CC BY
112
УДК 537.533.3:581.133.8:581.4:582.282
ДЕЯКІ БІОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ГРИБА Cordyceps militaris (L.: Fr.) Fr. (Ascomycota) ЯК ПРОДУЦЕНТА ЛІКАРСЬКИХ РЕЧОВИН
О. Б. Михайлова
Н. Л. Поєдинок Інститут ботаніки ім. М. Г. Холодного НАН України, Київ
E-mail: mikhajlov_e@ukr.net
Отримано 26.02.2013
Наведено результати дослідження росту і морфологічних особливостей культур лікарського гриба Cordyceps militaris із колекції Інституту ботаніки ім. М. Г. Холодного НАН України. Методом сканувальної електронної мікроскопії досліджено характерні для C. militaris мікроморфологічні структури вегетативного міцелію. Морфолого-культуральні дослідження проводили на чотирьох агаризованих живильних середовищах. Для всіх досліджених штамів оптимальними для вегетативного росту були глюкозо-пептон-дріжджовий агар і мальц-екстракт агар, температура інкубації — 16 °С, критична температура — 36 °С. Оптимальними джерелами вуглецю для вегетативного росту міцелію були глюкоза, лактоза і сахароза, серед органічних джерел азоту — пептон і дріжджовий екстракт, рН 6,0-6,5. Опромінення світлом різної природи стимулювало швидкість радіального росту гриба на агаризованих та накопичення біомаси — на рідких живильних середовищах.
Ключові слова: Cordyceps militaris, сканувальна електронна мікроскопія, ріст, морфологія, температура інкубації, джерела вуглецю та азоту, рН, міцеліальна маса.
Пошук нових природних джерел фізіологічно активних сполук з метою одержання ефективних та безпечних біопрепаратів є однією з важливих задач сучасної біотехно-логії. В останні три десятиріччя у фармацевтичній промисловості відбулися зміни, пов’язані з розвитком біотехнології. Серед лікарських препаратів значну увагу почали привертати засоби, отримані біотехнологіч-ним способом на основі грибної біомаси. Особливістю цих біотехнологій було те, що як продуценти частіше стали використовувати макроміцети, особливо Basidiomycota та Ascomycota, і основне місце серед препаратів із грибів посідали вже не антибіотики, а серцево-судинні, протиракові, імуности-мулювальні, гепатопротекторні лікарські засоби і харчові добавки на основі біологічно активних речовин (БАР) грибного міцелію. Відомі тривалий час лише вузькому колу мікологів-систематиків ентомопатогенні гриби роду Cordyceps Fr. тепер у багатьох країнах опинились у центрі уваги біотехно-логів. Найвідомішим видом цього роду, що має практичне значення, є Cordyceps тіШа-^.: Fr.) Fr. Цей гриб може уражувати комах у різних фазах розвитку, але, як правило, він паразитує на лялечках та гусеницях лускокрилих (Lepidoptera) [1, 2].
Лікувальні властивості речовин, одержаних із видів роду Cordyceps, відомі вже понад 2 000 років і їх широко застосовують у традиційній китайській та тибетській медицині [3, 4]. Сучасними дослідженнями доведено, що окремі види роду Cordyceps здатні синтезувати цілу низку БАР [5-7]. Особливу роль серед них відіграють полісахариди — D-глюкани, галактозоаміноглю-кани та інші сполуки, наприклад кордице-пін [8]. Ці сполуки активізують імунні клітини організму людини, які збільшують продукцію цитокінів та інтерферону, підсилюють резистентність до різних патогенних мікроорганізмів, підвищують адаптаційні можливості організму, мають антиоксидантну активність і перешкоджають процесам старіння [5, 9]. Встановлено, що препарати з кордицепсу, як й інші полісахариди грибів, що входять до їхнього складу, зменшують негативну дію хемо- та та радіотерапії.
Вузька специфічність субстратів, сезонність, особливість традиційних регіонів зростання і збору цих грибів визначають надзвичайно високу ціну їх на світовому ринку (понад 1 тис. дол. США за 1 кг плодових тіл). Саме тому актуальним є розроблення високоефективних біотехнологій культивування на штучних субстратах, що дасть
змогу зменшити вартість відповідних сполук і зробить їх доступними для широких верств населення.
Одним із методів промислового культивування Cordyceps тіШап^ є одержання плодових тіл твердофазовим культивуванням з подальшим виділенням та очищенням певних цільових речовин. Але більш технологічним та ефективним є спосіб одержання грибної біомаси і метаболітів С. тіШап^ на рідких живильних середовищах в умовах глибинної культури, що уможливлює одержання за короткий час необхідних речовин із заданими властивостями [3, 10-12].
Біотехнологічне використання С. тіШа-
як потенційного продуцента БАР із різними біологічними властивостями стало можливим лише з уведенням його в чисту культуру. Проте дані щодо особливостей росту і розвитку в чистій культурі обмежені, а іноді й суперечливі. Під час культивування грибів у вегетативній формі одним із важливих етапів є їх коректна ідентифікація та контроль чистоти культури-продуцента за характерними мікроморфологічними і куль-туральними ознаками. Саме тому є потреба в подальшому детальному вивченні ана-морф і структур вегетативного міцелію, основних морфологічних і культуральних ознак за вирощування в різних умовах культивування, що дає змогу за певними морфологічними ознаками охарактеризувати та ідентифікувати цей вид у культурі.
Метою роботи було дослідження біологічних властивостей С. тіШап^ у культурі, зокрема мікроморфології вегетативного міцелію, особливостей росту і розвитку на живильних середовищах різного складу, а також інших факторів росту та біосинте-тичної активності штамів С. тіШап^.
Матеріали і методи
Об’єктами дослідження були чисті культури С. тіШап^ (2 штами), які зберігаються в Колекції культур шапинкових грибів (ІВК) Інституту ботаніки ім. М. Г. Холодного нАн України [13].
Дослідження морфології та росту культур проводили на стандартних і модифікованих агаризованих живильних середовищах різного складу: мальц-екстракт агар (МЕА), сусло-агар (4° за Балінгом) (СА), картопляно-декстрозний агар DIFCO (КДА), глюкозо-пептон-дріжджовий агар (ГПДА), г/л: глюкоза — 25,0; пептон — 5,0; дріжджовий екстракт — 3,0; агар-агар — 20, рН 6,5, у чашках Петрі. Поверхневе культивування
здійснювали за температур: 4,0±0,1; 16±0,1; 26,0±0,1 °С. Для перевірки життєздатності культур їх інкубували на ГПДА за температур 30-38 °С з інтервалом 1 °С. Після третьої доби інкубації враховували наявність чи відсутність росту міцелію. Збереження або втрату життєздатності міцелію культур перевіряли у процесі подальшого інкубування за температури 26 °С.
Радіальну швидкість росту розраховували за методикою [14].
Мікроструктури вегетативного міцелію С. miШans досліджували в світловому мікроскопі МБІ-15, а також у сканувально-му електронному мікроскопі СЕМ JSM-35C (Японія), використовуючи модифікований метод Квательбаума та Карнера [15].
Наявність у вегетативному міцелії досліджених штамів грибів оксидаз (лакази, тирозинази, пероксидази) встановлювали за допомогою якісних ензиматичних реакцій на наявність восьми ензимів, які характеризують метаболізм азотних сполук (протеїна-зи, уреази, нітрат-редуктази), вуглеводів (амілази, целюлази, ксиланази, Р-глюкози-дази), ліпідів (ліпази) за методом [16].
Для визначення впливу кислотності середовища на ріст міцелію використовували рідке синтетичне середовище А такого складу (г/л): глюкоза — 20,0; (МН4)2НР04 — 4,0; КН2Р04 — 1,0; К2НР04 3Н2О — 1,0; MgSO4•7H2O — 0,5; Мп8047Н20 — 0,005; FeCl3•6H2O — 0,005; Си8045Н20 — 0,003; ZnCl2 — 0,005. Значення рН у середовищі змінювали в інтервалі від 2 до 8 з кроком 1 за допомогою розчинів 1Н КОН і 1Н НС1. Початкове значення рН середовища (контроль) визначали після стерилізації.
Потреби культур у джерелах вуглецевого та азотного живлення визначали на синтетичному середовищі А, склад якого наведено вище. Джерелами вуглецю були моно-(глюкоза, ксилоза, маноза), ди- (сахароза, лактоза, мальтоза) і полісахариди (крохмаль), які додавали в кількості, еквівалентній 20 г глюкози за вуглецем, рН 6,5.
Джерелами азоту слугували ЫаЫ03, (ЫН4)2в04, (МН4)2НР04, пептон, дріжджовий екстракт, кукурудзяний екстракт (КЕ), які вносили у середовища в кількості, еквівалентній 4 г (МН4)2НР04 за азотом. Дослідження проводили у колбах Ерленмеєра місткістю 150 мл з 50 мл живильного середовища. Інокулюмом були 7-добові культури гриба, попередньо вирощені на ГПДА за температури 16 ± 1 °С. У кожну колбу з рідким середовищем вносили три міцеліальні диски ^ = 5 мм). Культури інкубували у стаціонарних умовах
за 16 ± 1 °С. Біомасу відокремлювали від куль-туральної рідини (КР) шляхом фільтрації, коли в одному з варіантів міцелій повністю покривав поверхню середовища. Кількість біомаси визначали ваговим методом після висушування до сталої маси за температури 105±1 °С [17]. Також вираховували кінцеве значення рН культуральної рідини.
Для визначення кількості екзополісаха-ридів їх осаджували 10 мл 96%-го етанолу з 5 мл КР. Розчин відстоювали протягом 24 год у холодильнику за температури 4 ± 1 °С. Наступної доби осад відділяли центрифугуванням упродовж 25 хв у режимі 5 000 g. Надосадову рідину зливали, осад розчиняли в 5 мл гарячої дистильованої води. З отриманого розчину відбирали 2 мл рідини, в якій визначали кількість екзополісахаридів фенол-сірчаним методом [18].
Експериментальні дослідження впливу світла на культурально-морфологічні особливості продуцентів проводили з використанням експериментальних установок, які забезпечували генерацію лазерного випромінювання із заданими параметрами на довжинах хвиль 450,0 та 632,8 нм з можливостями опромінення культур у розчинах, на агарі тощо. Середня доза випромінювання на мішені становила близько 250 мДж/см2.
Статистичну обробку результатів виконували стандартними методами з використанням t-критерію Стьюдента за допомогою програмного забезпечення Microsoft Excel. Усі досліди проводили в 5 повторах. Дані вважали достовірними за P < 0,05.
Результати та обговорення
Встановлено, що вегетативний міцелій С. militaris складається з тонких (2-4 мкм), помірно розгалужених, рівномірно септован-них гіф, які зливаються між собою, утворюючи численні міцеліальні тяжі. Досліджені культури на всіх живильних середовищах проходили анаморну стадію (конідіальні спо-роношення) (рис. 1).
Рис. 1. Cordyceps militaris: конідіальне спороношення Cephalosporium militare: СЕМ JSM-35C. x18 000
Фіаліди конічні, пляшкоподібні, 10-30x1,5-2,3 мкм, утворюються поодиноко з клітин гіф через різні інтервали або в пучках і групами (часто на різних рівнях) по дві — чотири. Конідії формуються на верхівках фіалід. Перша конідія звичайно більша, еліптична або короткоциліндрична, розміром 3,2-6,0x3,0 мкм у діаметрі, наступні — шароподібні діаметром 2,3-3,0 мкм.
Щодо належності анаморфи Cordyceps militaris до того чи іншого роду єдиної думки немає. Доволі тривалий час вважали, що анаморфою C. militaris є Isaria farinose (Holm.) Fr., проте після виділення цього гриба в чисту культуру Petch [цит. за 2] уперше зробив припущення, що його ана-морфа належить до роду Cephalosporium. Саме такого висновку дійшов Kobayasi [19], який вивчав цей вид у культурі. Коваль [2] відносить цю конідіальну стадію до Cephalosporium militare. У більш пізніх джерелах вона фігурує як Lecanicillium sp. [20, 21] або як представник роду Paecilomyces [22].
Крюков та ін. [23] відзначають, що ізоляти, отримані з аскоспор C. militaris, мали анаморфи, які за своїми морфологічними ознаками повністю збігались із зазначеними в літературі як Lecanicillium sp. [20, 21]. Окрім того, у посівах зі стром цього гриба поряд із типовою анаморфою спостерігалася й інша, ознаки якої чітко вкладаються у діагноз виду Isaria farinose [23]. Проте асоціація I. farinose з C. militaris залишається незрозумілою, і цей факт констатують різні дослідники. В умовах нашого експерименту спостерігали лише один вид конідіального спороношення.
Слід також зазначити, що нами встановлено наявність на вегетативному міцелії C. militaris численних хламідоспор (рис. 2) і скупчення екзометаболітів (рис. 3).
Таким чином, дослідження мікроморфо-логії вегетативного міцелію культур С. mili-taris з використанням світлової та електронної мікроскопії дало змогу встановити
Рис. 2. Cordyceps militaris: вегетативний міцелій:
хламідоспори, СЕМ JSM-35C. x200
Рис. 3. Cordyceps mШtaris: вегетативний міцелій:
екзометаболіти, СЕМ ^М-35С. х6 000
наявність у всіх штамів характерних для даного виду мікроструктур (конідіального спороношення, анастомозів, міцеліальних тяжів), які дозволяють ідентифікувати та контролювати чистоту культури продуцентів у процесі їх культивування.
Важливе практичне значення мають дані щодо збереження життєздатності ентомопа-тогенних грибів в умовах чистої культури. При цьому слід враховувати її трофічні особливості. Було встановлено, що компонентний склад живильних середовищ для цієї групи грибів зумовлений їхніми трофічними особливостями, які відрізняються за специфічними потребами в різних компонентах, спричинюючи перехід від паразитного існування до сапротрофного [1]. За даними літератури, культури С. тіШагіз культивуються і зберігаються на стандартних живильних середовищах: мальц-естракт агар (МЕА) і картопляно-декстрозний агар (КДА) [11,
12, 24]. Підбираючи склад живильного середовища, брали до уваги природну приуроченість цього виду до протеїнових субстратів і виходили з того, що середовище має містити протеїни, які легко руйнуються протеолітичними ензимами ентомопатогенних грибів, тимчасом як вуглеводи і жири можуть бути присутні в мінімальній кількості. Тому під час проведення морфолого-культураль-них досліджень крім стандартних живильних середовищ (МЕА, КДА) використовували також СА і ГПДА. Оптимальне живильне середовище для росту культур підбирали, враховуючи інтенсивність розвитку вегетативного міцелію, його пігментацію, морфологію колоній, радіальну швидкість росту штамів, а також фізіологічну активність культур. Особливу увагу приділяли дослідженню чинника, що впливає на збереження життєздатності культур, — температурі інкубації.
Культури С. тіШагі^ на використаних живильних середовищах під час культивування за всіх досліджених температур мали
стабільні характерні морфологічні ознаки, тобто формували дуже щільні, повстисті колонії з великою кількістю сплутаних повітряних гіф, рівним або хвилястим краєм. У темряві формувались колонії білого кольору, за освітлення спостерігали появу яскраво-жовтої пігментації міцелію (рис. 4). Реверзум із чіткими радіальними складками, його колір збігався із кольором середовища.
За результатами дослідження впливу низьких і високих температур на ріст та життєздатність міцелію було встановлено, що за умов низьких температур (4±0,1 °С), незалежно від складу середовища, спостерігався слабкий вегетативний ріст (менш ніж
0,75 мм/добу), і міцеліальні колонії зберігали свої основні морфологічні ознаки. Слід зазначити, що досліджені штами незадовільно переносили підвищення температури. За температури 34 °С ріст міцелію був відсутній, однак культури не втрачали життєздатності і відновлювали ріст при 26 °С протягом тижня. Температура 36±0,1 °С виявилася критичною, і штами С. тіШап^ повністю втрачали життєздатність. Відомо [24], що загибель клітин міцелію за високих температур є наслідком порушення координації процесу денатурації протеїнів.
Проведене дослідження дало змогу встановити, що найсприятливішими середовищами для росту та розвитку вегетативного міцелію С. тіШап^ були ГПДА та МЕА, а оптимальною для росту міцелію досліджених штамів С. тіШагіз температурою — 16±0,1 °С (табл. 1).
Рис. 4. Міцеліальна колонія C. mШtans на середовищі ГПДА:
25-та доба культивування за відсутності освітлення (А); при освітленні (Б)
Таблиця 1. Швидкість радіального росту (Уг, мм/добу) вегетативного міцелію Cordyceps mШtans на агаризованих середовищах за різних температур інкубації
Вид, штам Температура інкубації, °С Уг, мм/добу на різних живильних середовищах
СА МЕА ГПДА КДА
Cordyceps тіШагіч, 1862 16±0,1 1,32±0,6 1,5±0,4 1,83±0,4 1,12±0,2
26±0,1 1,23±0,2 1,53±0,3 1,61±0,4 1,42±0,6
С. тіШагіч, 2029 16±0,1 1,43±0,2 1,41±0,2 1,45±0,5 0,96±0,2
26±0,1 1,13±0,4 1,12±0,2 1,21±0,4 1,16±0,3
Примітка: у цій та в наступних таблицях для всіх показників значення достовірні за Р < 0,05.
Згідно з одержаними значеннями радіальної швидкості росту досліджені штами С. тіШагіз можна віднести до групи грибів, що ростуть повільно.
Підбір оптимальних субстратів у процесі культивування грибів з метою цілеспрямованого синтезу кінцевих продуктів неможливо проводити без знання їхніх фізіолого-біохі-мічних властивостей, зокрема активності ензимів. У природі ентомопатогенні гриби здатні синтезувати значну кількість ензимів, з яких найбільше значення мають хіти-наза, протеїназа, ліпаза та амілаза [1, 2].
Нами досліджено активність таких гідролітичних ензимів: амілази, целюлази, Р-глюкозидази, ксиланази, протеїнази, ніт-рат-редуктази, уреази, ліпази у культурах С. тіШапз. У всіх штамів спостерігали позитивні реакції на більшість ензимів, активність яких визначали. Не виявлено наявності ксиланази (табл. 2).
На цьому етапі експериментів у ході проведення первинного скринінгу здійснено дослідження наявності певних ензимів за допомогою якісних тестів (у табл. 2 відображено «+» або «-»), але в подальшому ми плануємо провести кількісні дослідження окремих ензимів у штамів, які
вважаємо біотехнологічно перспективними продуцентами. Проведення кількісних визначень ензиматичної активності всього спектра ензимів — трудомісткий процес і на даному етапі досліджень був недоцільним.
Визначення наявності окисно-відновних ензимів (лакази, тирозинази і пероксидази) показало, що всі досліджені культури виявили позитивну реакцію лише на тирозиназу, реакції на лаказу і пероксидазу не спостерігали.
Таким чином, у біотехнології культивування цієї групи грибів з урахуванням їхніх екологічних та фізіологічних особливостей живлення слід використовувати середовища, які містять джерела протеїнів.
Одним із найважливіших фізико-хіміч-них параметрів середовища є рН, значення якого впливає на фізіологічну активність культур та продуктивність біотехнологічно-го процесу. Дослідження впливу середовища на ріст культур показало необхідність визначення оптимальних значень рН для кожного штаму, оскільки це впливає на підвищення продуктивності біотехнологічного процесу. Вираховуючи оптимальне для росту культур значення рН середовища в діапазоні від 2 до 8, встановили, що культури починали рости за рН 3,0 (рис. 5).
Таблиця 2. Энзиматичні реакції на наявність гідролітичних ензимів у досліджених штамів Cordyceps mШtaris
Вид, штам Ензим
Протеїназа Амілаза Целюлаза Р-Глюкозидаза Ксиланаза Уреаза Нітрат- редуктаза Ліпаза
С. тіШа^, 1862 +++ ++ + + _ + + ++
С. тіШа^, 2029 +++ ++ ++ + _ + + ++
Примітка: « - » — реакція відсутня; «+» — слабка реакція; «++» — помірна реакція; «+++» — сильна реакція.
Рис. 5. Накопичення міцеліальної маси штамами C. militaris на середовищах з різними
початковими значеннями рН (14-та доба):
штам 1862; штам 2029.
Оптимальним для росту досліджених штамів є рН 6,0-6,5. За цих значень вихід біомаси становив понад 11,5 г/л на 14-ту добу культивування у стаціонарних умовах. За даними літератури, під час вирощування культури C. militaris діапазон оптимальних значень рН для росту міцелію і накопичення екзополісахаридів становив 5,0-6,0 [24-26]. За іншими даними, у разі дослідження фізіології C. militaris на рідких живильних середовищах максимальну концентрацію біомаси (8,1 г/л) було одержано за початкового значення рН 9,0 [3].
Виходячи з отриманих нами даних і аналізу літератури можна зробити висновок, що залежність росту культур C. militaris від рН середовища є штамоспецифічною ознакою і для кожного штаму на певному середовищі слід знаходити його оптимальне значення.
Для росту вегетативного міцелію C. mili-taris кращими джерелами вуглецю були глюкоза, лактоза і сахароза (табл. 3).
Максимальну кількість міцеліальної маси спостерігали для штаму C. militaris 1862 (понад 11,2 г/л), C. militaris 2029 (12,9 г/л) і екзополісахаридів (2,6 і 2,4 г/л) відповідно.
За даними літератури [24], штами C. mili-taris добре використовують глюкозу, крохмаль і сахарозу, на середовищах з такими
вуглеводами культури накопичують понад 8,5 г/л біомаси на 4-ту добу культивування.
Нами встановлено, що під час росту культур на середовищах із різними джерелами вуглецевого живлення рН змінювалось у кислий бік. Зниження рН середовища залежало в основному від природи джерела вуглецю і швидкості його використання. На живильних середовищах із повільним використанням джерела вуглецю, зокрема крохмалю, значення рН знижувалось у процесі росту меншою мірою (до 4,8-5,2), ніж на середовищах з глюкозою (4,0-4,2).
Як джерела азоту застосовували неорганічні (ЫаЫ03, (ЫН4)2НР04, (ЫН4)2804) і органічні (пептон, дріжджовий і кукурудзяний екстракти). Серед органічних оптимальними джерелами азоту для росту С. тіШа^ були пептон і дріжджовий екстракт (накопичення міцеліальної маси — понад 12 г/л) (табл. 4).
Оптимальним серед неорганічних джерел азоту виявився фосфат амонію (кількість біомаси — понад 10,0 г/л). Це можна пояснити тим, що фосфат амонію є джерелом не лише азоту, але й фосфору, який є необхідним для нормального росту грибів.
Слід зазначити, що оптимальні для накопичення біомаси С. тіШагі^ глюкоза, сахароза, пептон, дріжджовий екстракт є поширеними компонентами рідких і твердих живильних середовищ і їх найчастіше застосовують для культивування різних видів грибів, у тому числі й роду Cordyceps [11, 12, 24-26].
Визначення накопичення екзополісаха-ридів на рідких середовищах (табл. 4) показало, що їх максимальна кількість фіксується на середовищах із пептоном та дріжджовим екстрактом (2,9 і 2,1 г/л відповідно). Найменший вплив на цей показник мали середовища з мінеральними джерелами азоту.
За даними літератури, накопиченню екзополісахаридів сприяли фосфат амонію
Таблиця 3. Вплив джерел вуглецю на ріст C. militaris і синтез екзополісахаридів
Джерело вуглецю C. militaris, 1862 C. militaris, 2029
Біомаса, г/л Екзополісахариди, г/л Біомаса, г/л Екзополісахариди, г/л
Глюкоза 11,3±0,4 2,4±0,2 12,7±0,3 2,2±0,1
Крохмаль 10,8±0,3 1,8±0,1 11,5±0,2 1,3±0,3
Ксилоза 9,2±0,3 2,2±0,3 9,8±0,3 1,9±0,2
Лактоза 11,2±0,5 2,4±0,3 12,1±0,3 2,2±0,2
Мальтоза 11,0±0,3 1,1±0,2 11,6±0,4 0,9±0,1
Маноза 8,5±0,4 1,7±0,2 9,3±0,2 1,3±0,2
Сахароза 11,5±0,3 2,6±0,1 12,9±0,4 2,1±0,2
Таблица 4. Вплив джерел азоту на ріст C. mШtans і синтез екзополісахаридів
Джерело азоту C. miШaris, 1862 C. miШaris, 2029
Біомаса, г/л Екзополісахариди, г/л Біомаса, г/л Екзополісахариди, г/л
№N03 6,7±0,4 1,2±0,1 7,7±0,3 1,2±0,2
(га4)2НР04 10,0±0,2 1,0±0,1 9,4±0,3 1,0±0,2
^Н4^04 6,0±0,2 0,3±0,2 5,3±0,2 0,3±0,1
Пептон 12,0±0,4 2,9±0,3 12,8±0,4 2,6±0,1
Дріжджовий екстракт 12,0±0,3 2,1±0,2 12,5±0,3 2,0±0,3
Кукурудзян ий екстракт (КЕ) 8,0±0,2 1,4±0,1 7,7±0,2 1,4±0,2
і пептон, на цих середовищах кількість їх становила 1,05 і 1,19 г/л відповідно [12]. У роботі [24] наведено дані щодо впливу джерел вуглецю й азоту на накопичення міцеліальної маси та екзополісахаридів. Найсприятливішими джерелами вуглецю виявились кукурудзяний екстракт і соєвий пептон ( 1,97 та 1,06 г/л відповідно).
Отже, особливості накопичення біомаси та екзополісахаридів С. тіШагі^ залежать передусім від складу середовища і пов’язані з наявністю речовин-індукторів та хімічною природою сполук, що є джерелами вуглецю й азоту для гриба.
Оскільки комплексні середовища, з одного боку, є сприятливішими для росту й одержання БАР з грибів, ніж синтетичні, а з другого — відносно дешевими, за культивування С. тіїиагі^ доцільно використовувати середовища з пептоном і дріжджовим екстрактом.
Дані літератури, а також результати нашої роботи свідчать, що фізіологічні властивості різних видів грибів суттєво різняться і тому не може існувати універсального живильного середовища, склад якого був би оптимальним і придатним для будь-якої культури. Одержані дані щодо росту і біо-синтетичної активності досліджених штамів С. тіШап^ дають змогу в подальшому спрог-нозувати оптимізацію рідких живильних середовищ для глибинного культивування з метою одержання міцеліальної маси та екзо-полісахаридів.
У літературі ми не знайшли даних стосовно впливу світла на розвиток вегетативного міцелію. Проте відомо, що світло також впливає на морфологію культур і позначається на характері подальшого плодоношення.
Дослідження впливу світла на швидкість радіального росту і морфологію колоній штамів С. тіШап^ під час культивування на агаризованому середовищі показало, що опромінення синім світлом (довжина хвилі 450,0 нм) збільшувало швидкість радіального росту С. тіШагі^ на 10,0% , а опромінення червоним світлом (632,8 нм) — на 13,8% . На 4-ту добу після опромінювання С. тіШагі^ у морфології його колоній на СА з’являються відмінності: у дослідному варіанті на відміну від контрольного край колонії стає білим пухнастим, ближчий до центру злегка втиснений міцелій жовтіє (рис. 6).
Опромінення посівного міцелію в імпульсному режимі (450,0 нм) індукувало формування стром гриба С. тіШап^ на рідкому живильному середовищі з пептоном (рис. 7, А, Б).
Опромінення блакитним світлом (450 нм) стимулювало синтез біомаси С. тіШап^ (5-10%). Як блакитне, так і червоне (632,8 нм) світло не впливало на акумуляцію ендополісахаридів і дещо зменшувало продукцію екзополісахаридів (табл. 5).
Таблиця 5. Ріст C. mШtans і синтез полісахаридів після опромінення
Довжина хвилі Біомаса, а.с.в. Ендополісахариди, % Екзополісахариди, г/л
Без опромінення 5,33±0,09 13,2±0,33 5,5±0,11
450,0 нм 6,18±0,17 13,3±0,47 3,3±0,08
632,8 нм 5,67±0,26 13,5±0,51 3,8±0,10
Рис. 6. Міцеліальні колонії Cordyceps mШtaris на СА після опромінення:
А — Не-№ лазером, довжина хвилі 632,8 нм; Б — аргоновим лазером, довжина хвилі 450 нм
А
Б
Рис. 7. Утворення стром Cordyceps miШaris на рідкому середовищі з пептоном:
А — контроль; Б — після опромінення в імпульсному режимі (450,0 нм)
Таким чином, за допомогою сканувально-го електронного мікроскопа досліджено основні мікроморфологічні особливості вегетативного міцелію С. тіШап^. Виявлені мікроморфологічні ознаки можна використовувати для ідентифікації культур цього виду та контролю чистоти у вегетативній стадії росту за умов штучного культивування.
Отримано дані про ріст і морфологію культур С. тіШа^ на агаризованих живильних середовищах різного складу за різних температур інкубації. За величиною швидкості росту досліджені штами можуть бути віднесені до групи грибів, що ростуть повільно. Проведені якісні ензиматичні
тести показали, що досліджені культури мають значний набір гідролітичних ензимів
і за умов збереження в умовах колекції не втрачають своєї фізіологічної активності. Встановлено оптимальні для росту джерела вуглецю (глюкоза, лактоза і сахароза), органічні джерела азоту (пептон, дріжджовий екстракт) та фосфат амонію (рН 6,0-6,5).
Доведено, що опромінення світлом різної природи стимулює біологічну активність вегетативного міцелію, що сприяє збільшенню швидкості радіального росту та накопиченню біомаси на рідких середовищах.
ЛІТЕРАТУРА
1. Евлахова А. А. Энтомопатогенные грибы. — Л.: Наука, 1974. — 260 с.
2. Коваль Э. З. Клавиципитальные грибы СССР. — К.: Наук. думка, 1984. — 287 с.
3. Kim S. W., Xu C. P., Hwang H. J. et al. Production and characterization of exopolysaccharides from an entomopathogenic fungus Cordyceps militaris NG3// Biotecnol. Progr. — 2003. — V. 19. — P. 428-435.
4. Yu K. W., Suh H. J., Bac S. H. et al. Chemical properties and physiological activities of stromata of Cordyceps militaris // J. Microbiol. Biotechnol. — 2001. — V. 11. — P. 266-274.
5. Ng T. B., Wang H. X. Pharmacological actions of Cordyceps, a prized folk medicine //J. Pharm. Pharmacol. — 2005. — V. 57, N 12. — P. 1509-1519.
6. Isaka M., Kittakoy P., Kirtikara K., Hywel-Jones N. Bioactive substances from incect pathogenic fungi // Acc. Chem. Res. — 2005. — V. 38, N 10. — P. 813-823.
7. Dai Yu-Ch, Yang Zh-L., Cui B-K, Yu Ch-J. Species diversity and utilization of medicinal mushrooms and fungi in China (review) // Int. J. Med. Mushrooms. — 2009. — V. 11, N 3. — P. 287-302.
8. Kim G. Y., Yun J. W. Water extract of Cordyceps militaris enhances maturation of murine bone marrow-derived dendritic cells in vitro // Biol. Pharm. Bull. — 2006. — V. 29, N 2. — P. 354-360.
9. Leung P. H., Zhang Q. X., Wu J. Y. Mycelium cultivation, chemical composition and antitumour activity of a Tolypocladium sp. Fungus isolated from wild Cordyceps sinensis // J. Appl. Microbiol. — 2006. — V. 101. — P. 275-283.
10. Xu C. P. Application of statistically based experimental designs for the optimization of exo-polysaccharide production by Cordyceps militaris NG3 // Biotechnol. Appl. Biochem. — 2002. — V. 36, Pt. 2. — P. 127-131.
11. Dong C. H., Yao Y. I. Nutritional requirements of mycelial growth of Cordyceps sinensis in submerged culture / J. Appl. Microbiol. — 2005. — V. 99, N 3. — P. 483-492.
12. Kim S. W., Hwang H. J., Xu C. P. Optimization of submerged culture process for the production of mycelial biomass and exo-polysaccharides by Cordyceps militaris C738 // Ibid. — 2003. — V. 94. — P. 120-126.
13. Бухало А. С., Митропольська Н. Ю., Михайлова О. Б. Каталог культур Колекції культур шапинкових грибів (ІБК). — К.: Альтерпрес, 2011. — 100 с.
14. Соломко Е. Ф., Ломберг М. Л., Митропольська Н. Ю. Ріст окремих видів лікарських макроміцетів на живильних середовищах різного складу // Укр. ботан. журн. — 2000. — Т. 57, № 2. — С. 119-126.
15. Бухало А. С. Высшие съедобные базидио-мицеты в чистой культуре. — К.: Наук. думка, 1988. — 144 с.
16. Molitoris H. P. Methods for determination of enzymatic activities of marine fungi // Czech Mycol. — 2000. — V. 52, N 2. — P. 97-24.
17. Методы экспериментальной микологии: Справочник / Под ред. В. И. Билай. — К.: Наук. думка, 1982. — 550 с.
18. Варбанец Л. Д., Здоровенко Г. М., Кни-рель Ю. А. Методы исследования эндотоксинов. — К.: Наук. думка, 2006. — 238 с.
19. Kobayasi Y., Shimizu D. The genus Cordyceps and its allies from New Guinea // Bull. Nat. Sci. Mus., Ser. B (Bot.). — 1976. — V. 2, N 4. — P. 133-151.
20. Zare R., Gams W. A revision of Verticillium sect. Prostrata. IV. The genera Lecanicillium and Simplicillium gen. nov. // Nova Hedwigia. — 2001. — V. 73, N 1-2. — P. 1-50.
21. Zare R., Gams W. A revision of the Verticillium fungicola species complex and its affinity with the genus Lecanicillium // Mycol. Res. — 2008. — V. 112, N 7. — P. 811-824.
22. Bridge P. D, Clark M. S., Pearce D.A. A new species of Paecilomyces isolated from the Antarctic springtail Cryptopygus antarcticus // Mycotaxon. — 2005. V. 92. — P. 213-222.
23. Крюков В. Ю, Ярославцева О. Н, Седнев Г. Р., Борисов Б. А. Локальные эпизоотии, вызванные кордиципитоидными грибами (Ascomycota, Hypocreales), в популяциях лесных чешуекрылых и пилильщиков летне-осеннего комплекса в Сибири // Микол. фитопатол. — 2010. — Т. 44, Вып. 4. — С. 315-328.
24. Park J. P., Kim S. W., Hwang H. J., Yum J. W. Optimization of submerged culture conditions for the mycelial growth and exobiopolymer production by Cordyceps militaris// Lett. Appl. Microbiol. — 2001. — V. 33. — P. 76-81.
25. Билай В. И. Основы общей микологии. — К.: Вища школа, 1989. — 392 с.
26. Kim H. O., Yun J. W. A comparative study on the production of exo-polysaccharides between two entomopathogenic fungi Cordyceps militaris and C. sinensis in submerged mycelial cultures // Ibid. — 2005. — V. 99, N 4. — P. 728-738.
НЕКОТОРЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГРИБА Cordyceps militaris (L.: Fr.) Fr. (Ascomycota) КАК ПРОДУЦЕНТА ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ
О. Б. Михайлова Н. Л. Поединок
1нститут ботаники им. Н. Г. Холодного НАН Украины,
Киев
E-mail: mikhajlov_e@ukr.net
Представлены результаты исследования роста и морфологических особенностей культур лекарственного гриба Cordyceps militaris из коллекции Института ботаники им. Н. Г. Холодного НАН Украины. Методом сканирующей электронной микроскопии изучены характерные для данного вида микроморфоло-гические структуры. Морфолого-культураль-ные исследования проводили на четырех ага-ризованных питательных средах. Для всех исследованных штаммов оптимальными для вегетативного роста были глюкозо-пептон-дрожжевой агар и мальц-экстракт агар, температура инкубации — 16 °С, критическая температура — 36 °С. Оптимальными источниками углерода для вегетативного роста мицелия были глюкоза, лактоза и сахароза, среди органических источников азота — пептон и дрожжевой экстракт, рН 6,0-6,5. Облучение светом различной природы стимулировало скорость радиального роста гриба на агаризованных и накопление биомассы — на жидких питательных средах.
Ключевые слова: Cordyceps militaris, сканирующая электронная микроскопия, рост, морфология, температура инкубации, источники углерода и азота, рН, мицелиальная масса.
SOME BIOLOGICAL PROPERTIES OF Cordyceps militaris (L.: Fr.) Fr.
(Ascomycota) MUSHROOM AS PRODUCER OF MEDICINAL SUBSTANCES
O. B. Mykchaylova N. L. Poyedinok
Kholodny Institute of Botany of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: mikhajlov_e@ukr.net
Results of the study on growth and morphological peculiarities of valuable medicinal mushroom Cordyceps militaris from the culture collection of mushrooms of Kholodny Institute of Botany of the National Academy of Sciences of Ukraine are given. Using the method of scanning electron microscopy, the micro-morphological structures specific to this species were studied. This allows identifying this species in pure culture. Culture-morphological studies were performed on four agar nutrient media. Glucose-peptone-yeast agar medium, malt agar extract and incubation temperature of 16 °C were the most favorable for the vegetative growth of all the tested strains. Temperature of 36 °C is critical. Maximal growth of C. militaris was observed at pH 6.0-6.5. The optimal sources of carbon for vegetative mycelium growth were glucose, lactose and sucrose, whereas peptone and yeast extract were the best sources of nitrogen. Light irradiation of different nature stimulated the radial growth in agar media and accumulation of their biomass in liquid ones.
Key words: Cordyceps militaris, scanning electron microscopy, the growth, morphology, incubation temperature, carbon and nitrogen sources, pH, mycelia mass.
