у дикого типа. Наоборот, трансгенные мухи, испытавшие ТШ на стадиях имаго или формирования центрального комплекса мозга (ТШ2), обнаруживают сопоставимый с диким типом, уровень формирования 3-часовой памяти и интенсивное проявление GDNF в зрительных долях (ТШ2) и субдоменах центрального комплекса (ТШ) (рис. 3).

ІЬ ЇШ -ш. •»

ИХ^ІЛЧ 1НКІ(1М< *»*Лім*}

■ їшв св'б ■: що «:в-к

ЗД ЦК

■#

Рис. 2. Сопоставление индекса обучения до и после ТШ в линии ЄБ с результатами иммунохимического окрашивания срезов мозга КЬоёатте- конъюгированными антителами к ОЭМР человека. ЗД - зрительные доли, ЦК - центральный комплекс.

вОґ 25'С

вОМ=37'С рШ)

ЗГС (71112}

60ЬЕ37¥С (ТШ)

ЮЭ 80 -60 -40 -

20

0

I о □ ш

га 80 -60 -АО -20 0

врені{ииіф □ 0 □ 180

га

ВО -60 -40 -

20

0

ЕріЧЕ {НИіф

I 0 □ 180

га 80 -60 -АО -

20

О

вреьп(иин|>

■ О □ 180

Рис. 3. Сопоставление индекса обучения до и после ТШ в ОЭКБ-трансгенной линии с результатами иммунохимического окрашивания срезов мозга КЬоёа-тіпе- конъюгированными антителами к ОЭМР человека. # - ИО в отсроченном тесте достоверно ниже, чем в тесте сразу после тренировки (двусторонний тест рандомизации, р<0,05); & - ИО достоверно ниже, чем у линии дикого типа ЄБ (двусторонний тест рандомизации, р<0,05) в аналогичных условиях.

Таким образом, в линии ОЭМР наблюдается, во-первых, корреляция между увеличением уровня ОЭМР и восстановлением способности формирования памяти и, во-вторых, температурозависимое увеличение уровня ОЭМР способствует восстановлению когнитивных функций, накапливаясь в зрительных долях и центральном комплексе. Особого внимания и изучения заслуживает стадия метаморфоза у дрозофилы, так как тепловой шок на этой стадии (ТШ2)

приводит к снижению экспрессии GDNF, как в норме, так и в мутантных линиях.

Из литературных данных известно, что человеческий GDNF не связывается с RET-рецепторами дрозофилы, через которые GDNF запускает внутриклеточные каскады (Abrescia et al., 2005). Однако, согласно нашим данным, возрастание уровня GDNF после температурного воздействия в GDNF трансгенной линии коррелирует с повышением способности к обучению. По-видимому, белки теплового шока (БТШ), которые вырабатываются в ответ на многочисленные стрессорные воздействия, являются компонентами GDNF индуцированного сигнального каскада. Действительно, координированное взаимодействие БТШ70 и БТШ 90 регулирует активность более 100 белков клиентов, в том числе рецепторов стероидных гормонов и многих других сигнальных молекул формируя с ними комплекс с использованием энергии АТФ (Hernandez et al., 2002). Известно, что БТШ 90 распознает киназную петлю RET рецептора, электростатически взаимодействует с ней, что увеличивает время полужизни молекулы и ее активность (Citri et al., 2006). Возможно, участие БТШ в работе RET-рецептора способствует принятию им конформации, при которой осуществляется соединение с лигандом человека с последующим запуском каскада сигнальной трансдукции. Вместе с тем известно, что GDNF способен активировать внутриклеточные каскады и независимо от Ret (Saarma, 2000). Так как при повреждениях мозга разной этиологии наблюдается синтез БТШ, то вероятно увеличением активности RET-рецептора опосредуются нейропротективные эффекты GDNF у различных объектов. Предполагается, что БТШ воздействуют и на процессы приживления трансплантата, поскольку участвуют в регуляции активности рецепторов, через которые GDNF осуществляют свою функцию.

А.М. Савинцев, Ш. Ф. Адылов, А.Б. Смолянинов

КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ АУТОЛОГИЧНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА В ЛЕЧЕНИИ ЗАКРЫТЫХ ПЕРЕЛОМОВ ДЛИННЫХ

ТРУБЧАТЫХ КОСТЕЙ

Северо-Западный государственный медицинский университет

им. И.И. Мечникова, СПБ ГУЗ «Городская Покровская больница»,

OOO « Покровский банк стволовых клеток», Санкт-Петербург, Россия

doctorsm olvm a@inbox. ru

Цель исследования - оценить эффективность трансплантации аутологичных стволовых клеток костного мозга (АСК КМ) в качестве дополнительной процедуры к хирургическому лечению больных с повреждениями опорнодвигательной системы.

Материал и методы

Основу работы составили 8 больных, которые находились на лечении на