CC BY
12
т
СЛУЧАЙ ИЗ КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКИ
УДК 616.5-006.81:575.224.22
https://doi.org: 10.20538/1682-0363-2019-3-226-231
Сочетание мутаций генов BRAF и NRAS в пределах одной опухоли у пациентов с меланомой кожи Аксененко М.Б., Аверчук А.С., Рукша Т.Г.
Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого
(КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого)
Россия, 660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1
РЕЗЮМЕ
До недавнего времени считалось, что мутации в генах BRAF и NRAS являются взаимоисключающими и не встречаются в пределах одной опухоли. В последующем было выявлено, что данные мутации могут наблюдаться вместе, но это по-прежнему является достаточно редким явлением.
Цель исследования - определить возможность сочетания взаимоисключающих мутаций в генах BRAF и NRAS и проанализировать взаимосвязь мутационного статуса опухоли с экспрессией не-мутантного белка NRAS.
Материалы и методы. Определение мутации BRAF V600E в опухоли проводилось методом полиме-разной цепной реакции в режиме реального времени, а во 2-м и 3-м экзоне гена NRAS - методом секвенирования по Сенгеру. Оценка экспрессии белка NRAS дикого типа осуществлялась методом иммуногистохимии.
Результаты. Выявлены мутации в 15-м экзоне гена BRAF c.1799T>A (V600E) и во 2-м экзоне гена NRAS p.G13S (с.37 G>A). Уровень экспрессии не мутантного белка NRAS в обоих случаях различался. У одного пациента, несмотря на наличие мутации в гене NRAS, в менее чем 5% опухолевых клеток нормальный белок не экспрессировался.
Заключение. Данный феномен можно связать с возможными эпигенетическими нарушениями экспрессии генов на посттранскрипционном уровне.
Ключевые слова: меланома кожи, BRAF, NRAS, мутации.
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
Источник финансирования. Работа поддержана госзаданием «Разработка методов детекции и идентификация мутаций гена cKIT на основе технологий ПЦР в реальном времени и секвенирования для выбора средств персонифицированной терапии меланомы».
Для цитирования: Аксененко М.Б., Аверчук А.С., Рукша Т.Г. Сочетание мутаций генов BRAF и NRAS в пределах одной опухоли у пациентов с меланомой кожи. Бюллетень сибирской медицины. 2019; 18 (3): 226-231. https://doi.org: 10.20538/1682-0363-2019-3-226-231.
УДК 616.5-006.81:575.224.22
https://doi.org: 10.20538/1682-0363-2019-3-226-231
The combination of mutations in BRAF and NRAS genes within a one tumor in patients with cutaneous melanoma Aksenenko M.B., Averchuk A.S., Ruksha T.G.
H Аксененко Мария Борисовна, e-mail: aksenenko_mariya@mail.ru.
Krasnoyarsk State Medical University n.a. prof. V.F. Voyno-Yasenetsky (KrasSMU n.a. prof. V.F. Voyno-Yasenetsky) 1, P. Zheleznyaka Str, Krasnoyarsk, 660022, Russian Federation
ABSTRACT
The paper provides a clinical description and analysis of two melanoma cases with mutations in the BRAF and NRAS gene within one tumor. Until recently, it was believed that mutations in the BRAF and NRAS genes are exclusive and do not occur within the same tumor. Later it was revealed that these mutations can exist within one tumor, but this is still quite a rare phenomenon. Molecular genetic analysis of the tumor obtained from both patients showed a mutation in the 15 exon of the BRAF gene c.1799T>A (V600E) and exon 2 of the NRAS p.G13S gene (p.37 G>A). The expression level of non-mutant NRAS protein was different in both cases. In conclusion, so in one patient, despite the presence of a mutation in the NRAS gene, the level of expression of the non-mutant protein was absent, which can be related to possible posttranscriptional disorders in the regulation of gene expression.
Key words: melanoma of the skin, BRAF, NRAS, mutations.
Conflict of interest. The authors declare the absence of obvious and potential conflicts of interest related to the publication of this article.
Sourse of financing. This work was supported by the state assignment "Development of detection methods and identification of cKIT gene mutations based on real-time PCR and sequencing technologies for choosing personalized melanoma therapy".
For citation: Aksenenko M.B., Averchuk A.S., Ruksha T.G. The combination of mutations in BRAF and NRAS genes within a one tumor in patients with cutaneous melanoma. Bulletin of Siberian Medicine. 2019; 18 (3): 226-231. https://doi.org: 10.20538/1682-0363-2019-3-226-231.
ВВЕДЕНИЕ
Сигнальный каскад MAPK, состоящий из RAS-RAF-MEK-ERK протеинкиназ, участвует в регуляции множества важных функций в клетке, таких как пролиферация, дифференциров-ка, миграция, апоптоз [1]. Усиленная активация сигнального пути MAPK может быть вызвана мутациями в генах RTK, HRAS, NRAS, BRAF, NF1 [2]. Наличие активирующих мутаций в одном из вышеперечисленных генов не приводит к нарушению проведения сигнала внутрь клетки, так как другие участники данного сигнального каскада берут на себя данную функциональную роль. Около 25% всех злокачественных опухолей имеют нарушения регуляции сигнального каскада MAPK, связанные с увеличением продукции активирующих лигандов, а также наличием активирующих мутаций в генах семейств RTKs, RAS и RAF [3]. При меланоме кожи нарушения в MAPK сигнальном каскаде связаны, как правило, с активирующей мутацией в гене BRAF в 50% случаев или с мутацией в гене NRAS в 15% случаев [4]. Данный факт демонстрирует важность контроля регуляции MAPK в гомеостазе меланоцитов. До недавнего времени считалось, что мутации в генах BRAF и NRAS являются взаимоисключающими, что может быть связано с развитием в
данном случае самоиндуцированного апоптоза,
вызываемого стойкой гиперактивациеи сигнального каскада МАРК [5].
В литературе последних лет появились данные о том, что мутации в генах BRAF и NRAS не являются взаимоисключающими и могут встречаться вместе [5]. Выявлено, что обе эти мутации могут существовать в небольшой области (около 10 тыс. клеток), выделенных путем лазерной микродиссек-ции [6]. Несмотря на вышеперечисленные аргументы, сочетание данных мутаций является достаточно редким событием. Проведенное исследование было направленно на определение мутационного статуса в генах BRAF и NRAS у больных меланомой кожи. Пациенты находились на лечении в КГБУЗ «Красноярский краевой клинический онкологический диспансер имени А.И. Крыжановского».
Цель данного исследования - определение возможности сочетания взаимоисключающих мутаций в генах BRAF и NRAS и анализ взаимосвязи мутационного статуса опухоли с экспрессией немутантного белка NRAS. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Выявить сочетание мутаций в генах BRAF и NRAS в пределах одной опухоли у пациентов с меланомой кожи.
2. Описать иммуногистохимическую картину экспрессии белка NRAS дикого типа у больных с различным NRAS-мутантным статусом.
3. Проанализировать взаимосвязь сочетания мутаций в генах BRAF и NRAS с экспрессией не-мутантного белка NRAS.
Анализ мутации BRAF V600E осуществлялся методом аллель-специфичной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени c использованием набора Real-Time-PCR-BRAF V600E (Биолинк, Россия). Мутационный статус опухоли определялся при расчете разницы (Д Ct) между Ct образца в реакции со специфичными V600E праймерами и Ct того же образца в контрольной реакции. Образец ДНК расценивался как положительный (т.е. содержащий мутацию), если Д^ образца < Д^ положительного стандарта, содержащего 1% ДНК с мутацией.
Определение мутационного статуса 2-го и 3-го экзона гена NRAS проводилось методом секвенирования по Сенгеру. На первом этапе исследования проводилась постановка реакции амплификации ПЦР. Для приготовления ПЦР-смеси использовали набор Encyclo Plus PCR kit (Евроген, Россия). Последовательность прай-меров для гена NRAS была следующей: Forward 5'-ATAGCATTGCATTCCCTGTG; Reverse
5'-GCGGATATTAACCTCTACAGG. Условия ПЦР (NRAS): предварительная денатурация 95 °С -3 мин, далее денатурация 95 °С - 30 с, отжиг 54 °С -40 с, элонгация 72 °С - 40 с; всего 38 циклов, в завершении финальная элонгация 72 °С - 3 мин.
Для постановки иммуногистохимической реакции была использована безбиотиновая система детекции REVEAL Biotin-Free Polyvalent (Spring, BioScience, США). В качестве первичных антител применялись моноклональные антитела, клон AT2G9 (antibodies-online, США). Визуализацию продукта реакции проводили хромогеном AEC (амино-этил-корбазол) (Sigma, США). Подсчет положительно окрашенных клеток выполняли при увеличении ><600 с помощью микроскопа Olympus BX-41, программа Infinity Capture, камера Lumenera Corporation и Software V.4.6.0.
Клинический случай № 1. Пациентка К., 35 лет, диагноз «меланома кожи левого бедра, метастазы в паховые лимфатические узлы слева». Толщина опухоли по Бреслоу составила 4,46 мм. Больной было выполнено иссечение опухолевого узла, а также пахово-подвздошная лимфаденэк-томия слева. У данной пациентки выявлено наличие мутации в гене BRAF p.V600E (c.1799 T>A), связанной с заменой глутамата на валин в положении 600 (рис. 1), также мутации NRAS p.G13S (c.37 G>A), приводящей к замене глицина на се-рин в 13-м положении.
Multicomponent Plot
ЛОШ
ЗЯЦЦр
1* DOC
ЯШ»
ГфШ
яцо
«i
£ I* DM
5 1МШ
fe
^ IT^B»
isCUM
IS] DM
1-QJto
tiUDM
muoo
i цдН
1WDW
« DM
Tft.DM
Of«*
Рис. 1. Определение наличия мутации BRAF V600E методом аллель-специфичной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Детекция мутации BRAF V600E, ДНК с мутацией (красная стрелка), ДНК без мутации (черная стрелка) Fig. 1. Allele-specific real-time PCR for BRAF gene V600E mutation identification, mutated DNA (red arrow), wild-type DNA (black arrow)
Вышеуказанная нуклеотидная замена затрагивала менее 5% мутантных клеток и была определена в реакции секвенирования с обогащением мутантным аллелем (рис. 2, а, b). В 3-м экзоне гена NRAS у данной пациентки не было обнаружено нуклеотидных замен. Для оценки уровня экспрессии белка NRAS проводилось иммуно-гистохимическое определение экспрессии белка NRAS дикого типа. Определено отсутствие экспрессии вышеуказанного белка как в клетках опухоли, так и в клетках стромального микроокружения (рис. 3).
Клинический случай № 2. Пациент Н., 48 лет, диагноз «меланома межлопаточной области, метастазы в лимфатические узлы шеи, туловища и конечностей». Молекулярно-генетический статус данного больного был аналогичен первому пациенту: выявлено присутствие мутаций BRAF V600E и NRAS G13S.
Иммуногистохимическое исследование экспрессии немутантного белка NRAS выявило наличие положительного окрашивания в опухолевых клетках (красного цвета) и наличие негативного окрашивания в опухоль-ассоциированных лимфоцитах синего цвета (рис. 4).
TTGTC.GTGCGCTTTTCCCA С, С
ЛУ
a
Т Т
ATTGTCAGTGCGCTTTTCCCAACAC
b Л j. А А Л А
MWY vWVWHrw^
Рис. 2. Определение мутации в гене NRAS методом секвенирования по Сенгеру: a - без обогащения мутантным аллелем (визуализируется хроматограмма дикого типа); b - с обогащением мутантным аллелем (определяется нуклеотидная замена p.G13S (c.37 G>A)). Хроматограмма выполнена с обратного прай-мера
Fig. 2. Detection of the mutation in NRAS gene by Sanger sequencing: a - without enrichment of a mutant allele (shows a wild-type DNA chromatogram); b - with enrichment of mutant allele.(the nucleotide substitution of p.G13S (c.37 G>A)). The chromatogram was performed with the reverse primer
Рис. 3. Негативное иммуногистохимическое окрашивание с антителами к немутантному NRAS у пациента,
имеющего менее 5% мутантных клеток, *400 Fig. 3. Immunohistochemical staining with antibodies to non-mutant NRAS. *400. Negative immunohistochemical staining with antibodies to NRAS wild-type. The patient has less than 5% mutant cells, *400
Рис. 4. Позитивное иммуногистохимическое окрашивание с антителами к немутантному NRAS, х400
Fig. 4. Immunohistochemical staining with antibodies to non-mutant NRAS, *400. Positive immunohistochemical
staining with antibodies to NRAS wild-type, *400
Мутационные изменения при меланоме кожи затрагивают гены BRAF и NRAS, однако в 95% врожденных невусов наблюдаются подобного рода изменения [7]. Высокая распространенность BRAF-мутации отмечается и при диспла-стических невусах [8]. Большой процент мутаций в генах BRAF и NRAS в невусах доказывает то, что активация МАРК-киназного сигнального каскада из-за возникновения мутаций в генах BRAF и NRAS не является достаточной для злокачественной трансформации [9]. BRAF-мутации способствуют злокачественной гиперплазии ме-ланоцитов, но без дополнительных мутаций не способны инициировать процесс канцерогенеза. В частности, усиленная экспрессия онкогенных BRAF и NRAS в нормальных меланоцитах не-вуса запускает в них процессы апоптоза и параллельно с этим ограничивает процессы пролиферации [10]. Вместе с тем наличие таких драйверных мутаций, как BRAF и NRAS, является триггерным фактором в опухолевой трансформации нормальных клеток, ведет к образованию первичного опухолевого клона. Драйверные мутации создают генетическую нестабильность и приводят к появлению вторичных мутаций, под влиянием которых могут появляться уже новые субклоны опухолевых клеток, которые будут, в том числе, устойчивыми к химиотерапии. Драй-верная мутация создает идеальную мишень для таргетных («целевых») препаратов, поскольку установлено, что жизнеспособность опухолевой клетки зависит от наличия драйверных мутаций, которые «блокируют» другие механизмы
биологической регуляции в клетках [11]. К числу драйверных мутаций относят мутации в 600-м положении гена BRAF, а также в 12-, 13- и 61-м положениях гена NRAS.
У пациента из клинического случая № 1 незначительное содержание мутантных опухолевых клеток в образце соответствовало негативной иммуногистохимической реакции в отношении белка NRAS. У пациента из клинического случая № 2 наличие высокого числа мутантных клеток при секвенировании не было связано с уровнем NRAS. Различия белковой экспрессии NRAS у двух пациентов можно объяснить воздействием эпигенетических факторов на уровень белка. В качестве эпигенетических регуляторов экспрессии генов могут выступать микроРНК. Изменения экспрессионного профиля различных микроРНК способны оказывать влияние на экспрессию их генов-мишеней, среди которых могут быть гены BRAF и NRAS, а также регуляцию сигнальных каскадов с участием гена NRAS.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Определение мутационного статуса опухоли является важной составляющей частью персонифицированного подхода в терапии пациентов онкологического профиля. Выявление у больного с меланомой кожи мутации BRAF V600E является критерием, который должен учитываться при отборе пациентов для проведения таргетной терапии BRAF-ингибиторами. Детекция мутации в гене NRAS G13S (c.37 G>A) была описана COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/mutation/ overview?id=571), но, по данным литературы, она не имеет четко выраженной взаимосвязи с различными клинико-морфологическими данными пациентов, а также дальнейшим исходом заболевания.
В этой связи данный факт может не иметь важного прогностического значения в вопросе дальнейшей тактики ведения описанных пациентов, но при этом наглядно демонстрирует проявления вну-триопухолевой гетерогенности на молекулярно-ге-нетическом уровне. Наличие небольшого процента опухолевых клеток, имеющих мутации, может быть показателем того, что внутри опухоли существуют различные малые субпопуляции опухолевых клеток, которые эволюционируют по мере прогресси-рования заболевания и проявляют генотипические и фенотипические различия, в частности появление NRAS-мутантных клеток на фоне уже имеющихся BRAF-мутантных опухолевых клеток. Из-за этих различий опухолевых субклонов одна и та же опухоль может обладать различными механизмами
химиотерапевтической резистентности у одного и того же пациента. Существуют данные о том, что появление мутации в гене NRAS может быть также связано с применением BRAF-ингибиторов у пациентов с меланомой кожи в 18% случаев [12]. Различия в экспрессии немутантного белка NRAS могут быть связаны с постгеномными нарушениями в опухоли первого пациента.
ЛИТЕРАТУРА/ REFERENCES
1. Sun Y., Liu W.Z., Liu T., Feng X., Yang N., Zhou H.F. Signaling pathway of MAPK/ERK in cell proliferation, differentiation, migration, senescence and apoptosis. Re-cept Signal Transduct. Res. 2015; 35 (6): 600-604. DOI: 10.3109/10799893.2015.1030412.
2. Palmieri G., Ombra M., Colombino M., Casula M., Sini M., Manca A., Paliogiannis P., Ascierto P.A., Cossu A. Multiple molecular pathways in melanomagenesis: Characterization of Therapeutic Targets. Front Oncol. 2015; 10 (5): 183. DoiDOI: 10.3389/fonc.2015.00183.
3. Hymowitz S.G., Malek S. Targeting the MAPK Pathway in RAS Mutant Cancers. Cold Spring Harb Perspect. Med. 2018; 8 (11). piPIIi: a031492. DOI: 10.1101/cshper-spect.a031492.
4. Thomas N.E., Edmiston S.N., Orlow I., Kanetsky P.A., Luo L., Gibbs D.C., Parrish E.A., Hao H., Busam K.J., Armstrong B.K., Kricker A., Cust A.E., Anton-Culver H., Gruber S.B., Gallagher R.P., Zanetti R., Rosso S., Sacchet-to L., Dwyer T., Ollila D.W, Begg C.B., Berwick M., Con-way K., GEM Study Group. Inherited Genetic Variants Associated with Melanoma BRAF/NRAS Subtypes. Invest Dermatol. 2018; 138 (11): 2398-2404. DOI: 10.1016/j. jid.2018.04.025.
5. Stones C.J., Kim J.E., Joseph W.R., Leung E., Marshall E.S., Finlay G.J., Shelling A.N., Baguley B.C. Comparison of responses of human melanoma cell lines to MEK and BRAF inhibitors. Front Genet. 2013; 8 (4): 66. DOI: 10.3389/fgene.2013.00066.
6. Chiappetta C., Proietti I., Soccodato V., Puggioni C., Zaralli R., Pacini L., Porta N., Skroza N., Petrozza V., Potenza C., Della Rocca C., Di Cristofano C. BRAF and NRAS mutations are heterogeneous and not mutually exclusive in nodular melanoma. Appl. Immun. Mol. Morphol. 2015; 23 (3): 172-177. DOI: 10.1097/ PAI.0000000000000071.
7. Etchevers H.C., Rose C., Kahle B., Vorbringer H., Fina F., Heux P., Berger I., Schwarz B., Zaffran S., Ma-cagno N., Krengel S. Giant congenital melanocytic nevus with vascular malformation and epidermal cysts associated with a somatic activating mutation in BRAF. Pigment Cell Melanoma Res. 2018; 31 (3): 437-441. DOI: 10.1111/ pcmr.12685.
8. Roh M.R., Eliades P., Gupta S., Tsao H. Genetics of Me-lanocytic Nevi. Pigment Cell Melanoma Res. 2015; 28 (6): 661-672. DOI: 10.1111/pcmr.12412.
9. Xia J., Jia P., Hutchinson K.E., Dahlman K.B., Johnson D., Sosman J., Pao W., Zhao Z. A meta-analysis of somatic mutations from next generation sequencing of 241 melanomas: a road map for the study of genes with potential clini- cal relevance. Mol. Cancer Ther. 2014; 13 (7): 1918-1928. DOI: 10.1158/1535-7163.MCT-13-0804.
10. Francis J.H., Grossniklaus H.E., Habib L.A., Marr B., Abramson D.H., Busam K.J. BRAF, NRAS, and GNAQ mutations in conjunctival melanocytic Nevi. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 2018; 59 (1): 117-121. DOI: 10.1167/ iovs.17-22517.
11. THmar J., Vizkeleti L., Doma V., Barbai T., Rasy E. Genetic progression of malignant melanoma. Cancer Metastasis Rev. 2016; 35 (1): 93-107. DOI: 10.1007/s10555-016-9613-5.
12. Raaijmakers M.I., Widmer D.S., Narechania A., Eichhoff O., Freiberger S.N., Wenzina J., Cheng P.F., Mihic--Probst D., Desalle R., Dummer R.,Levesque M.P. Co-existence of BRAF and NRAS driver mutations in the same melanoma cells results in heterogeneity of targeted therapy resistance. Oncotarget. 2016; 7 (47): 77163-77174. DOI: 10.18632/oncotarget.12848.
Сведения об авторах
Аксененко Мария Борисовна, канд. мед. наук, доцент, кафедра патологической физиологии, КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого, г. Красноярск. ORCID iD 0000-0001-7660-700X.
Аверчук Антон Сергеевич, канд. биол. наук, доцент, кафедра патологической физиологии, КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого, г. Красноярск. ORCID ID 0000-0002-1284-6711.
Рукша Татьяна Геннадьевна, д-р мед. наук, зав. кафедрой патологической физиологии, КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого, г. Красноярск. ORCID ID 00000001-8142-4283.
(*) Аксененко Мария Борисовна, e-mail: aksenenko_ mariya@mail.ru.
Поступила в редакцию 14.07.2018 Подписана в печать 11.06.2019
Author information
Aksenenko Mariya В., PhD, Assistant of Professor, Department of Pathological Physiology, KrasSMU n.a. prof. V.F. Voyno-Yasenetsky, Krasnoyarsk, Russian Federation. ORCID iD 0000-0001-7660-700X.
Avershuk Anton S., PhD, Assistant of Professor, Department of Pathological Physiology, KrasSMU n.a. prof. V.F. Voyno-Yasenetsky, Krasnoyarsk, Russian Federation. ORCID ID 0000-0002-1284-6711.
Ruksha Tatiana G., DM, Head of Department of Pathophysiology, KrasSMU n.a. prof. V.F. Voyno-Yasenetsky, Krasnoyarsk, Russian Federation. ORCID iD 0000-0001-81424283.
(*) Aksenenko Mariya В., e-mail: aksenenko_mariya@ mail.ru.
Received 14.07.2018 Accepted 11.06.2019
