CC BY
26
Не допустить распространения мутации
Интенсивное использование мирового породного генофонда и биотехнологий репродукции (искусственное осеменение, трансплантация эмбрионов) позволило значительно повысить генетический потенциал продуктивности животных за счет получения потомства производителей - лидеров породы. Вместе с тем в поголовье все чаще проявляются признаки генетической «эрозии» - накопления груза вредных рецессивных мутаций.
При этом снижаются воспроизводительная способность и плодовитость, жизнеспособность новорожденных и молодняка, резистентность к респираторным заболеваниям и продолжительность хозяйственного использования животных. Все это отрицательно сказывается на рентабельности производства. У крупного рогатого скота (КРС) выявлено свыше 400 генетически обусловленных морфологических и функциональных нарушений [1].
мария михайлова,
замдиректора по научной и инновационной работе Института генетики и цитологии НАН Беларуси, завлабораторией генетики животных, кандидат биологических наук
Наталья Волчок,
младший научный сотрудник лаборатории генетики животных Института генетики и цитологии НАН Беларуси
Елена Белая,
младший научный сотрудник лаборатории генетики животных Института генетики и цитологии НАН Беларуси
Один из генетических дефектов, наследуемых по аутосомно-рецессивному типу, то есть проявляющийся только у животных, гомозиготных по соответствующему гену и не имеющих клинических проявлений у гетерозигот, - дефицит адгезии лейкоцитов, введенный в генофонд черно-пестрого скота в виде рецессивной мутации в гене CD18. Она впервые была обнаружена у быков голштинской породы, которых широко использовали для улучшения генетического потенциала других популяций КРС.
Первые случаи дисфункции лейкоцитов были зарегистрированы в 1983 г. у коров этой породы. В 1987 г. в Японии сообщили о нескольких случаях проявления у телят подобных клинических симптомов, которые сопровождались постоянными или рецидивирующими инфекциями, связанными с устойчивой нейтрофилией. В 1990 г. у телят с гранулоцитопатическим синдромом обнаружили недостаточную экспрессию молекулы ß 2-интегрина на поверхности лейкоцитов и назвали данное заболевание по аналогии с лейкоцитарной адгезией человека (LAD) - дефицитом адгезии лейкоцитов (BLAD) крупного рогатого скота [2].
Клинически болезнь проявляется в подавлении клеточного иммунитета, при котором блокируется способность лейкоцитов проникать через кровеносные капилляры и двигаться с кровотоком к очагу инфекции. Эти нарушения способствуют развитию иммунодефицита. Животные с мутантным аллелем не имеют фенотипических проявлений заболевания, но становятся скрытыми носителями мутации. У особей, гомозиготных по рецессивному аллелю, резко снижается устойчивость к бактериальным и вирусным инфекциям, замедляется рост. У пораженных животных отмечаются тяжелые язвы на слизистых оболочках ротовой полости, гингивит, потеря зубов, рецидивирующая диарея, хроническая пневмония. Биохимические показатели крови указывают на постоянную нейтро-филию. Большинство телят погибает в возрасте 3-7 месяцев [3].
Молекулярной основой BLAD является точковая мутация в кодирующей части гена CD18, имеющая аутосомно-рецессивный характер наследования. Замена (аденин - гуанин) в положении 383 кДНК приводит к аминокислотной замене в молекуле белка (Asp ^ Gly), в результате чего нарушается вся цепочка экспрессии p-интегрина, поверхностного белка нейтрофилов; лейкоциты теряют свою активность и способность выполнять защитную фагоцитарную функцию. В итоге -падеж животных от любой инфекции [4].
Мы поставили перед собой задачу - провести анализ генетической структуры популяций КРС некоторых животноводческих комплексов Беларуси по локусу гена CD18, изучить встречаемость мутантного аллеля, выявить скрытых носителей мутации BLAD. Исследова-
селекция в мире животных
ния проводились на коровах и быках черно-пестрой породы, принадлежащих госплемпредприятиям Минской, Гомельской, Гродненской, Брестской, Витебской и Могилевской областей. Для анализа был создан банк ДНК, включающий более 1300 образцов, полученных из спермы и крови методом солевой экстракции по стандартной методике [5]. Выделенную ДНК ресуспензировали и измеряли ее концентрацию с помощью электрофореза в 0,8%-ном агарозном геле, используя маркер молекулярного веса GeneRulerTM1kbDNALadder.
С целью типирования аллельных вариантов гена CD18 был применен метод ПЦР с последующим анализом ПДРФ. На основе данных о сиквенсе участка гена, в котором была обнаружена мутация, было синтезировано два олигонуклеотидных праймера, которые амплифицируют участок размером 132 пар нуклеотидов [5].
После гидролиза наличие двух фрагментов длиной 71 и 61 пн относительно маркера свидетельствовало об отсутствии мутации (анализируемое животное являлось здоровым, гомозиготный доминантный генотип TL/TL). У скрытых носителей иммунодефицита (гетерозиготный генотип TL/BL) было три фрагмента длиной 132, 71 и 61 пн.
С 2006 по 2010 г. было проведено ДНК-тестирование на носительство мутации BLAD быков-производителей и быко-производящих коров шести областных племпредприятий. Проанализировано 1344 животных, из них выявлено более 30 носителей мутантного аллеля.
Анализ генетической структуры по гену CD18 показал, что в популяции быков-производителей частота скрытых носителей мутации в гене CD18 в среднем составила 1,3% (табл. 1), а в популяции коров почти в 3 раза выше - 3,6% (табл.2). Это можно объяснить средним соотношением между самцами и самками при искусственном осеменении для быков исключительно высокого качества, которое достигает 1:100 000. Частота встречаемости аллеля BLAD в исследованной популяции быков составила 0,01, коров - 0,02 (табл. 1, 2).
Таблица. 1. Анализ генетической структуры популяций быков-производителей по гену CD18 (BLAD)
Принадлежность Кол-во особей n 198 Частота генотипов,% TI ! TI TI /01 х2 Частота аллелей TI DI
РУП «Витебск-племпредприятие» 1 Li 1 L 99,5 1 Li DL 0,5 197,25 1 L 0,997±0,04 DL 0,003±0,04
Минское племпредприятие 147 99,3 0,7 146,25 0,997±0,05 0,003±0,05
СПК «Снов» 64 95,3 4,7 6,55 0,98±0,02 0,02±0,02
РУСПП «1-я Минская птицефабрика» 51 100 0 1 0
РДУП «Экспериментальная база Жодино» 26 100 0 1 0
СПК «Першаи-2003» 17 100 0 1 0
РУП «Совхоз «Слуцк» 6 100 0 1 0
Племпредприятия Гродненской обл. 99 99 1 99,25 0,995±0,07 0,005±0,07
РСУП «Гомель госплемпредприятие» 86 95,3 4,7 4,72 0,98±0,02 0,02±0,02
ГУСП «Племзавод «Мухавец» 53 100 0 1 0
РУСП «Оршанское племпредприятие» 10 100 0 1 0
РСУП «Шикотовичи» 8 100 0 1 0
Всего 765 98,7 1,3 6,8 0,99±0,04 0,01±0,04
Таблица 2. Анализ генетической структуры популяций быкопроизводящих коров по гену CD18 (BLAD)
Принадлежность Кол-во особей х2 Частота генотипов, % Частота аллелей
n TL/ TL TL/BL TL BL
ГУСП «Племзавод «Мухавец» 50 50,25 98 2 0,98±0,02 0,02±0,02
СПК «Красная Звезда» 41 41,25 | 97,6 2,4 0,99±0,02 0,01±0,02
СПК «Снов» 312 0,63 95,2 4,8 0,98±0,008 0,02±0,008
РУСПП «1-я Минская птицефабрика» 134 7,71 I 97 3 0,99±0,009 0,01±0,009
РДУП «Экспериментальная база «Жодино» 14 100 0 0
СПК «Першаи-2003» 7 100 0 0
РСУП «Гомельгосплемпредприятие» 7 100 0 0
РУСП «Оршанское племпредприятие» 10 100 0 0
РСУП «Шикотовичи» 4 100 0 0
Всего 579 96,4 3,6 0,98±0,006 0,02±0,006
1 3,76
1,8
2008 г.
2009 г.
2010 г.
Рис. 1. Динамика распределения частот гетерозиготных генотипов TL/BL по гену CD18 в популяции КРС Беларуси с 2008 по 2010 г.
Также проведен анализ соответствия частот генотипов теоретически ожидаемому распределению Харди - Вайнберга с применением критерия х2. Из проанали-
зированных групп животных только в популяции коров СПК «Снов» наблюдаемое распределение частот генотипов совпадает с теоретически ожидаемым равновес-
№8(102) Август 2011 НАУКА И ИННОВАЦИИ 13
ным распределением Харди - Вайнберга (табл. 2). В остальных популяциях - как быков, так и коров - наблюдалась низкая гетерозиготность (табл. 1, 2).
При анализе частот гетерозиготного генотипа по годам была выявлена явная тенденция к снижению: если в 2008 г. этот показатель составлял 3,76%, то в 2010-м - уже 0,9% (рис. 1).
В результате установлена частота гетерозиготного генотипа по гену CD18 в популяции быков-производителей и коров черно-пестрой породы, выявлены скрытые носители мутации, прослежена динамика распределения частот гетерозиготных генотипов в популяции КРС Беларуси с 2008 по 2010 г.
Проведенный мониторинг подтверждает необходимость контроля по распространению мутации с целью оздоровления поголовья крупного рогатого скота нашей страны. Чтобы не допустить дальнейшего бесконтрольного распространения мутации и избежать связанных с этим существенных экономических потерь, необходимо своевременно выявлять носителей BLAD, тестировать популяции быкопроизводящих коров, ремонтного молодняка и всех элитных быков, сперма которых широко используется на племпредприятиях для искусственного осеменения.
Литература
1. Жигачев А.И., Эрнст Л.К., Богачев А.С. О накоплении груза мутаций в породах крупного рогатого скота при интенсивных технологиях воспроизводства и улучшения по целевым признакам // Сельскохозяйственная биология. №6, 2008.
2. Nagahata H. Bovine leukocyte adhesion deficiency (BLAD) // J. Vet. Med. Sci. №12, 2004.
3. Nagahata H., Nochi H., Tamoto К., Noda H., Kociba G.J. Expression and role of adhesion molecule CD 18 on bovine neutrophils // Can. J. Vet. Res. 1995.
4. Зиновьева Н.А. Введение в молекулярную генную диагностику сельскохозяйственных животных. - Дубровицы, 2002.
5. Miller S.A., Dykes D.D., Polesky H.F. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells // Nucleic Acids Res. №3, 1988.
Беларусь -Венесуэла: сотрудничество
Институт генетики и цитологии НАН Беларуси плодотворно сотрудничает с научными учреждениями Венесуэлы. Совместно с Национальным институтом сельскохозяйственных исследований (ИНИА) этой страны выполняются два договора, финансируемые венесуэльской стороной на общую сумму 465 тыс. долл. Руководитель проекта от Беларуси - директор ИГЦ, член-корреспондент Александр Кильчевский, от Венесуэлы -президент иНИа Иван Хиль Пинто.
Александр Кильчевский,
директор Института генетики и цитологии НАН Беларуси, член-корреспондент
мария михайлова,
замдиректора по научной и инновационной работе Института генетики и цитологии НАН Беларуси, завлабораторией генетики животных, кандидат биологических наук
С 2009 г. ведется разработка методов ДНК-типирования хозяйственно-ценных генов для использования в селекции сельскохозяйственных растений и животных. В минувшем году собраны образцы растений и животных для молекулярно-генетических исследований в Беларуси, на основе которых создан банк ДНК. Оценено генетическое разнообразие местных сортов и селекционных образцов картофеля и томата с помощью SSR-анализа, проведена ДНК-диагностика крупного рогатого скота по генам устойчивости к наследственным заболеваниям. Проделана организационная работа по подготовке обучающего курса белорусских специалистов по методам молекулярно-генетических исследований в Венесуэле.
