Некоторые генетические предикторы развития патологии кишечника

Дорофеев А.Э.; Кирьян Е.А.

сагиттальных срезах у здоровых юношей разных соматотипов. Установлено, что большинство вертикальных размеров тел, межпозвонковых дисков, поясничного отдела позвоночника в целом достоверно больше или имеют тенденции к большим значениям у юношей эктоморфов по сравнению с юношами с другими соматотипами. Поперечные размеры (средняя ширина) тел третьего-четвертого позвонков достоверно больше или имеют тенденции к большим значениям у юношей мезоморфов и юношей со средним промежуточным соматотипом по сравнению с юношами экто- и эндо-мезоморфами.

Ключевые слова: компьютерная томография, поясничный отдел позвоночника, морфометрия, здоровые юноши, соматотип.

Стаття надшшла 2.10.2014 р.

sagittal-sections in healthy young men of different somatotype. Found that most vertical dimensions of bodies, intervertebral discs lumbar spine in general significantly larger or tend to their higher values in boys with boys ectomorph compared with other somatotype. The transverse dimensions (average width) bodies of the third and fourth vertebrae significantly larger or tend to their high values in boys mesomorph and young men with an average intermediate somatotype compared to boys ecto-and endo-mesomorph.

Кеу words: computed tomography, lumbar spine, morphometry, healthy young men, somatotype.

Рецензент Похилько B.I.

УДК 616.34:575.191

НЕКОТОРЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПРЕДИКТОРЫ РАЗВИТИЯ ПАТОЛОГИИ

КИШЕЧНИКА

Целью данного исследования была оценка генетической предрасположенности по мутациям генов толл-подобных рецепторов у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК). Было обследовано 92 пациента с ВЗК. Среди обследованных было 54 (58,7%) больных неспецифическим язвенным колитом (НЯК) и 38 (41,3%) пациентов с болезнью Крона. Всем больным была проведена ДНК-диагностика, включавшая анализ мутаций толл-подобного рецептора 3 - TLR3 (мутация Phe412Leu) и толл-подобного рецептора 4 - TLR4 (мутация Asp299Gly). У большинства - 60 (65,2%) обследованных больных ВЗК имелась генетическая предрасположенность к развитию патологии кишечника. При этом, полиморфизм TLR-3 чаще встречался у больных НЯК, а мутации TLR-4 у пациентов с болезнью Крона. Наличие мутаций толл-подобных рецепторов сочеталось с более тяжелыми формами заболевания и распространенным воспалением в кишечнике.

Ключевые слова: ВЗК, толл-лайк рецепторы, мутации.

В современном мире отмечается значительный рост кишечной патологии. Одним из ведущих механизмов развития как функциональных, так и органических заболеваний кишечника являются генетические мутации [3]. Нарушение сложных генетических, регуляторных, метаболических взаимосвязей приводит к прогрессированию этих заболеваний. Длительный хронический воспалительный процесс может индуцировать возникновение пролиферативных изменений в эпителии кишечника, способствовать появлению неопластических образований.

Эффективность защитных свойств слизистой оболочки кишечника (СОК) является основополагающей в предотвращении возникновения кишечной патологии. Мукозный слой, покрывающий эпителий кишечника, относят к компонентам врожденной и приобретенной иммунной защиты организма. Муцинообразование напрямую зависит от экспрессии генов муцинов. По данным последних исследований, известно не менее 20 независимых генов, отвечающих за синтез муцинов. Различают гельобразующие и мембрано - связанные муцины. Гены, ответственные за выработку гельобразующих муцинов, в основном локализуются на хромосомном локусе 11 p 15 [1, 2]. Гены MUC 2, MUC19 распределяются в тканях кишечника и непосредственно отвечают за выработку муцинов слизи эпителия. Муцины выделяются клетками в зоне повреждения или воспаления, защищая эпителий от патогенных микроорганизмов, механического повреждения, действия протеаз, кислой среды секретируемой клетками, секвестрируют биологически активные вещества [10, 12].

Гены, ответственные за выработку мембрано-связанных муцинов размещаются на таких локусах хромосомы, как 7q22, 1q21, 3q29, 3q13 ,4q24 и др. В толстом и тонком кишечнике выявляются гены MUC1, MUC 3, MUC 4, MUC11, MUC12, MUC13, MUC15, MUC17, MUC20. Находясь внутри клетки эпителия кишечника, гены MUC1 и MUC4, регулируют передачу внутриклеточных молекулярных сигналов. При локализации домена вне клетки, располагаясь над ее поверхностью, являются составной частью гликокаликса, обуславливая про - и антиадгезивные свойства поверхностной мембраны [4, 9]. Гены, отвечающие за муцинообразование, имеют значительный полиморфизм, что связывают с неравным кроссинговером между гомологичными генами. Однако, несмотря на это, сохраняется видо - и тканеспецифичность экспрессии генов муцинов. Полиморфизм этих генов определяет своевременность ответа на изменения в

окружающем мире, появление микробиотических нарушений.

Мутации в генотипе муцина могут являться пусковым механизмом в формировании патологии кишечника. Выявленные изменения в олигосахаридных цепях муцинов при воспалительных заболеваниях кишечника (ВЗК), злокачественной патологии толстой кишки, непосредственно связывают с генетическими изменениями. При появлении аденомы толстой кишки, ген MUC 2 имеет усиленную экспрессию, которая прогрессивно увеличивается при канцероматозных изменениях в случае муцинопродуцирующей опухоли, и снижается при образовании немуцинозной опухоли. Стимуляция гена MUC 3, регулирующего продукцию таких цитопротекторных веществ как аргинин, глютамин, полиамины, способствует репарации эпителия кишечника. При наличии мутаций гена MUC 3 могут появляться структурные изменения слизистой кишечника за счет нарушения репаративных свойств эпителия. Присоединение дисбиоза может провоцировать возникновение воспаления в СОК и приводить к хронизации заболевания.

MUC1 является первым идентифицированным муцином, который кодируется геном, расположенным в 21-ом локусе длинного плеча 1-й хромосомы. По данным некоторых исследователей, выявлено несколько десятков вариантов генетических полиморфизмов MUC1, влияние которых было описано при доброкачественных и злокачественных изменениях эпителия, ВЗК. Ген MUC1 способствует устойчивости эпителия при инфекционной агрессии. Кроме этого, ген регулирует передачу сигнала о появлении инфекции с поверхности эпителия внутрь на сигнальные системы [7, 8].

Увеличение экспрессии гена MUC1 тесно связаны с Toll-подобными рецепторами и транскрипционным фактором NF-kB (kappa B - «каппа-би») [11]. В результате усиленной экспрессии происходит обратное подавление нисходящего сигнального каскада Toll-подобных рецепторов, приводящее к снижению секреции провоспалительных цитокинов, выраженности острой фазы воспаления. Перед повышением содержания муцина, происходит активация транскрипционных факторов - NF-kB, Sp1, STAT, которые взаимодействуют с промотором гена MUC1. Усилению экспрессии MUC1 способствуют фактор некроза опухолей альфа (TNF - а), гамма - интерферон (ИФН - у) [6] и активные формы кислорода. Таким образом, увеличения экспрессии MUC1 в эпителии имеет провоспалительный характер при инфекционном поражении, усиливает устойчивость эпителиального барьера. Кроме этого, отмечается способность гена MUC1 инициировать реакции гуморального и Т - клеточного иммунитета [1].

Некоторые авторы отмечают роль гена MUC1 в развитии опухолевого процесса. MUC1 экспрессируется клетками большинства эпителиальных злокачественных опухолей человека, в том числе и желудочно-кишечного тракта.Так, при деполяризованном распределении MUC1 в клетках опухоли, выявлено неблагоприятное течение колоректального рака (КРР). А повышение уровня экспрессии гена MUC1 коррелирует со степенью дифференцировки рака кишечника, и усилением метастатических процессов [5], что можно использовать для прогнозирования течения заболевания. Таким образом, гены муцинов играют важную роль в поддержании стабильности работы не только кишечника, но и гомеостаза всего организма, с учетом воздействия на иммунологический статус, участия в распознавании инфекционных патогенов, регуляции воспалительной реакции, влияния на трансформацию и прогрессирование неопластических процессов.

Для выявления патогенных компонентов, которые запускают ответные иммунные реакции, в организме имеются сигнальные паттернраспознающие рецепторы. Именно толл-подобные рецепторы (TLR), которые относятся к этому классу, располагаясь на апикальной мембране эпителия кишечника, дают возможность организму своевременно среагировать на чужеродные агенты и запустить защитный иммунный и воспалительный ответы через активацию NF-kB. Некоторые авторы развитие атеросклероза, аллергических, аутоиммунных, инфекционных, а по некоторым данным и онкологических заболеваний связывают с полиморфизмом генов TLR. Так, нарушения структуры паттернраспознающего домена TLR 4, появление полиморфизма Asp299Gly Thr399Ile, взаимосвязаны с риском возникновения ВЗК. Другие исследователи возникновение этих аминокислотных полиморфизмов связывали со стриктурными осложнениями при болезни Крона. Помимо этого, доказано, что полиморфизм гена TLR 4 Asp299Gly изменяет устойчивость макроорганизма к грамотрицательным бактериям, тем самым способствуя возникновению дисбиоза.

При появлении единичных нуклеотидных замен в гене TLR 2, изменяется восприимчивость различных инфекционных агентов. Мутационный полиморфизм в гене TLR 2 Arg753Gln увеличивает склонность к появлению осложненного течения инфекций, обусловленного грамположительными бактериями, вплоть до развития септического состояния.

Появление в гене TLR 9 единичных нуклеотидных замен, имеет корреляцию с опухолевым ростом, а полиморфизмы - 14S6 С/Т, 1174 A/G с повышенным риском возникновения неспецифического язвенного колита. Данные изменения выявляют как в LRR - домене, так в TIR -домене передающем сигналы. Полиморфизм в генах TLR5 Arg392Stop и TLR б Ser249Pro также связывают с возникновением ВЗК. Следовательно, генетические мутации TLR могут способствовать появлению воспалительных реакций в эпителии кишечника, тем самым инициируя структурные изменения клеток, влияя на развитие органической патологии. Своевременное выявление полиморфизма генов TLR может помочь в коррекции лечения.

Целью работы была оценка генетической предрасположенности по мутациям генов толл-подобных рецепторов у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника.

Материал и методы исследования. Было обследовано 92 пациента с ВЗК. Среди обследованных было 54 (5S,7%) больных НЯК и 3S (41,3%) пациентов с болезнью Крона. Всем больным была проведена ДНК-диагностика в отделе молекулярно-генетических исследований ЦНИЛ ДонНМУ им. М. Горького, включавшая анализ мутаций толл-подобного рецептора 3 -TLR3 (мутация Phe4l2Leu) и толл-подобного рецептора 4 - TLR4 (мутация Asp299Gly). ДНК выделена из лейкоцитов цельной крови с помощью реагента «ДНК-экспресс-кровь». В работе были использованы диагностические тест-систем «SNP-экспресс», разработанные НПФ Литех.

Анализ полиморфных ДНК-локусов осуществляли методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК с последующим электрофоретической детекцией. Реакция проводилась при следующих условиях: первичная денатурация при 93°С в течение 1 мин, после которой следовали 35 циклов, состоящих из денатурации при 93°С в течение 10 сек, отжига праймеров при б4°С в течение 10 сек, элонгации при 72°С в течение 20 сек. ПЦР проводили на амплификаторе Gene Amp® PCR System 2400 (Applied Biosystems). Анализ амплифицированных фрагментов производили путем электрофореза в 3%-ном агарозном геле, окрашенном в бромистом этидии. Визуализацию результатов проводили в ультрафиолетовом трансиллюминаторе "TFX-20.M" ("Vilber Lourmat", Франция).

Результаты исследования и их обсуждение. Полиморфизм TLR-3, TLR-4 наблюдался более, чем у половины обследованных больных ВЗК - б0 (б5,2%) пациентов. Мутация TLR-3 (Phe4l2Leu) встречалась чаще, чем TLR-4, и отмечалась у 37 (41,1%) больных ВЗК. Преобладающее количество мутаций были гетерозиготными. Полные мутации (Leu/Leu) были отмечены только у б (1б,2%) обследованных пациентов ВЗК. Частота встречаемости точечной мутации TLR-3 отличалась в зависимости от типа ВЗК. Гетерозиготные мутации (Phe/Leu) преобладали среди больных НЯК - 24 (б4,9%). Неполные мутации встречались с меньшей частотой при БК - 13 (35,1%) пациентов. Гомозиготные мутации TLR-3 (Leu/Leu) также преобладали среди пациентов с НЯК - 4 (10,S%), по сравнению с больными БК - 2 (5,4%) пациентов, однако данные отличия не были достоверными. Таким образом, полиморфизм TLR-3 чаще наблюдался у больных НЯК, что может свидетельствовать о преобладании избыточного ответа на бактериальные полисахариды как облигатной, так и факультативной микрофлоры кишечника, запускающего каскад провоспалительных цитокинов (TNF-a, IL-б, IL-12), играющих ключевую роль в формировании ВЗК.

Мутация TLR-4 (Asp299Gly) у обследованных больных наблюдалась несколько реже, чем TLR-3, и встречалась только у 23 (25,0%) пациентов ВЗК. У всех больных отмечались только гетерозиготные мутации TLR-4 (Asp/Gly). Полиморфизм TLR-4 превалировал у больных БК - 15 (б5,2%), в отличие от больных НЯК, у которых данная мутация наблюдалась лишь у S (34,S%) пациентов. Следовательно, снижение или отсутствие способности адекватного распознавания бактериальных липополисахаридов вследствие мутации TLR-4 более характерно для больных БК. Это приводит к снижению ответа на бактериальный эндотоксин грамотрицательной флоры, индукции и хронизации воспалительного процесса в кишечнике. Возможно, это объясняет тот факт, что нарушение микробиоценоза толстого кишечника за счет патогенной микрофлоры, кишечные инфекции предшествуют развитию, а также провоцируют обострения у пациентов с болезнью Крона чаще, чем у больных НЯК.

Генетическая предрасположенность с сочетанной мутацией TLR-3 и TLR-4 наблюдалась только у 9 (9,S%) больных ВЗК. При этом сочетанные мутации встречались с равной частотой, как у больных НЯК, так и БК, что, возможно, связано с небольшим количеством наблюдений.

Следует отметить, что у пациентов с наличием генетической предрасположенности -мутациями толл-подобных рецепторов заболевание протекало тяжелее и имело более распространенные формы поражения. У пациентов с НЯК сочетанные мутации TLR-3 и TLR-4

выявлены только у больных с распространенными формами заболевания: левосторонним и тотальным НЯК, а среди пациентов с дистальними формами НЯК сочетанные мутации не выявлены ни у одного больного. В группе пациентов с болезнью Крона сочетанные мутации толл-подобных рецепторов преимущественно обнаруживались у больных с пенетрирующей или стенозирующей формой заболевания, что обуславливало более тяжелое течение и предопределяло особенности терапии. Кроме этого, у больных с наличием мутаций толл-подобных рецепторов достоверно чаще встречались внекишечные провления ВЗК, особенно у пациентов с наличием точечных мутаций ТЬЯ-4 и сочетанных мутаций ТЬЯ-3 и ТЬЯ-4 (р<0,05).

У большинства обследованных больных ВЗК имелась генетическая предрасположенность к развитию патологии кишечника. При этом, полиморфизма ТЬЯ-3 чаще встречался у больных НЯК, а мутации ТЬЯ-4 у пациентов с болезнью Крона. Наличие мутаций толл-подобных рецепторов сочеталось с более тяжелыми формами заболевания и распространенным воспалением в кишечнике.

1. Дорофеев А. Э. Изменения экспрессии MUC2, MUC3, MUC4, TFF3 в слизистой оболочке толстого кишечника у больных неспецифическим язвенным колитом / А. Э. Дорофеев, И. В. Василенко, О. А. Рассохина // Гастроентеролопя. -2013. - №1 (47).

2.Кармакова Т. А. Муцин MUC1 как биологический маркер в морфологических и серологических исследованиях у онкологических больных: автореф. дис. на здобуття наук. ступеня доктора биол. наук.: спец. «онкология» 14.01.12 / Т. А. Кармакова - М., - 2014. - 27 с.

3.Фадеенко Г. Д. Достижения генетики и геномики в гастроэнтерологии / Г. Д. Фадеенко, А. С. Попович // Здоров'я Украши. - Тематичний номер, березень - 2014. - С. 20 - 21.

4.Albrecht H. 3rd. MUC1 and MUC4: switching the emphasis from large to small / H. Albrecht, K. L. Carraway // Cancer. Biother. Radiopharm. - 2011 Vol. 26(3). P.261-271.

5.Inagaki Y. Clinicopathology of sialomucin: MUC1, particularly KL-6 mucin, in gastrointestinal, hepatic and pancreatic cancers / Y. Inagaki, H. Xu, M. Nakata [et al.] // Biosci. Trends. - 2009. Vol. 3(6). P.220-232.

6.Kyo Y. Antiinflammatory role of MUC1 mucin during infection with nontypeable Haemophilus influenzae / Y. Kyo, K. Kato, Y.S. Park [et al.] // Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. - 2012. Vol. 46(2). P.149-156.

7.McGuckin M. A. Muc1 mucin limits both Helicobacter pylori colonization of the murine gastric mucosa and associated gastritis / M. A. McGuckin, A. L. Every, C. D. Skene [et al.] // Gastroenterology. - 2007. Vol. 133(4). P.1210-1218.

8.McAuley J. L. MUC1 cell surface mucin is a critical element of the mucosal barrier to infection / J. L. McAuley, S. K. Linden, C. W. Ping [et al.] // J. Clin. Invest. - 2007. Vol. 117(8) P 2313-2324.

9.Mc Guckin M. A. Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel diseases / M. A. Mc Guckin, R. Eri, L. A. Simms [et al.] // Inflam. Bowel Dis. - 2009. - №15. - P. 100 - 113.

10. Rubin B.K. Mucus and mucins // B.K. Rubin Otolaryngol. Clin. North. Am. - 2010. - Vol. 43,(1). - P.27-34.

11. Ueno K. MUC1 mucin is a negative regulator of toll-like receptor signaling / K. Ueno, T. Koga, K. Kato [et al.] // Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. - 2008. Vol. 38(3). P.263-268.

12. Williams O.W. Airway mucus: From production to secretion / O. W. Williams, A. Sharafkhaneh, V. Kim [et al.] // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. - 2006. - Vol.34 (5). - P.527-536.