CC BY
11© Коллектив авторов, 2014 УДК 616.5-006.81-033.2-092:[612.6.05:577.21
НЕКОТОРЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ МЕТАСТАТИЧЕСКОЙ МЕЛАНОМЫ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА
Е.Г. Зенит-Журавлева, А.А. Лушникова, доктор биологических наук, Д.А. Понкратова, И.В. Цыганова, кандидат биологических наук, И.Н. Михайлова, доктор медицинских наук, Е.А. Черемушкин, кандидат медицинских наук, А.С. Вихрова, Е.М. Трещалина, доктор медицинских наук, профессор, Л.В. Демидов, доктор медицинских наук, профессор, Н.Н. Мазуренко, доктор биологических наук, профессор
Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Российская Федерация, 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24 E-mail: LAN21@yandex.ru
Введение. Частота меланомы кожи (МК) в мире постоянно растет. Диагностика и лечение МК на ранних стадиях позволяет увеличить 5-летнюю выживаемость пациентов до 90%. Эту проблему можно решить с помощью персонализированной таргетной терапии, направленной на ключевые сигнальные пути и сигнальные молекулы, к которым относятся онкогены BRAF/NRAS/KRAS и белки с шаперонной активностью нуклеолин/С23 (ген NCL) и нуклеофозмин/В23 (ген NPM).
Цель исследования — анализ структурных изменений генов NCL и NPM, а также наиболее частых мутаций генов BRAF/NRAS/ KRAS в клинически охарактеризованных образцах метастатической МК и в подкожных ксенографтах МК человека, которые могут служить моделями для исследования механизмов канцерогенеза и эффективности таргетной терапии.
Методы. Структурные изменения в генах NCL и NPM определяли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) всех ээкзонов и прилегающих интронов, последующего конформационно-чувствительного ээлектрофореза ампликонов в ПАЛ! и их прямого секвенирования; мутации генов BRAF/NRAS/KRAS — с помощью ПЦР и последующего прямого секвенирования ПЦР-продуктов. Проанализировано 30 образцов метастатической МК различных гистологических типов, 2 образца ксенографтов МК и 30 образцов ДНК доноров (группа контроля).
Результаты. В образцах МК впервые обнаружен ряд структурных изменений генов NPM и NCL, кодирующих основные аргиро-фильные белки нуклеофозмин/В23 и нуклеолин/С23. Эти изменения выявлены в нескольких экзонах и прилегающих к ним интронах генов NCL/NPM, часть из них специфична для МК и не обнаруживается в норме (группа контроля). Комплекс генетических изменений, затрагивающих NCL, NPM, BRAF, NRAS/KRAS и, возможно, другие локусы, создает генетическую нестабильность и молекулярную неоднородность опухоли, порождающие агрессивное течение заболевания и трудности терапевтического воздействия на МК. Обсуждаются возможные механизмы активации ключевых сигнальных путей с участием изучаемых белков и онкогенов.
Заключение. Выявлен и охарактеризован комплекс генетических изменений в метастатической МК человека различных гистологических типов. Это важно для изучения механизмов индукции и прогрессии МК, а также открывает перспективы для создания молекулярно-направленных препаратов широкого спектра действия.
Ключевые слова: метастатическая меланома кожи, нуклеолин/С23, нуклеофозмин/В23, клеточные онкогены, сигнальные пути, таргетная терапия
SEVERAL GENETIC FEATURES OF HUMAN METASTATIC CUTANEOUS MELANOMA E.G. Zenit-Zhuravleva, A.A. Lushnikova, D.A. Ponkratova, I.V. Tsyganova, I.N. Mikhailova, E.A. Cheremushkin, A.S. Vikhrova, E.M. Treschalina, L.V. Demidov, N.N. Mazurenko N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Kashirskoe shosse, 24, Moscow, Russian Federation, 115478
Introduction. The prevalence of human cutaneous melanoma (CM) in the world is constantly rising. Diagnostics and treatment of CM at the early stages allows to increase the 5-year patient survival up to 90%. This problem can be solved with personalized therapy targeted to the key signaling pathways and driver molecules, involving BRAF/NRAS/KRAS and such argyrophilic proteins with chaperone activity as nucleolin/C23 (encoded by NCL gene) and nucleophosmin/B23 (encoded by NPM gene).
Objective. Analysis of NCL/NPMgene structure and the most common BRAF/NRAS/KRAS gene mutations in the clinically characterized samples of the metastatic CM and subcutaneous human CM xenograftsas, considered as a model for study of the mechanisms of carcinogenesis and effectiveness of targeted therapy, have been done.
Methods. Some changes in NCL/NPMgene structure were determined by PCRfor all gene exons and adjacent introns followed by conformation-sensitive electrophoresis and direct sequencing of PCR products. Mutations of BRAF/NRAS/KRAS genes were detected by PCR followed by direct sequencing of PCR products. 30 CM samples of different histological types, 2 human CM xenografts and 30 donor DNA samples (control group) were analyzed.
Results. A number of structural alterations for NPM/NCL genes encoding the main argyrophilic proteins nucleophosmin/B23 and nucleolin/ C23 were found. Some of the alterations were revealed in several exons and adjacent introns of NCL/NPM genes. Some combinations of the changes and polymorphic variant in exon 3 of NCL gene were specific for CM and were absent in normal tissue (control group of donors). The complex genetic alterations affecting NCL/NPM, BRAF/NRAS/KRAS genes (and alleged loci), might create genetic instability and molecular heterogeneity of CM that generate tumor aggressiveness and treatment inefficiency. A possible mechanisms for activation of the key signaling pathways, including described oncogenes and proteins have been discussed.
Conclusion. A complex genomic alterations in metastatic CM of different histological types were found and characterized. This may be important for mechanisms of CM induction and progression, and for prospective creation of targeted drugs with wide spectrum of the action.
Key words: metastatic cutaneous melanoma, nucleolin/C23, nucleophosmin/B23, cellular oncogenes, signaling pathways, targeted therapy
ВВЕДЕНИЕ
Меланома кожи (МК) — злокачественная опухоль, возникающая в результате неопластической трансформации меланоцитов и меланобластов. В структуре онкологической заболеваемости МК составляет около 2%, однако эпидемиологические данные указывают на увеличение частоты заболеваемости МК. В России за последние 10 лет частота МК выросла на 21,38% у женщин и на 24,34% — у мужчин, составив в среднем 25,4 на 100 тыс., причем ежегодно заболевают более 7700 пациентов, из них около 50% умирают [1].
При неблагоприятном прогнозе метастатической МК однолетняя выживаемость больных с изолированным поражением кожи, подкожной клетчатки и лимфатических узлов составляет 59%, при поражении легких — 57%, при поражении других внутренних органов или при повышении уровня лактатдегидрогеназы — 41%. МК метастазирует во многие органы, часто затрагивая желудочно-кишечный тракт. Нередко наблюдаются метастазы МК в головной мозг; выживаемость таких пациентов не превышает 4 мес. Именно поражение центральной нервной системы обусловливает летальный исход у 50% больных с метастатической МК.
Для МК характерны агрессивное клиническое течение, высокая метастатическая активность и неблагоприятный прогноз. Наиболее важными прогностическими критериями МК являются гистологический тип, толщина опухоли по Бреслоу и ее изъязвление, а также уровень инвазии по Кларку и митотический индекс. В зависимости от клинико-гистологических вариантов МК 5-летняя выживаемость больных варьирует от 58 до 85%. Улучшение выживаемости при МК связывают прежде всего с ранней диагностикой опухолей, расширением спектра иммуно-гистохимических и молекулярно-генетических маркеров, а также разработкой новых методов лечения, включая молекулярно-направленную (таргетную) терапию [2, 3].
Диагностика МК на ранних стадиях (1—11) позволяет увеличить 5-летнюю выживаемость пациентов до 90%. В последнее время для этой цели используется ряд специфичных маркеров, продуцируемых в клетках МК. Более чем в 80% случаев меланомы кожи происходит аберрантная активация МАРК-сигнального пути на уровнях RAS-RAF-MEK-ERK вследствие мутаций в соответствующих генах (рис. 1). Мутации гена БЯЛГ, локализованного на хромосоме 7д34 и кодирующего серинтрео-ниновую киназу, обнаруживают в опухолях у 50—70% больных метастатической МК. К настоящему времени известно >100 соматических мутаций гена БЕЛ!". В большинстве случаев (до 90% всех мутаций) — это нуклео-тидная замена с.1799Т>А в экзоне 15, которая приводит к замещению валина на глутаминовую кислоту в позиции 600 полипептида (V600E/БRAF)). Активация МАРК/ ЕКК-еигнального каскада, опосредованная мутацией БЕЛ!, играет ключевую роль в клеточной пролиферации и прогрессии МК. Этот путь активируется также за счет мутаций гена NRЛSв кодоне Q61R\K\L экзона 3, которые обнаруживаются в 15—30% случаев МК. Мутации генов БЕЛ! и NRЛS взаимно исключающие, они выявляются также в доброкачественных (неозлокачествленных) не-
вусах, что свидетельствует о сложном механизме трансформации меланоцитов с участием ряда генов.
В отсутствие драйверных мутаций генов NRAS или BRAF в МК обнаруживаются мутации генов KIT, PDGFRA, а также изменения генов, участвующих в регуляции клеточного цикла: амплификация CCND1 или CDK4, делеция гена-супрессора опухолевого роста CDKN2A(p16) и другие нарушения. Кроме соматических активирующих мутаций генов BRAFи NRAS, с помощью секвенирования экзона опухолевых клеток в МК идентифицированы мутации гена RAC1 и терминальные мутации в генах предрасположенности к МК ВАР1 и MITF, а также ряд других генетических нарушений, приводящих к активации ключевых сигнальных путей [4].
Достижения в изучении механизмов канцерогенеза МК привели к разработке новых методов лечения, включая молекулярно-направленную (таргетную) терапию. Перспективными оказались таргетные препараты, блокирующие сигнальные каскады, активированные в результате мутаций генов BRAF, NRAS, KIT, EGFR, CDK2a, PTEN (см. рис. 1) [5, 6]. Например, молекулярно-направленный препарат вемурафиниб на 63% снижает риск летального исхода (p<0,0001; ОР=0,37) и на 76% — риск ухудшения клинического течения МК, увеличивая выживаемость без прогрессирования. Показано, что вемурафениб активен в отношении всех замен в кодоне V600E\K [7, 8]. Однако ингибиторы BRAF могут индуцировать инвазию и метаста-зирование клеток с мутациями RAS за счет реактивации MEK-ERK-сигнального пути и развития резистентных к терапии опухолей, что требует комбинированного подхода к таргетной терапии МК [9]. В частности, предложена схема комбинированной терапии опухолей с мутациями в гене BRAFингибиторами CRAF, BRAF и МЕК [10]. В клетках меланом, резистентных к комбинированной терапии ингибиторами RAF-MEK, были выявлены нарушения циклического аденозинмонофосфат (цАМФ)-зависимого меланоцитспецифичного сигналинга, включающего рецепторы аденилатциклазы, а также реактивации белка CREB, связывающего PtkA и цАМФ, и экспрессия c-FOS, NR4A1/A2 и MITF. Это говорит в пользу активации целых групп онкогенов в клетках меланоцитарного ряда и необходимости терапии, резистентной к таргетным препаратам меланомы, нацеленной на все ключевые сигнальные пути и хроматин [11]. Показаны низкий уровень экспрессии фосфорилированного CRAF и высокий — цАМФ в чувствительных к вемурафенибу клеточных линиях мела-номы, а также высокий уровень экспрессии фосфоCRAF, но низкий уровень цАМФ — в резистентных линиях. Поэтому ингибирование CRAF через активацию цАМФ позволило бы преодолеть резистентность к вемурафенибу меланом с генотипами (WT)BRAF/(WT)NRAS [12]. Однако около 60% EGFR-позитивных меланом, резистентных к ингибиторам BRAF-MEK-киназ, могут вновь приобрести чувствительность к таргетной терапии, поскольку в гетерогенной популяции клеток меланомы при отсутствии этих ингибиторов резистентные клетки с высоким уровнем экспрессии EGFR и TGFp не имеют пролифера-тивных преимуществ перед клетками, чувствительными к ингибиторам [13].
Разработка альтернативных стратегий лечения МК зависит от дальнейшего анализа механизмов индукции МК и создания новых моделей для изучения патогенеза опухоли.
В качестве потенциальных терапевтических мишеней большой интерес представляют многофункциональные аргирофильные белки ядрышковых организаторов ну-клеолин/С23 (кодируется геном ИСЬ) и нуклеофозмин/ В23 (кодируется геном ИРЫ). Эти белки локализованы в ядрах клеток и в меньшей степени — в цитоплазме. Одной из важнейших функций С23/В23 является контроль прохождения клеткой сверочных точек (чекпойнтов). Чем выше уровень этих белков в клетке, тем быстрее клетка проходит клеточный цикл, медленнее дифференцируется и наоборот. Нуклеолин и нуклеофозмин регулируют такие ключевые процессы, как биогенез рибосом, транскрипция и трансляция, клеточный сигналинг, пролиферация и апоптоз. В основе этой регуляции лежит межмолекулярное взаимодействие В23 и С23 с множеством белков, включая микро-РНК и белки-супрессоры BRCA1/2 и Р53 [14]. Гли-кированные молекулы С23 входят в состав внеклеточных мембранных белковых комплексов с молекулярной массой 500 кДа, включающих также 2 Wnt-родственных белка, аутоантиген Ки86, распознающие сигнал субъединицы SRP68/72 рецептора комплемента дСЦ^, и рибосомные белки S4/S6, а также пептиды МНС класса I. Молекулы С23 обеспечивают стабильность структуры и функционирование этого комплекса, передачу сигналов клеточной адгезии, миграции, инвазии, регуляцию ангиогенеза и апоптоза, клеточной пролиферации, а также транспорт ионов Са2+ и ряд других функций. Рецепторный С23 считается перспективной молекулярной мишенью для таргет-ной терапии МК, а также для иммунодиагностики других злокачественных опухолей. Это — основной медиатор для различных лигандов, ассоциированных с онкологической и другой патологией [15—17].
Нуклеофозмин/В23 также является многофункциональным фосфопротеином, в клеточном ядре преобладает полноразмерная изоформа этого белка. От продукции В23 в клетке напрямую зависят транспорт гистонов и сборка хроматина. Резкое изменение уровня В23 индуцирует нарушение митоза, геномную нестабильность и развитие опухолей. В опухолях нередко наблюдаются повышенный уровень экспрессии гена NPM1 и тесное взаимодействие нуклеофоз-мина/В23 с белками — продуктами онкогенов и генов-супрессоров с-Ро$, с-Ыус, р53 ЯЬ, К-Яа$ [18]. Локализация нуклеофозмина/В23 в ядрышках и клеточном ядре, его взаимодействие с множеством регуляторных белков и участие в важнейших клеточных функциях указывают на роль нуклео-фозмина как атипичного опухолевого супрессора и возможную мишень для таргетной терапии опухолей. Внеядерные молекулы нуклеофоз-мина и нуклеолина взаимодействуют как с кластером ГДФ-KRAS, так
Вемурафениб
Дабрафениб
Сорафениб
и с ГТФ-KRAS. Однако после активации рецептора фактора роста фракция ГТФ-KRAS нарастает, что приводит к гиперактивации МАРК-сигнального пути [19]. С мутациями в экзоне 12 гена NPM ассоциирован фенотип острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), с транслокацией NPM-ALK — анапластическая крупноклеточная лим-фома. О структуре генов NCL и NPM и их экспрессии в клетках метастатической МК пока данных нет.
Цель настоящей работы — анализ структурных изменений генов NCL и NPM, а также мутаций генов BRAF и NRAS в клинически охарактеризованных образцах метастатической МК и в подкожных ксенографтах МК человека, которые служат моделями для изучения механизмов канцерогенеза и эффективности таргетной терапии.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В выборке обследованных было 30 больных МК, наблюдавшихся в НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН: 18 женщин (возраст в момент постановки диагноза 41 год — 78 лет; средний возраст — 56,0+16,0 года) и 12 мужчин (возраст соответственно 23 года — 68 лет; в среднем — 41,0+19,0 года). Среди гистологических типов наиболее частыми были беспигментные эпителиоидно-клеточные МК (у 16 из 30), пигментные эпителиоидноклеточные (у 4 из 30), МК смешанного типа (у 3 из 30), пигментная узловая МК (у 3 из 30), в единичных случаях — пигментные и беспигментные ве-ретеноклеточные МК. У 2 обследованных обнаружены первично множественные злокачественные образования (ПМЗО). У пациента Б., 68 лет, была диагностирована беспигментная веретеноклеточная МК передней грудной стенки с множественными метастазами в лимфатических узлах с мутацией BRAFV600E, а также рак толстой кишки (РТК) и рак правой почки (РП). У больной Ш., 75 лет, диагностирована эпителиоидно-клеточная МК дистальной фаланги IV пальца кисти с метастазами, в анамнезе — дис-семинированный рак легкого (РЛ), аденокарцинома с де-лецией в экзоне 19 EGFR (проводилась таргетная терапия ирессой) и гормонопозитивный протоковый рак правой молочной железы (РМЖ, проводилась мастэктомия).
Нилотиниб -! рецептор
ниб
*NRAS
RAF265
Селуметиниб Траметиниб
COT
Им™иНбб с-KIT Ц Тирозинш^ый Нилотиниб -Дазатиниб
GTP „
7— •.., PTEN--*<;fi PI3K
BRAF CRAF |
У
АКТ
mTOR
ERK
Fl
Темсиролимус Эверолимус
Пролиферация и выживание клеток
Рис. 1. Схема действия основных таргетных препаратов на ключевые сигнальные пути, активированные в опухолевых клетках МК
Исследовали образцы ДНК, выделенной из 30 метастазов МК и 1 первичной МК, полученных от 30 пациентов с МК различной локализации, а также из 2 подкожных ксенографтов (К) штаммов Mel-6 и Mel-7, полученных при пересадке под кожу бестимусных мышей опухолей от 2 больных МК. ДНК выделяли (из свежей опухолевой ткани и в 1 случае — из архивного материала) с помощью набора НК-Проба-Плюс (ООО «ДНК-технология», Москва) по инструкции производителя. На матрице геномной ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) амплифицировали последовательности генов, кодирующих С23/В23. Для исследования структурных изменений генов NCL/NPM были подобраны пары праймеров ко всем кодирующим участкам и прилегающим интрон-ным последовательностям и соответствующие условия ПЦР (табл. 1). Полученные ПЦР-продукты анализировали с помощью конформационно-чувствительного электрофореза и последующего секвенирования измененных вариантов в ООО «Генотех» на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 500. В качестве контрольных образцов использовали ДНК, выделенную из периферической крови здоровых доноров в сопоставимой по возрасту и полу группе (n=30).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В исследуемых образцах МК мы обнаружили различные структурные изменения генов NPM/NCL: однону-клеотидные замены, интронные структурные варианты и новую терминальную делецию 3 нуклеотидов в экзоне 4 гена NCL. Кроме того, были выявлены уже известные полиморфные варианты — ПВ (база данных Ensembl
genome browser/ncbi.nlh.nih.gov/). Многие из указанных изменений встречались в изученных образцах опухолей неоднократно и были представлены несколькими типами (табл. 2). Сравнение типов структурных изменений в образцах МК и в контроле позволило выявить несколько общепопуляционных ПВ, а также структурные изменения генов NPM/NCL и их комбинации, которые не обнаруживаются в контроле (рис. 2).
Изменения в структуре гена NPM
Ген NPMлокализован на хромосоме 5q35.1, содержит 12 экзонов и 11 интронов протяженностью 23181 п.н., известно более 12 псевдогенов. Наряду с полноразмерным белком, молекулы которого содержат 294 аминокислотных остатка, в результате альтернативного сплайсинга образуются еще 2 изоформы В23. Молекула В23/нуклео-фозмина содержит уникальные области, ответственные за олигомеризацию, шаперонную активность, связывание с нуклеиновыми кислотами и белками. Мы выявили структурные изменения гена NPM в 22 из 30 проанализированных образцов МК. В большинстве случаев они были локализованы в интронах 5 и 6 (всего 17/30) и представлены сочетанием 2 однонуклеотидных замен IVS5 31A/G + IVS642G/A; в интронах 6 и 8 (8/30 и 6/30 соответственно), представленных однонуклеотидными заменами IVS6-39A/G + (-42)A/G и IVS8 -63A/G (см. табл. 2). Аналогичные интронные варианты были обнаружены в контроле с сопоставимой частотой (рис. 2). С учетом относительно высокой частоты выявленных генетических изменений, а также их обнаружения в опухолях другой локализации (ксенографты РТК, РЛ и РП, собственные данные) можно предполагать функциональную значимость описан-
Таблица 1
СПИСОК ПРАЙМЕРОВ И УСЛОВИЯ ПЦР ДЛЯ АМПЛИФИКАЦИИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОВ ЖЬ/МРИ И БЯЛГ, М^ ИК^ С ОБНАРУЖЕННЫМИ СТРУКТУРНЫМИ ИЗМЕНЕНИЯМИ
№ Пары праймеров Последовательности (5' — 3') Температура отжига праймеров, °С/длина ампликона, п.н.
1 NPM 7F NPM 7R AAGTTCCTTTTCCCATGTGC GAACAAGAGCTGTTCTATCACCAA 59/240
2 NPM 8F NPM 8R ACTTCAAGGTCCTGCTTTC ATGATCTCCCACACCAGCTT 59/240
3 NPM 10F NPM 10R AGCTTTATAAGGGAGTTTTGTGAGAA AAACATTCAAGTCTATGCAAACCA 59/360
4 NCL 2F NCL 3R GCGTATGAACACTAATGGCAAA TTGCCACAGATATCCAATTTCA 59/280
5 NCL 3F NCL 3R GGGGCTGGACTTACTGGTTT CTTGGCATTCTTGCCATTCT 59/320
6 NCL 4F NCL 4R TGTTGGTTTTGGGAGATTGC CCTCCTTTAAACATAACTCATGTCG 59/280
7 BRAF-Ex15BR-For BRAF_Ex15BR_Rev ACCTAAACTCTTCATAATGCT ACAACTGTTCAAACTGATGG 56/173
8 Ex3-NRAS For Ex3-NRAS_Rev AATTGAACTTCCCTCCCTCCCT AATTGAACTTCCCTCCCTCCCT 68/150
9 Ex2 KRAS-For Ex2 KRAS-Rev KR-shEx2-Rev ATGACTGAATATAAACTTGTGG TTATCTGTATCAAAGAATGGT TGCATATTAAAACAAGATTTACC 54/153
ных генетических изменений. Дальнейший анализ структуры гена NPM в неизмененной ткани и других образцах МК позволит проверить это предположение.
На С-конце молекулы В23 имеется кластер положительно заряженных аминокислот, ответственный за связывание этого белка с молекулами ДНК и РНК, адено-зинтрифосфата, белками ядрышка, а также за транспорт гистонов и рибонуклеазную активность. Показано, что взаимодействие В23 с транскрипционными факторами, белками-супрессорами и другими регуляторными белками с последующими посттрансляционными изменениями приводит к изменению профиля экспрессии этих белков, в частности к увеличению уровня экспрессии протеинкиназы В — рАИ, обусловливающему трансформацию тироцитов и развитие рака щитовидной железы [20]. Метаанализ 106 различных В23-ассоциированных белков выявил 6 прогностически значимых для саркомы Юинга полипептидов, активность которых регулируется нуклеофозмином [21]. Метаанализ с помощью микрочипов уровня экспрессии генов в клетках кишечника в норме, в аденомах и при колоректальном раке (КРР) выявил дифференциальную экспрессию NPM в зависимости от прогрессии опухолей; подавление экспрессии гена NPM в культуре клеток с помощью малых ядерных (мя) РНК приводило к р53-опосредованному аресту клеточного цикла и супрессии опухолевого роста [22]. Более того, профиль экспрессии гена NPM в культуре КРР коррелировал с миграцией опухолевых клеток и с их инвазией [23]. Другой механизм канцерогенеза связан с взаимодействием В23 и транскрипционного фактора FOXМ1, активирующего транскрипцию целого ряда генов, включая онкогены, что может привести к индукции опухолевого роста [24].
Структурные изменения гена NPM могут повлиять на первичную структуру функционально важных доменов, изменяя физико-химические свойства белка и его биологическую активность. Дальнейшая характеристика таких изменений позволит прояснить механизмы В23-опосредованной индукции опухолевого роста.
Изменения в структуре гена МСЬ
Ген NCL, кодирующий нуклео-лин, картирован на хромосоме 2д37.1, содержит 14 экзонов и 13 интронов протяженностью около 11 т.п.н., ин-трон 11 кодирует мяРНК Ш0. Будучи многофункциональным белком, нуклеолин/С23 участвует в регуляции важнейших клеточных процессов, включая транскрипцию, биогенез рибосом, стабилизацию РНК и трансляцию, а также процессинг микроРНК. В молекуле С23 имеется 4 РНК-связывающих домена и обогащенный аргинином/глицином домен, которые взаимодействуют с молекулами РНК и опосредуют клеточную пролиферацию, блок апоптоза с последующим развитием опухолей, генерализацией
вирусных инфекций и другими патологическими процессами. На С-конце молекулы С23 локализован домен RGG (GAR) — 9-членный повтор триплета Арг-Гли-Гли, важный для функционирования гликированного рецеп-торного нуклеолина [25]. Нарушение интактной молекулярной структуры С23, вызванное генетическими изменениями, может иметь критическое значение для индукции неоплазий. В 3 из 30 (10%) проанализированных образцах метастатической МК были выявлены однонуклеотидные замены IVS2+31G/A в интроне 2 гена NCL и в 1/30 — уже известный полиморфизм р. Е149E (GAG/GAA) в экзоне 3, который не встретился в ДНК контрольных образцов и может рассматриваться как специфичный для МК. Эти варианты представляют интерес, поскольку ДНК, не кодирующая белки, по-видимому, функционально значима. Дело в том, что соответствующая некодирующая РНК (нкРНК, ncRNA), может выполнять регуляторные функции, включая опосредованный транскрипцией нкДНК сайленсинг соседних генов и их промоторов — транскрипционную интерференцию. Наличие интронных вариантов гена NCL указывает на возможное изменение регулятор-ных функций в случае нкРНК. Этот вопрос также требует дальнейшего изучения с привлечением обширной выборки больных с метастатической МК.
Впервые обнаруженная нами герминальная делеция del c.763-765 GAT в экзоне 4 гена NCL затрагивает обогащенный аспарагином и глутаминовой кислотой домен этого белка, участвующий во взаимодействиях с нуклеиновыми кислотами и кислыми белками (база данных Ensembl). По нашим предварительным данным, частота этой мутации в контрольной группе доноров в 5—6 раз превышает частоту у пациентов с МК. Однако в отличие от доноров, у пациентов с МК делеция встречается в ~15% случаев в сочетании с другими интронными вариантами, например IVS2+31G/A и ПВ (синонимичной
NCL
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12
13 14
NS2+31G/A 149GA6/GAA delc.255 р.Е 149Е, GAT, ехоп 3 ехоп 4 МК: 3/30 1/30 1/30
Д: 4/30 NPM
7/30
23181 п.н.
tl—кчгь
2 34 56 7 8
NS5-31G/A+NS&+42G/A NS&39A/G+(-42)OA
МК: 17/30 8/30
Д: 8/30 7/30
10
1112
NS&63A/G 8/30 2/20
Рис. 2. Схемы транскриптов генов N0!, (вверху) и NPM (внизу); цифрами обозначены экзоны (вертикальные линии), соединенные интронными последовательностями (кривые), которые вырезаются при сплайсинге. Внизу показано количество экзонных структурных изменений и полиморфных интронных вариантов, обнаруженных в ДНК из клеток метастатической МК и в ДНК доноров (Д)
заменой) р. Е149Е (149 ОАО/ОЛА) в экзоне 3 гена ЫСЬ. У доноров эта делеция обнаруживается либо в сочетании с 1У82+310/А в интроне 2 гена ИСЬ, либо отдельно (примерно в равных пропорциях). Структурный анализ этой мутации в гене ИСЬ, затрагивающей функционально важный домен, будет представлен в следующей статье.
Хотя С23 локализован преимущественно в ядрышках, он участвует в ядерно-цитоплазматическом транспорте и высоко экспрессируется на поверхности некоторых типов клеток. Ингибирование активности рецепторного нуклеолина блокирует рост опухолевых клеток молочной железы, предстательной железы и мозга (глиомы) [25]. У пациента Ч., 40 лет — носителя данной мутации, было отмечено 5 рецидивов МК в течение непродолжительного времени наблюдения. Аналогичная картина быстрого прогрессирования опухоли наблюдалась у 2 других пациентов с указанной делецией в гене ИСЬ, но без мутации (данные здесь не представлены).
Известно, что фосфорилированый нуклеолин активно взаимодействует с комплексом различных клеточных белков, участвуя в ключевых процессах клеточной жизнедеятельности. Активация С23 приводит к быстрой пролиферации клеток и стимулирует опухолевый рост. Обнаруженные недавно статистически значимые изменения уровня экспрессии ИСЬ при немелкоклеточном раке легкого имеют прогностическое значение [26]. Более того, были сконструированы 2 аптамерных моле-
кулярных химеры нуклеолин-мяРНК, ингибирующие экспрессию SLUG/NRP1 и опухолевый рост модельных ксенографтов РЛ [27].
Мультифакторный анализ выявил прогностическую значимость экспрессии NCL для ряда других неоплазий, включая детские эпендимомы, а также остеосаркомы и глиомы [28]. Показано, что взаимодействие С-концевого аргинин-глицин-богатого домена С23 с коактиватором Р-рецептора ретиноевой кислоты COUP-TFII создает основу для инвазивного роста опухоли при протоко-вом раке молочной железы (РМЖ) [29]. Неспецифический механизм индукции канцерогенеза заключается, по-видимому, в активации за счет гиперпродукции С23 роста эндотелиальных клеток и стимуляции ангиоген-ных факторов роста, например плейотропина [30]. Альтернативный механизм заключается во взаимодействии молекул С23 с активатором плазминогена урокиназного типа (uPAR), благодаря которому активатор переносится в ядро и участвует в регуляции генной экспрессии [31]. Отметим, что молекулы С23 и интегрина являются рецепторами интегрина а5р1, опосредующего экспрессию uPAR так, что комплекс C23/a5pi/uPAR способствует интернализации и транспорту эндостатина в клеточное ядро. Особый интерес вызывают исследования роли С23 в развитии меланомы [17, 19].
Активированные молекулы RAS и рецептор ErbB1 семейства эпидермальных факторов роста взаимодейству-
Таблица 2
ТИПЫ СТРУКТУРНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ГЕНОВ №И/ЖЬ И СПЕЦИФИЧНЫЕ МУТАЦИИ ВВАР/МВЛБ/КВЛБ В
ОБРАЗЦАХ МЕТАСТАТИЧЕСКОЙ МК
Т1ш Ген Изменение Частота обнаружения Комбинации генетических изменений МРИ/ЖЬ и мутаций в образцах МК
1 NPM, интроны 5-6 Одновременно IVS5-31G/A и IVS6 + (-42)G/A 17 (57%) образцов и 1 ксенографт тип 1 + BRAF У600Е, включая 1BRЛF У600К: 8 (27%) образцов: из них 5 (17%): тип 1 + У600ЕBRAF + тип 4 и тип 5 (ЖЬ); 2 образца: тип 1 + Q61R NRAS; 1 образец: тип 1 + 013Б KRAS
2 NPM, интрон 6 Однонуклеотидная замена IVS6 -39 A/G + тип 1 8 (26%) образцов МК 4 (13%) образца: тип 2 + BRAF У600Е + тип 4 (ЖЬ) + тип 5 (ЖЬ)
3 NPM, интрон 8 Однонуклеотидная замена IVS8-63A/G + тип 1 6 (20%) образцов 5 (16%) образцов: тип 3 + BRAF У600Е, 2 (6%) образца: тип 3 + Q61R NRAS
4 NCL, интрон 2 Однонуклеотидная замена IVS2+31G/A 4 (13%) образца Тип 4 + BRAF У600Е + тип 1 (ШИ) (все 4 образца — быстро рецидивирующая МК)
5 NCL, экзон 3 Однонуклеотидная замена (ПВ) р. Е149Е (GAG/GAA) 7 (23%) образцов 6 (20%) образцов: тип 5 + BRAF У600Е + тип 1; 1 образец: тип 5 + Q61R NRAS
6 NCL, экзон 4 Del с.255 (763-765 GAT) + тип 4 1 образец Е149Е (149GAG/GAA) + герминальная делеция в экзоне 4 ЖЬ, семейное отягощение, 5 рецидивов МК
7 BRAF BRAF V600E 15 (50%) образцов 1 из 2 ксенографтов 13 (43%) образцов: эпителиоидно-клеточная МК с множественными метастазами, 1/30 — веретеноклеточная МК; 1/30 - ПМЗО: МК+РТК+РП
8 BRAF BRAF V600K 1 образец Рецидивирующая МК с замещением лимфоидной ткани опухолью
9 NRAS NRAS Q61R 3 образца 2 образца — рецидивирующие узловые МК спины
10 KRAS KRAS G13D 1 образец ПМЗО: МК+РЛ+РМЖ
ют с молекулами С23, обеспечивая 3-мерный рост клеток меланомы, пересаженных под кожу иммунодефицитных мышей [25]. Поэтому разработка С23-молекулярно-направленных препаратов перспективна для ингибиро-вания опухолевого роста, индуцированного при активации ряда онкогенов и клеточных рецепторов [32].
Мутации гена BRAF
Соматические мутации гена BRAF наблюдаются в 40—88% случаев МК, наиболее распространена мутация BRAF V600E в экзоне 15. Наличие мутаций гена BRAF указывает на неблагоприятный прогноз: более ранний возраст начала заболевания, высокую частоту местных рецидивов с поражением регионарных лимфатических узлов (ЛУ) и инвазией опухоли в глубокие слои кожи, быстрый рост опухолей и низкую выживаемость пациентов. В исследованной нами выборке мутации в экзоне 15 BRAF обнаружены в 15 из 30 (50%) случаев: в 12 из них выявлена типичная замена V600E, в 1 — обнаружена мутация BRAFV600K. У всех носителей этих мутаций гена BRAF были диагностированы множественные метастазы в ЛУ, а в ряде случаев — в легкие и печень. У пациентки Т., 50 лет, мутация BRAF V600E была обнаружена в первичной опухоли, а также в метастазах МК в ЛУ и легких. В 15 из 30 образцов МК мутация V600EBRAF сочеталась со структурными изменениями в интронах 5, 6 и 8 гена NPM, включая образец с ПВ в экзоне 3 гена NCL (см. табл. 2). В 3 образцах эпителиоидно-клеточной МК спины с множественными метастазами в лимфоузлы и замещением лимфоидной ткани, мутация V600E BRAF сочеталась с изменениями сразу в 2 генах — NPM (ин-троны 5, 6 и 8) и NCL (интрон 2 и экзон 3). В 1 из 2 образцов метастатической МК в составе ПМЗО (МК + РТК + РП) мутация V600E BRAF сочеталась с ПВ IVS 6 -39A/G + (-42)C/A в интроне 6 гена NPM, а в другом случае (МК + РЛ + РМЖ) терминальные мутации в экзоне 2 гена KRAS и в экзоне 19 EGFR сочетались с ПВ р. Е149Е (149 GAG/ GAA) в экзоне 3 гена NCL. Предполагается, что мутации гена BRAF в метастатических очагах МК, в отличие от первичной МК, ассоциированы с ухудшением прогноза заболевания и снижением общей выживаемости [33]. По-видимому, сочетание этих мутаций со структурными изменениями ключевых для клеточной пролиферации и сигналинга генов NCL/NPM вносит дополнительный вклад в прогрессию МК посредством активации в клетках ключевых сигнальных путей.
Мутации онкогенов RAS
Семейство онкогенов RAS кодирует малые ГТФазы, передающие внеклеточные сигналы и регулирующие ключевые процессы в клетке: рост, дифференцировку, подвижность и апоптоз. Активированная в результате мутаций изоформа NRAS участвует в RAS/RAF/MAPK-зависимом клеточном сигналинге, индуцируя клеточную пролиферацию и прогрессию опухолей. Мутации гена NRAS обнаруживаются в 5—33% случаев МК. Нанокла-стеры Ras-GTP также участвуют в рекрутировании на плазматической мембране комплексов Raf/MEK и ERK и в индукции/активации МАРК-сигнального каскада [19].
Молекулы В23 и С23 специфически связываются с молекулами K-Ras, но не с H-Ras на внутренней сто-
роне клеточной мембраны, это взаимодействие является критическим для МАРК-зависимого сигналинга. О взаимодействии В23/С23 с N-RAS известно значительно меньше. Мутация Q61R NRAS была обнаружена нами в 3 из 30 образцов МК, включая 2 образца рецидивирующей узловой МК спины с метастазами в ЛУ, легких и печени (в 1 случае). В 2/3 образцов (МК с метастазами в ЛУ и легких) мутация гена NRAS сочеталась со структурными изменениями в экзонах 7 и 10 гена ^М (типы 1 и 3; см. табл. 2). Мутация 013В KRAS была идентифицирована в 1 из 30 образцов МК у пациентки с ПМЗО (МК + РЛ + РМЖ) в сочетании с терминальной мутацией гена ЕОРЯ, ПВ в интроне 6 гена ^Ми специфичным ПВ в экзоне 3 гена N0!, не встречающимся в контрольной популяции доноров. Отметим, что последовательности экзонов 3—4 кодируют домены С23, ответственные за взаимодействие с РНК, ДНК и гистоновыми белками. Эта активность нуклеолина важна для удаления нуклеосомных ги-стонов Н2А/Н2В и Н3/Н4 при репарации двуцепочечных разрывов ДНК в фазе G1 клеточного цикла. Нуклеолин регулирует трансляцию мРНК, связываясь с G-богатыми мотивами или с ЦТО, путем деацетилирования мРНК в комплексе с поли(А)-связывающим белком (РАВРС) и тем самым усиливает экспрессию ряда онкобелков.
Для модуляции нуклеолин-зависимой экспрессии ряда микроРНК, ассоциированных с прогрессией РМЖ, предложено использовать синтетические аптамеры с высоким содержанием гуанозина, ингибирующие активность ре-цепторного нуклеолина [34]. Для меланомы разрабатывается другой оригинальный подход с использованием РНК-связывающей активности нуклеолина [35]. Таким образом, многофункциональный шаперон нуклеолин является перспективной мишенью для молекулярно-направленной терапии ряда опухолей, включая МК.
В настоящее время рассматривается несколько подходов к анализу ключевых сигнальных путей и нарушений их регуляции, которые приводят к развитию меланомы: 1) поиск мутаций в генах-мишенях и регу-ляторных белков-маркеров прогрессии МК; 2) создание фармакологических агентов для таргетной терапии сигнальных молекул; 3) анализ лекарственной устойчивости и механизмов индукции МК; 4) изучение механизмов резистентности МК к лекарственной терапии [36]. Комплексный анализ генетических изменений при метастатической МК создает основу для развития всех этих направлений клинической онкологии.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Отсутствие эффективных методов лечения метастатической МК делает особенно актуальным поиск и характеристику молекулярно-генетических маркеров прогрессии.
Анализ образцов метастатической МК с помощью специфичной ПЦР, конформационно-чувствительного электрофореза и последующего секвенирования ПЦР-продуктов позволил нам обнаружить ряд генетических изменений генов ^М и N0!, кодирующих В23/нуклео-фозмин и С23/нуклеолин. Выявлены специфичные изменения в экзоне 3 гена N0! и характерные для образцов метастатической МК сочетания структурных вариантов
с делецией в экзоне 4 гена NCL. Выявленные в исследованной выборке пациентов (n=30) и в контрольной группе (n=30) изменения гена NPM не отличались по своей структуре, за исключением полиморфизма в экзоне 3 гена NCL, т.е. были неспецифичными. Однако в образцах метастатической МК были обнаружены специфичные комбинации указанных ПВ друг с другом и с мутациями онкогенов BRAF/NRAS. Совокупность этих структурных изменений нужно рассматривать в связи с функциональной активностью В23/С23 и динамикой клеточных процессов в целом. При этом возможно изменение структуры функционально важных доменов с последующей деструкцией или стабилизацией молекул, а также посттрансляционными изменениями с участием микроРНК и длинных некодирующих РНК. Дальнейший структурно-функциональный анализ генов NPM/ NCL важен для понимания механизмов индукции и про-
грессии злокачественной МК. Комплекс генетических изменений, включая гены NCL, NPM, BRAF, NRAS и, возможно, другие локусы, создает генетическую нестабильность и молекулярную неоднородность опухоли, в частности стволовых опухолевых клеток с повышенным метастатическим потенциалом. Это способствует агрессивному течению заболевания и создает трудности для эффективной терапии МК.
Характеристика найденных изменений в ключевых генах NPM/NCL, кодирующих многофункциональные регуляторные белки, с использованием как клинического материала, так и модельных систем, например ксенограф-тов МК у иммунодефицитных мышей имеет важное значение. Она позволила бы уточнить механизмы онкогенеза МК и определить новые стратегии лечения для диссеми-нированной МК, которая стоит сейчас в первом ряду заболеваний, перспективных для таргетной терапии [37].
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Злокачественные новообразования в России в 2011 г. (заболеваемость и смертность). Под ред. В.И. Чиссова, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. М., 2013. (Malignant neoplasms In Russia In 2011 (morbidity and mortality). Eds. VI. Chissov, VV Starinsky, G.P. Petrova. Moscow. 2013 (in Russian))
2. Демидов Л.В., Соколов Д.В., Булычева И.В. Совершенствование методов диагностики меланомы кожи. Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. 2007; 18 (1): 36-41. (Demidov L.V., Sokolov D.V., Bulytcheva I.V. Improvement of diagnostics methods for cutaneous melanoma. Bulletin of N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of the RAMN. 2007; 18 (1): 36-41 (in Russian))
3. Зенит-Журавлева Е.Г., Полковниченко Е.М., Лушникова А.А., Трещалина Е.М., Букаева И.А., Райхлин Н.Т. Нуклеофозмин и нуклеолин: кодирующие гены и экспрессия в различных тканях человека и животных. Молекулярная медицина. 2012; 4: 24-30. (Zenit-Zhuravleva E.G., Polkovnichenko E.M., Lushnikova A.A., Treschalina H.M., Bukaeva I.A., Raikhlin N.T. Nucleophosmin and nucleo-lin: coding genes and expression in various tissues of humans and animals. Molecular Medicine. 2012; 4: 24-30 (in Russian))
4. Bello D.M., Arjyan Ch.E., Carvajal R.D. Melanoma mutagenesis and aberrant cell signaling. Cancer Control. 2013; 29 (4): 261-81.
5. Olszanski A. Current and future roles of targeted therapy and immunotherapy in advanced melanoma. J. Manag. Care Pharm. 2014; 20 (4): 346-56.
6. Tsao H., Chin L., Garraway L.A., Fisher D. Melanoma: from mutations to medicine. Genes Dev. 2012; 26 (11): 1131-55.
7. Lemech Ch., Infante J., Arkenau H-T. The potential for BRAF V600 inhibitors in advanced cutaneous melanoma: rationale and latest evidence. Ther. Adv. Med. Oncol. 2012; 4 (2): 61-73.
8. Woodman S.E., Lazar A.J., Aldape K.D. et al. New strategies in melanoma: molecular testing in advanced disease? Clin. Cancer Res. 2012; 18: 1195-200.
9. Asundi J., Lacap J.A., Clark S. et al. MAPK pathway inhibition enchances the efficacy of an anti-endothelin B receptor drug conjugate by inducing target expression in melanoma. Mol. Cancer Ther. 2014; PMID: 24651527.
10. Sullivan R.J., Flaherty K. MAP kinase signaling and inhibition in melanoma. Oncogene. 2013; 32 (19): 2373-79.
11. Johannesen C.M., Johnson L.A., Plcclonl F. et al. A melanocyte lineage program confers resistance to MAP kinase pathway inhibition. Nature. 2013; 504: 138-42.
12. Krayem M., Journe F., Wiedig M. Prominent role of cyclic adenosine monophosphate signaling pathway in the sensitivity of (WT)BRAF/(WT) NRAS melanoma cells to vemurfenib. Eur. J. Cancer. 2014; 50 (7): 1310-20.
13. Sun C., Wang I., Huang S. et al. Reversible and adaptive resistance to BRAF (V600E) inhibition in melanoma. Nature. 2014; 508 (7994): 118-22.
14. Wu D.M., Zhang P., Liu R.Y. et al. Phosphorila-tion and changes in the distribution of nucleo-lin promote tumor metastasis via the PI3K/Akt pathway in colorectal carcinoma. FEBS Lett. 2014; doi:10.1016/j.febslet.2014.03.047.
15. Abdelmohsen K., Gorospe M. RNA-binding protein nucleolin in disease. RNA Biol. 2012; 9
(6): 799-808.
16. Fujiki H., Watanabe T, Suganuma M. Cell-surface nucleolin acts as a central mediator for carcinogenic, anti-carcinogenic, and disease-related ligands. J. Cancer Clin. Oncol. 2014; 140: 689-99.
17. Hoja-Lukowich D., Przybylo M., Poche E. et al. The new face of nucleolin in human melanoma. Cancer Immunol. Immunother. 2009; 58 (9): 1471-78.
18. Li L., Hou J., Liu X. et al. Nucleolin - targeting liposomes guided by aptamer AS 1411 for delivery of siRNA for the treatment of malignant melanomas. Biomaterials. 2014; 35 (12): 3840-50.
19. Inder K.L., Lau C., Loo D. et al. Nucleophosmin and nucleolin regulate K-Ras plasma membrane interactions and MAPK signal transduction. J. Biol. Chem. 2009; 284: 28410-19.
20. Piantaa A., Pyppina C., Franzonib A. et al. Nucleophosmin is overexpressed in thyroid tumors. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2010; 397 (3): 499-504.
21. Haga A., Ogawara Y., Kubota D. et al. Interac-tomic approach for evaluating nucleophos-min-binding proteins as biomarkers for Ewing sarcoma. Electrophoresis. 2013; 34 (11): 1670-78.
22. Wong J.C., Hasan M.R., Rahman R. et al. Nu-cleophosmin 1, upregulated in adenoma and cancers of the colon , inhibits p53-mediated cellular senescence. Int. J. Cancer. 2013; 133
(7): 1567-77.
23. Liu Y., Zhang X-F., Qi L-Sh. et al. Expression of nucleophosmin /NPM1 correlates with migration and invasiveness of colon cancer cells. J. Biochem. Sci. 2012; 19: 53-59.
24. Bhat U.G., Jagadeeswaran R., Halasi M., Gar-tel A.L. Nucleophosmin interacts with FOXM1
and modulates the level and localization of FOXM1 in human cancer. J. Biol. Chem. 2011; 286 (48): 41425-33.
25. Schokorov S., Juster D., Kloog Y., Pinkas-Kra-mardki R. Disruption the oncogenic synergism between nucleolin and Ras results in cell growth inhibition and cell death. PLoS One. 2013; 8 (9): e 75269. doi 10.1371.
26. Zao H., Huang Y., Xue C. et al. Prognostic significance of the combined score of endothelial expression of nucleolin and CD31 in surgically resected non-small cell lung cancer. PLoS One. 2013; 8 (1) doi: 10.1371.
27. Lai W.Y., Wang W.Y., Chang Y.C. et al. Synergistic inhibition of lung cancer cell invasion, tumor growth and angiogenesis using aptamer-siRNA chimeras. Biomaterials. 2014; 35 (9): 2905-14.
28. Modena P., Buttarelli F.R., Miceli R. et al. Predictors of outcome in an AIEOP series of childhood ependymomas: a multifactorial analysis. Neuro Oncol. 2012; 14 (11): 1346-59.
29. Lichfield L.M., Riggs K.A., Hockerberry A.M. et al. Identification and characterization of nu-cleolin as a COUP-TFII coactivator of retinoic acid receptor ß transcription in breast cancer cells. PLoS One. 2012; 7 (5): 131-7. Koutsioumpa M., Papadimitriou E. Cell surface nucleolin as a target for anti-cancer therapies. Recent Pat. Anticancer Drug Discov. 2013; Nov 18. PMID: 24251811.
Stepanova V., Lebedeva T, Kuo A. et al. Nuclear translocation of urokinase-type plasmino-gen activator. Blood. 2008; 112 (1): 100-10.
32. Birmpas C., Briand J.P., Courty J., Katsoris P. The polypeptide HB-19 binds to cell surface and inhibits angiogenesis. Vasc. Cells. 2012; 4 (1): 4-21.
33. Amaria R.N., Kim K.B. Dabrafenib for the treatment of melanoma. Expert. Opin. Pharmaco-ther. 2014; Apr 10. (Epub ahead of print)
34. Pichiorri F., Paimieri D., De Luca L. et al. In vivo NCL targeting affects breast cancer aggressiveness through miRNA regulation. J. Exp. Med. 2013; 6 (5): 951-68.
35. Li L., Hou J., Liu X. et al. Nucleolin - targeting liposomes guided by aptamer AS 1411 for delivery of siRNA for the treatment of malignant melanomas. Biomaterials. 2014; 35 (12): 3840-50.
36. Evans M.S., Madhanapandhula S.V., Robertson G.P. et al. Current and future trials of targeted therapies in cutaneous melanoma. Adv. Exp. Med. Biol. 2013; 799 (2): 223-55.
37. Jarkowski A., Khushalani N.I. BRAF and beyond: tailoring strategies for the individual melanoma patient. J. Carcinog. 2014; 13 (1): 1-14.
30.
31
Поступила 16 мая 2014 г.
