CC BY
101
__________________
I БИОМОДЕЛИРОВАНИЕ
Нелинейные мыши Kv:SHK как адекватная модель для исследования эффекта противораковых препаратов (пилотный опыт с альфа-аманитином)
Н.Н. Вейко, А.М. Малашенко |, Е.В. Соколова, Н.Л. Тишкина
Медико-генетический научный центрРАМН, Москва Научный центр биомедицинских технологий РАМН, Москва
Выполнено исследование противораковых свойств малых доз известного токсина бледной поганки, ингибитора РНК-полимеразы II - альфа аманитина. Установлено, что мыши стока Ку^НК являются удобной моделью для исследования противораковых средств, ама-нитин тормозит рост опухолей молочных желез.
Ключевые слова: неинбредные мыши Ку^НК, рак молочных желез, аманитин.
Лабораторные мыши более века являются основным объектом для изучения проблем онкологии: от поиска противораковых средств до исследования причин возникновения опухолей. Наибольший вклад в знания о природе и закономерностях канцерогенеза был получен благодаря выведению высокораковых инбредных линий мышей, затем конгенно-резистентных и в настоящее время — трансгенных и но-каутных. Продолжается выведение новых линий как моделей для тестирования потенциальных противораковых средств [6]. В современных исследованиях канцерогенеза неинбредные мыши практически не используются.
Испытание противораковых препаратов на инбредных и новых линиях мышей требует существенных затрат времени и средств, так как спонтанные опухоли возникают у мышей в возрасте одного года и старше. Работа с перевиваемыми опухолями более эффективна, но в любом случае исследователь имеет дело с одним уникальным генотипом. В то же время известно, что и мыши и люди обладают разной гене-
тической предрасположенностью к опухо-леобразованию, разной чувствительностью к онкогенным вирусам и химическим препаратам. Следовательно, эффект противоракового препарата, установленный на млекопитающих одного генотипа, требуется подтвердить в дополнительных опытах с другими линиями.
Предположили, что для первых опытов по оценке противораковых препаратов целесообразно использовать неинбредных мышей популяции Ку:БНК, размножаемых в филиале НЦБМТ «Андреевка». Эта популяция является наиболее изученной генетически [4, 5], самки подвержены к спонтанному образованию опухолей молочных желез (ОМЖ) с высокой частотой [1]. Технология разведения этих животных и размер популяции (в настоящее время число размножающихся самок более 8 тысяч) позволяют к моменту выведения самок из размножения в возрасте 8 месяцев набирать необходимое количество самок с опухолями.
Материал и методы. Мыши этой популяции генетически гетерогенны, полиморфны по ряду маркерных генов и генов ком-
плекса гистосовместимости Н-2, оказывающих влияние на чувствительность к вирусам MMTV, аналогично человеческой популяции [6]. У мышей Kv:SHK найдены гаплотипы Н-2 — a, d, f определяющие чувствительность к MMTV, и гаплотип b, относительно резистентный. Большинство мышей имеет генотип b/х, где х — неиден-тифицированный рекомбинантный аллель [4, 5]. Популяция существует как закрытая с 1961 года, мыши для ее создания были закуплены в ЧССР в конце 50-х годов и находятся в генетическом равновесии.
Для первого опыта были отобраны самки в возрасте 8 месяцев с ОМЖ, размер (диаметр) которых варьировал от 5 до 15 мм. Две подопытные и контрольные группы состояли из 10 самок, которые были размещены по 5 голов в стандартные пластиковые клетки с автопоилками. Как и в основном стаде, кормление производили, гранулированным комбикормом ПК-120. Токсин альфа-аманитин (AM) давался в питьевой воде, исходя из нормы потребления воды мышью и стремления создать в организме концентрацию AM, которая в культуре клеток проявляла бы определенный биологический эффект.
Токсин AM — самый ядовитый токсин гриба бледная поганка (Amanita falloides), смертельная доза для человека 2030 мг [2]. Основной мишенью этого токсина в клетке является фермент РНК-полимераза II [8]. Ранее в работах Д.М. Спитковского и сотр. [7] было установлено, что очень малые дозы аманитина, которые не ингибируют РНК-полиме-разу II, тем не менее, вызывают перемещение центромерных локусов хромосом в GO-лимфоцитах человека. Эта реакция клетки является необходимым этапом в процессе репарации разрывов ДНК по механизму гомологичной рекомбинации. Было показано, что при мутациях в генах BRCA1 и BRCA2, ассоциированных
с наследственным раком молочной железы у человека, перемещение локусов хромосом в ответ на повреждения в ДНК отсутствует. Однако малые дозы АМ способны индуцировать эту реакцию в клетках больных с мутациями в указанных генах, которые принимают участие в репарации разрывов ДНК, то есть частично восстановить нарушенную функцию. На основании приведенных выше фактов, Д.М. Спитковский высказал предположение, что малые, нетоксичные для организма дозы аманитина могут препятствовать росту опухоли.
Результаты. В таблице дана продолжительность жизни самок в опыте, который длился пять месяцев. Эти данные являются иллюстративными, поэтому статистическая обработка результатов, полученных на малых выборках, не выполнялась. Измерение опухолей производили один раз в месяц, поэтому данные о размерах и темпах роста не совсем точны, так как не измеряли опухоли у погибших до осмотра мышей. Тем не менее, к третьему месяцу наблюдения заметна разница средней величины ОМЖ подопытных групп (21-23 мм) и контрольной (42 мм), в которой в это время осталось 3 живые мыши с ОМЖ. Через три месяца в контроле погибли все мыши с ОМЖ, мыши, получавшие раствор токсина, жили дольше
Выживаемость самок мышей КугЯИК с опухолями молочных желез в опытах с альфа-аманитином
Время потребления AM, месяцы Количество живых опухоленосителей
Доза токсина, нг/день*
0,42 4,2 0 (контроль)
0 10 10 10
1 9 10 9
2 7 7 5
3 7 4 2
4 3 4 0
5 1 2 0
6 1 1 0
* В предположении, что одна мышь выпивает в день 8 мл воды с концентрацией АМ 0,53 нг/мл или 0,053 нг/мл.
на 1-2 месяца. Следовательно, раствор AM, примененный в крайне низких дозах, замедлил рост опухолей. Следует отметить, что в каждой подопытной группе было по 1 мыши, а в контроле — 2 мыши, у которых произошла регрессия опухолей. Вероятно, это обусловлено относительной резистентностью этих животных к MMTV.
Результаты пилотного эксперимента требуют подтверждения с использованием больших выборок животных и более точным контролем темпа роста ОМЖ, но на два вопроса получен положительный ответ. Во-первых, популяция мышей Kv:SHK — удобный и стабильный источник животных с ОМЖ для испытания противораковых средств; во-вторых, препарат AM в малых дозах оказывает тормозящее действие на рост опухолей и, следовательно, заслуживает более глубокого изучения.
Литература
1. Бунто Т.В., Обухова Л.К Частота злокачественных преобразований и продолжительность жизни нелинейных мышей SHK и мышей линии С3НА // Материалы конференции «Использование лабораторных животных в разработке, производстве и контроле биологических медицинских препаратов», с.209-210, 1976.
2. ГорленкоМ.В. Ядовитые грибы рода Амани-
та // В кн. «Жизнь растений». — М.: Просвещение, с. 277-278,1976.
3. Клепиков Н.Н., Хрусталев С.А. Линейные мыши в онкологических исследованиях // Вестник АМН СССР, №9, с. 43-51,1983.
4. КрышкинаВ.П., МалашенкоA.M. Генетическая изменчивость белых нелинейных мышей // Генетика, т.8, № 11, с. 76-82, 1972.
5. Крышкина В.П., Бландова З.К Стабильность генетической структуры рамдомбредных мышей колонии SHK по комплексу генов Н-2 // Генетика, т.13, № 11, с.1955-1959, 1977.
6. Крюкова И.Н. О возможности участия ретровирусов в индукции рака молочных желез человека // В кн. «Канцерогенез» — М.: Медицина, с.351-361, 2004.
7. Спитковский Д.М., Вейко Н.Н., Моиссеева О.С, Ермаков А.В., Терехов С.М. Структурные преобразования хроматина как процесс его самоорганизации в клетках эукариот и проблема репарации ДНК // Радиационная биология. Радиоэкология, т.45, № 5, с. 517534, 2005.
8. Lindell T.J., Weinberg F., Morris T.V., Roeder R.G., Rutter G.V. Specific inhibition of nuclear RNA polymerase II by alpha-amanitin // Science, v. 170, p. 447-449.
NON-INBRED MICE KV:SHK AS AN ADEQUATE MODEL FOR STUDY OF ANTICARCINOGENIC PREPARATIONS EFFECT (PILOT EXPERIMENTS WITH a-AMANITIN)
N.N.Veiko, A.M.Malashenko, E.V.Sokolova, N.L.Tishkina
Research Centre for Medical Genetics RAMS Research Centre for Biomedical Technologies of RAMS, Moscow
The studies of anticancer properties of a-Amanitin in very small quantities were done. Noninbred mice Kv:SHK are a convenient biological model for studying anticancer agents. Amanitin inhibits the growth of mammary glands tumours.
Key words: noninbred mice Kv:SHK, tumours of mammary glands, a-Amanitin.
