CC BY
109
МЕТОДИ
УДК 663.15.:577.15
ОПТИМІЗАЦІЯ КУЛЬТИВУВАННЯ Penicillium sp. 225 ТА Aspergillus sp. 8 ТХ — ПРОДУЦЕНТІВ ПОЗАКЛІТИННОЇ ІНУЛІНАЗИ
В. І. Стойко
Н. М. Жданова Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного
В. Л. Айзенберг НАН України, Київ
Г. П. Капічон
Е-mail: [email protected]
Вивчено вплив різних джерел вуглецю, азоту та фосфору, температури, інтенсивності аерації, тривалості вирощування, відсотка посівного матеріалу на біосинтез інулінази мікроміцетами Penicillium sp. 225 та Aspergillus sp. 8 ТХ. Серед джерел вуглецевого живлення найкращими виявилися жмих топінамбура та подрібнений корінь цикорію, азотного — азотнокислий калій та хлорид амонію відповідно. На основі отриманих експериментальних даних підібрано склад живильних середовищ для вирощування досліджуваних грибів. Встановлено оптимальні умови культивування продуцентів: для Penicillium sp. 225 — температура 20 °С, об’єм живильного середовища 150 мл за швидкості перемішування 160 об/хв; для штаму Aspergillus sp. 8 TX — температура 28 °С, швидкість перемішування 220 об/хв, об’єм середовища — 150 мл. Використання 10%-го дводобового інокулю-ма під час культивування обох штамів упродовж 3 діб є оптимальним. За допомогою відповідних методів величину екзоінуліназної активності мікроміцетів підвищено майже у 10 разів.
Ключові слова: мікроскопічні гриби, інуліназна активність, живильне середовище, оптимізація умов культивування.
До чинників, які визначають рентабельність біотехнологічного виробництва, належить наявність конкурентоспроможних штамів мікроорганізмів — продуцентів біологічно активних речовин.
Мікроскопічні гриби продукують широкий спектр гідролітичних ензимів, до яких належить і 2,1-Р^-фруктозанфруктаногід-ролаза (інуліназа, КФ 3.2.1.7). Перспектива промислового використання інулінази базується на властивості цього ензиму здійснювати гідроліз інуліну з утворенням фруктози. Інуліназа має декілька галузей застосування: для одержання фруктозних сиропів, промислового отримання фруктози, як реактив для діагностики вмісту фруктози в продуктах споживання, а також у процесі виробництва молочної кислоти й етилового спирту тощо [1-6]. Тому пошук нових продуцентів інулінази та вивчення її властивостей, важливих для технологічного використання, є актуальним завданням.
Роботи з вивчення інуліназ проводять у Японії, Бразилії, Голландії, Угорщині, Да-
нії, Росії, Вірменії. Вітчизняні розробники аналогічних досліджень не проводять.
Здатність до синтезу інулінази характерна для мікроорганізмів різного таксономічного положення: бактерій, грибів та дріжджів [7-16]. Перевага використання мікроскопічних грибів як об’єктів нашого дослідження є цілком обґрунтованою, оскільки вони продукують екзоінуліназу, що є більш технологічно вигідним при виділенні ензиму у виробничих умовах порівняно з бактеріальною та дріжджовою ендоінуліназою [8, 9].
Раніше нами було проведено ступінчастий скринінг щодо здатності до синтезу інуліна-зи серед 301 колекційної культури різних родів (39) та видів (106) мікроміцетів. У процесі скринінгу найактивнішими продуцентами виявилися представники родів Aspergillus та Penicillium. У результаті було селекціоновано два нових ефективних штами: Penicillium sp. 225 (мезофільна культура) і Aspergillus sp. 8 ТХ (термотолерантна культура), які були здатні до підвищеного синтезу позаклітинної інулінази [17].
Метою цієї роботи стало розроблення складу живильного середовища для вирощування Penicillium sp. 225 та Aspergillus sp. 8 ТХ і оптимізація умов їх культивування для максимального біосинтезу інулінази.
Матеріали і методи
Об’єктами дослідження були штами грибів Penicillium sp. 225 та Aspergillus sp. 8 ТХ, відібрані з колекції культур відділу фізіології та систематики мікроміцетів Інституту мікробіології і вірусології НАН України.
Для визначення потреби в окремих компонентах живильного середовища під час культивування продуцентів використовували стандартне середовище Чапека, в якому змінювали джерела вуглецю, азоту та фосфору. Культури вирощували у глибинних умовах у колбах Ерленмеєра об’ємом 750 мл за температури 20-25 °С для Penicillium sp. 225 та 28-30 °С для Aspergillus sp. 8 ТХ.
Як джерела вуглецю в складі живильного середовища досліджували (у концентрації 0,8% із розрахунку на вуглець) моносахариди: арабінозу, ксилозу, глюкозу, галактозу, фруктозу, рамнозу; дисахариди: сахарозу, мальтозу, лактозу; полісахариди: крохмаль, інулін; багатоатомні спирти: гліцерол, інозит, маніт; рослинні субстрати: жмих топінамбура, подрібнений корінь цикорію [7-16].
Мінеральними джерелами азоту слугували нітрати натрію, калію та амонію, хлорид амонію, сульфат амонію; пептон та сечовина [7-16]. Джерела азоту вносили в концентрації 0,028% за вмістом азоту.
Як джерела фосфору вивчали різноманітні солі фосфорної кислоти за вмістом фосфору
0,023%: гідрофосфат натрію, калію та амонію; дигідрофосфат натрію і калію, фосфат амонію.
Умови культивування оптимізували на середовищах, адаптованих за джерелом вуглецю, азоту та фосфору. Для встановлення оптимальних умов синтезу ензиму штами Penicillium sp. 225 та Aspergillus sp. 8 ТХ вирощували у колбах Ерленмеєра об’ємом 750 мл з об’ємом живильного середовища 100, 150, 200 та 250 мл, за швидкості обертання качалки 160 і 220 об/хв і при температурі 20-25, 28-30 та 42 °С. До колби вносили посівний матеріал у кількості 1, 2, 5, 7, 10 і 15% до об’єму живильного середовища.
Інуліназну активність визначали за адаптованою нами методикою щодо мікромі-цетів як об’єктів дослідження, заснованою на принципі відновлення редукувальних цукрів, з використанням 3,5-динітросаліци-
лової кислоти [18]. За одиницю інуліназної активності приймали таку кількість ензиму, що каталізує утворення 1 мкМ фруктози з інуліну за 1 хв у стандартних умовах (t = 50 °C, pH 4,6).
Інуліназну активність (Aj) рідких форм ензиму визначали за формулою: к
Ar =--------R, од/мл,
j 180TV
де K — кількість моноцукрів, які утворилися під час ензиматичного гідролізу (визначається за калібрувальною кривою), мкг; T — час реакції, хв; V — об’єм проби ензиму, взятий для проведення реакції. У цій роботі V= const = 0,02 мл; R — розведення проби ензиму; 180 — маса 1 мкМ фруктози, мкг; К/180 — кількість мкМ фруктози, яка утворилась у результаті ензиматичного гідролізу інуліну.
На наведених графіках подано значення відносної інуліназної активності у відсотках від максимальної.
Протеїн визначали за методом Лоурі [19].
Результати та обговорення
Одним із головних чинників, що впливає на ріст мікроміцетів і біосинтез ними ензимів, є склад живильного середовища. До складу повноцінного середовища, що забезпечує ріст та синтез цільового продукту культурою, входять, окрім джерел вуглецю, сполуки азоту, мінеральні елементи, водень та кисень. У процесі культивування продуцента ензимів у разі правильно підібраного середовища не відбувається накопичення проміжних продуктів окиснення поживних речовин (кетокислот, ди- та трикарбонових кислот, альдегідів тощо) [3]. З огляду на це важливим етапом дослідження для підвищення виходу позаклітинної інулінази стало відпрацювання складу живильних середовищ для вирощування Penicillium sp. 225 та Aspergillus sp. 8 TX і проведення оп-тимізації умов їх культивування.
Згідно з даними Жеребцова, максимальний біосинтез інулінази (8,78 од/мл) штамом Bacilluspolymyxa 722 забезпечувався на середовищі, до складу якого входили: меляса, (NH4)2HPO4 та KH2PO4 [8].
Вивчаючи інуліназну активність у дріжджів Kluyveromyces marxianus, дослідники Pessoa та Vitolo запропонували середовище такого складу: інулін, дріжджовий екстракт, ептон, сечовина та KH2PO4 [15]. Автори відзначають, що інулін як джерело вуглецю стимулює утворення інулінази порівняно
з глюкозою, фруктозою, сахарозою, лактозою, мальтозою та крохмалем. Активність інулінази при цьому становила 26 од/мл.
Відомо, що індуковані ензими є адаптованими і синтезуються у відповідь на наявність речовин, у перетворенні яких вони беруть участь. Індуктором інулінази можуть бути як інулін, так й інулінвмісні субстрати.
Маючи потужний ензиматичний апарат, мікроскопічні гриби, адаптуючись до середовища існування, використовують різноманітні джерела вуглецю. Серед цукрів особливо добре засвоюються гексози, зокрема глюкоза та фруктоза. Інтенсивно споживаються грибами також ди-, три- та полісахариди. Гете-ротрофність грибів дає можливість використовувати їх для перероблення промислових відходів та органічних залишків, що накопичуються в біосфері [7].
Таким чином, підбираючи склад живильного середовища для культивування відібраних продуцентів інулінази, встановили, що залежно від штаму за наявності таких моносахаридів, як арабіноза, рамноза, глюкоза, ксилоза, галактоза, фруктоза та дисахаридів (лактоза і сахароза) показники інуліназної активності становили від 70 до 100%. Найнижчі показники відносної інулі-назної активності зафіксовано на середовищах у присутності багатоатомних спиртів (маніт, інозит), а також мальтози та крохмалю. Значення активності інулінази у разі використання інуліну як індуктора досягало 40% відносної активності ензиму.
Найвищий рівень інуліназної активності у відібраних штамів зафіксовано на середовищах, де джерелом вуглецю слугували: для Penicillium sp. 225 — жмих топінамбура та арабіноза; для Aspergillus sp. 8 TX — подрібнений корінь цикорію та лактоза (рис. 1).
Економічно ефективнішим звичайно є використання дешевих природних комплексних джерел вуглецю (жмих топінамбура, подрібнений корінь цикорію).
Усі наступні експерименти проводили
з використанням живильних середовищ, до складу яких входили топінамбур і цикорій (відповідно для Penicillium sp. 225 та Aspergillus sp. 8 TX).
Для оцінки оптимальнішого відсотка індуктора використовували середовища
з відсотковим вмістом топінамбура (для Penicillium sp. 225) та цикорію (для Aspergillus sp. 8 TX) від 0,5 до 7 %.
Встановлено, що найвища індукція синтезу інулінази спостерігалась на середовищах з 2% джерела вуглецю. Концентрація індуктора більше 2% пригнічувала вихід інулінази (рис. 2).
Істотну роль у живленні грибів відіграють сполуки азоту. Більшість мікроскопічних грибів здатні до засвоєння нітратів та нітритів, а також змішаних джерел азоту [7].
Дані щодо впливу джерел азоту на інуліназну активність продуцентів ензиму Penicillium sp. 225 та Aspergillus sp. 8 TX наведено на рис. 3. Традиційним джерелом азоту для грибів обрано азотнокислий калій. Саме це джерело азоту сприяло найбільшому значенню інуліназної активності. Азотнокислий натрій може бути також застосований як джерело азоту для Penicillium sp. 225. Штам Aspergillus sp. 8 TX активніше використовував для синтезу інулінази такі джерела азоту, як сечовину, пептон і, особливо активно, — хлористий амоній. Компонентний склад живильних середовищ для досягнення максимального біосинтезу інулінази дослідженими грибами відрізнявся за джерелами як вуглецю, так і азоту.
100
80 —
л
Ен О •І—І И ffl В Ен
* З 60
g S3 tt
.3 я 40
К
у
и
cd
№
о
О
И
ч
•>н
м
20-
Vs
I її ..it
I
Джерела вуглецю
л Penicillium sp. 225 i_ Aspergillus sp. 8 TX Рис. 1. Вплив різних джерел вуглецю на синтез інулінази Penicillium sp. 225 та Aspergillus sp. 8 TX
0
Кількість індуктора, %
Penicillium sp. 225
Aspergillus sp. 8 TX
Рис. 2. Вплив кількості індуктора на синтез інулінази Penicillium sp. 225 та Aspergillus sp. 8 TX
100
80 —
cd 3 60
со к
¡3 4
.3 я 40 —
20
ffl
Джерела азоту
с Penicillium sp. 225
Aspergillus sp. 8 TX
Рис. 3. Вплив різних джерел азоту на синтез інулінази культурами Penicillium sp. 225 та Aspergillus sp. 8 TX
Дослідження впливу різних фосфоровмісних солей на активність позаклітинної інулінази показало, що найвищу активність інулінази спостерігали на середовищі з однозаміщеним фосфорнокислим калієм. У цьому випадку КН2Р04 як джерело фосфатного живлення був оптимальним для обох штамів (рис. 4).
Отримані нами дані щодо складу живильних середовищ для культивування продуцентів інулінази узгоджуються з даними інших дослідників. Під час культивування гриба А. иідєг використовували середовище із сахарозою, дріжджовим екстрактом, мінеральними солями ЫаЫ03 та КН2Р04. При цьому величина інуліназної активності становила 31,2 од/мл (метод з використанням 3,5-динітросаліцилової кислоти) [11]. За даними Оиоёега і 8Ьіоші, у складі жи-
вильного середовища для вирощування P. purpurogenum були присутні інулін і мальтоза (джерела вуглецю) та солі KH2PO4 і NH4H2PO4 [13].
Встановлення оптимальних технологічних параметрів культивування продуцента, зокрема інтенсивності аерації та перемішування середовища за різних температур, є важливим етапом біотехнологічних досліджень. Вивчаючи вплив швидкості обертання і об’єму середовища на синтез інулінази, встановили, що максимальна інуліназна активність у культуральній рідині Penicillium sp. 225 спостерігалася за швидкості перемішування 160 об/хв, температури 20 °С і об’єму 150 мл. Для штаму Aspergillus sp. 8 TX оптимальними параметрами виявилися: швидкість перемішування 220 об/хв, температура 28 °С і об’єм середовища 150 мл (рис. 5-6).
0
100
Фосфоровмісні солі
_ Penicillium sp. 225
* Aspergillus sp. 8 TX
Рис. 4. Вплив різних фосфоровмісних солей на синтез інулінази культурами Penicillium sp. 225 та Aspergillus sp. S TX
л
Eh О
•I—I №
PQ
S
b
W
2 X
cd cd И й
cd
и • •і—і ч
у
И
•■—і
cd
№
о
О
И
ч
•>н
ffl
100
80
60
40
20
0
л
Ен Ü •1—1 №
PQ
S
Ен
И
Cd 8
И й
со к
2 ч
и *ін •Й PQ
I *
щ
•1—1
cd
и
о
О
и
ч
•>н
м
100
80
60
40
20
100 150 200
Об’єм живильного середовища, мл
■ 20-25 °С □ 28-30 °С і. 42 °С
100 150 200
Об’єм живильного середовища, мл
б
л
Ен О •І—І №
PQ
В
Ь
W
cd
cd
И
со
cd
И •
•iH
ч
у
И
•■—і
cd
№
о
О
И
ч
•>н
PQ
100
150
А Ь О •■—і №
PQ
S
И
2 X
cd cd И g со к
й 4 И
100
Рис. 5. Вплив температури та об’єму живильного середовища на біосинтез інулінази за швидкості перемішування 160 об/хв: а — Penicillium sp. 225; б — Aspergillus sp. 8 TX
100 -80 60 40 20 0
80
60
40
20
200
Об’єм живильного середовища, мл
ffl
■ 20-25 °С □ 28-30 °С .< 42 °С
100
150
200
Об’єм живильного середовища, мл б
Рис. 6. Вплив температури та об’єму живильного середовища на біосинтез інулінази за швидкості перемішування 220 об/хв: а — Penicillium sp. 225; б — Aspergillus sp. 8 TX
0
а
а
Також нами підібрано оптимальну кількість посівного матеріалу для культивування селекціонованих штамів грибів (рис. 7). Встановлено, що найвищий рівень синтезу позаклітинної інулінази був при додаванні 10% інокулюма.
Не менш важливим параметром культивування є вік посівного матеріалу. У разі використання однодобового інокулюма час культивування досліджених мікроміцетів істотно не змінювався порівняно з часом, необхідним для ферментації без використання інокулюма. На відміну від однодобого, дво-добовий інокулюм дає набагато кращі результати. Проведені нами дослідження показали, що використання посівного матеріалу у вигляді дводобового інокулюма скорочує час культивування продуцентів з п’яти діб до трьох (рис. 8).
Таким чином, використовуючи відповідні методи, нам вдалось підвищити величину екзоінуліназної активності мікроміцетів до 10 разів: для штаму Penicillium sp. 225 — з 3,23 од/мл до 27,7 ± 0,02 од/мл, для Aspergillus sp. 8 TX — з 2,14 од/мл до 22,4 ± 0,03 од/мл.
Унаслідок проведених експериментів підібрано склад живильних середовищ за джерелами вуглецю, азоту і фосфору та проведено оптимізацію умов культивування (температура, тривалість вирощування, відсоток іно-кулюма) відібраних мікроміцетів. Отримані вітчизняні високотехнологічні продуценти позаклітинної інулінази є конкурентоспроможними і мають значні перспективи використання у біотехнології.
Рис. 7. Вплив різних концентрацій інокулюма на синтез інулінази культурами Penicillium sp. 225 та Aspergillus sp. S TX
A
Eh
О
•I—I ffi PQ S Eh W cd cd № со cd
И • •і—і
ч
у
и
•і—і
cd
и
о
О
и
ч
•>н
м
100
80
60
40
20
0
72 84 96 108 120 132 144
Час культивування,год
без використання інокулюма з використанням 2-добового інокулюма
б
Рис. 8. Накопичення інулінази в динаміці:
а — Penicillium sp. 225; б — Aspergillus sp. 8 TX
а
ЛІТЕРАТУРА
1. Szambelan K., Nowak J. Acid and enzymatic hydrolysis of Jerusalem artichoke (Helianthus tuberosus L.) tubers for further ethanol production // EJPAU. — 2006. — V. 9, N 4. — http://www.ejpau.media.pl/volume9/ issue4/art-38.html.
2. Вагабов М. З., Керимова З. М., Мальцева Т. В., Корнеева О. С. Применение ферментных препаратов с целью ускоренного гидролиза инулина при производстве этилового спирта // Биотехнология. — 2005. — № 1. — C. 34-36.
3. Грачова И. М., Кривова А. Ю. Технология ферментных препаратов. — М.: Элевар, 2000. — 512 с.
4. Микробные ферменты и биотехнология / Под ред. В.М. Фогарти. — М: Агропромиз-дат, 1986. — 242 с.
5. Грушецкий Р. И. Разработка получения инулина из топинамбура. — К.: Вища школа, 1993. — 150 с.
6. Zittan L. Enzymatic hydrolysis of inulin — an alternative way to fructose production // Starch. — 1981. — V. 11. — P. 373-377.
7. Беккер З. Э. Физиология и биохимия грибов. — М.: Изд-во Моск. ун-та, 1988. — 230 с.
8. Жеребцов Н. А., Абрамова И. Н., Шеламо-ва С. А. Выделение экстрацеллюлярной бактериальной инулиназы и изучение ее физико-химических свойств // Биотехнология. — 2002. — № 3. — С. 13-20.
9. Gill P. K., Manhas R. K., Singh J., Singh P. Purification and characterization of an exo-inulinase from Aspergillus fumigatus // Appl. Biochem. Biotechnol. — 2004. — V. 117, N 1. — Р. 19-32.
10. Kulminskaya A A, Arand M., Eneyskaya E. V., Jvanen D. R. Biochemical characterization of Aspergillus awamori exoinulinase: substrate binding characteristics and regioselectivity of hydrolysis // Biochim. Biophys. Acta. — 2003. — V. 1650, N 1-2. — Р. 22-29.
11. Skowronek M., Fiedurek J. Optimisation of inulinase production by Aspergillus niger using simplex and classical method // Food Тє^мі. Biotechnol. — 2004. — V. 42, N 3. — Р. 141-146.
12. Rosemeire A. B. Pessoni, Marcia R. Braga, Rita de Cassia L. et al. Purification and properties of exo-inulinases from Penicillium janczewskii growing on distinct carbon sources // Mycologia. — 2007. — V. 99, N 4. — Р. 493-503.
13. Onodera Sh., Shiomi N. Purification and Substrate Specificity of endo-Type Inulinase from Penicillium purpurogenum // Agric. Biol. Chem. — 1988. — V. 52, N 10. — P. 2569-2576.
14. Балаян А. М., Пивазян Л. А., Хачатурян Р. H. и др. Инулиназы Penicillum palitans и Penicillum cyclopium 895 // Биотехнология. — 2001. — № 3. — С. 72.
15. Pessoa A., Vitolo M. Inulinase from Kluyveromyces marxianus: culture medium composition and enzyme extraction // Braz. J. Chem. Eng. — 1999. — V. 16, N 3. — P. 291-297.
16. Kalil S. J., Suzan R., Maugeri F., Rodri-ges M. I. Optimization of Inulinase Production by Kluyveromyces marxianus. Using Factorial Design // Appl. Biochem. Biotechnol. — 2001. — V. 94. — P. 257-263.
17. Стойко В. І., Жданова H. М., Айзенберг В. Л., Капічон Г. П. Скринінг мікромі-цетів — продуцентів інулінази // Біотехно-логія. — 2010. — Т. 3, № 2. — С. 48-55.
18. Айзенберг В. Л., Стойко В. И., Демиде-нок Е. А. и др. Методика количественного определения активности грибной инулина-зы с использованием реактива Самнера // Биотехнология. — 2007. — № 5. —
С. 95-96.
19. Lowry O. H., Rosebrough H. J., Faar A. L., Randal R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. — 1963. — V. 193, N 1. — P. 675-677.
ОПТИМИЗАЦИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Penicillium sp. 225 И Aspergillus sp. 8 ТХ — ПРОДУЦЕНТОВ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ИНУЛИНАЗЫ
В. И. Стойко Н. Н. Жданова В. Л. Айзенберг А. П. Капичон
Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины, Киев
E-mail: [email protected]
Изучено влияние разных источников углеводов, азота и фосфора, температуры, интенсивности аэрации, продолжительности культивирования, процента посевного материала на биосинтез инулиназы микромицетами Penicillium sp. 225 и Aspergillus sp. 8 ТХ. Среди источников углеводного питания лучшими оказались жмых топинамбура и порошок цикория, азотного — азотнокислый калий и хлорид аммония соответственно. Установлены оптимальные условия культивирования продуцентов: для Penicillium sp. 225 — температура 20 °С, объем питательной среды 150 мл при скорости перемешивания 160 об/мин; для штамма Aspergillus sp. 8 TX — температура 28 °С, скорость перемешивания 220 об/мин, объем среды 150 мл. Использование 10%-го двухсуточного инокулюма при культивировании обоих штаммов на протяжении 3 сут оптимально. С помощью соответствующих методов инулиназная активность увеличена почти в 10 раз.
Ключевые слова: микроскопические грибы, инулиназная активность, оптимизация условий культивирования.
OPTIMIZATION OF CULTIVATION OF Penicillium sp. 225 AND Aspergillus sp. 8 TX SYNTHESIZING EXOINULINAZE
V. Stoiko N. Zhdanova V. Aisenberg A. Kapichon
Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: [email protected]
The influence of different sources of carbon, nitrogen and phosphorus, temperature, intensity of airing, time of culturing, percent of material of sowing on the biosynthesis of exoinulinase of Penicillium sp. 225 and Aspergillus sp. 8 TX has been investigated. Among carbon sources the best one were found to be the grind roots of American artichoke and chicory, and among nitrogen sources — potassium nitrate and ammonium chloride, respectively. On the basis of the experimental findings neat composition of nutrient medium was estimated for growing of the selected fungi. The following optimal conditions of culturing of exoinulinase fungi producers were established for Penicillium sp. 225: temperature — 20 °C, volume of a nutrient medium — 150 ml, rotation rate — 160 rpm; for Aspergillus sp. 8 TX: temperature — 28 °C, rotation rate — 220 rpm, volume of a nutrient medium — 150 ml. Use of 10% two-day inoculum at cultivation of both cultures during 3 days was shown to be optimal. Activity of exoinulinase of micromicetes was increased almost 10-fold via use of the proper methods.
Key words: microscopic fungi, inulinase activity, nutrient medium, optimization of cultivation conditions.
