CC BY
20
УДК 636.2.082
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА ПОПУЛЯЦИИ БЫКОВ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ РАЗЛИЧНОЙ СЕЛЕКЦИИ В РУСП «ГРОДНЕНСКОЕ ПЛЕМПРЕДПРИЯТИЕ» ПО ГЕНУ CD 18
Л.А. ТАНАНА, Р. В. ТРАХИМЧИК УО «Гродненский государственный аграрный университет» г. Гродно, 230008 Т.И. ЕПИШКО УО «Полесский государственный университет» г. Пинск, Брестская обл., Республика Беларусь П.З. КАШТЕЛЯН РУСП «Гродненское племпредприятие» г. Щучин, Гродненская обл., Республика Беларусь, 230110
(Поступила в редакцию 25.01.2010)
Введение. Животноводство в нашей стране является ведущей отраслью сельскохозяйственного производства, поставщиком ценных продуктов питания для человека и сырья для промышленности. Следовательно, встает вопрос о повышении количества получаемой продукции и улучшения ее качества. Для этого в республике разработана и принята к реализации республиканская комплексная программа по племенному делу в животноводстве на период 2005-2010 годы [7]. В соответствии с ней повышение генетического потенциала молочного скота должно осуществляться на основе принципов и методов чистопородного разведения с использованием генотипов ценных родственных пород мирового генофонда. Для улучшения разводимого в республике скота используются породы западноевропейской селекции. Голштинская порода крупного рогатого скота - одна из лучших специализированных молочных пород мира. Однако интенсивный, из поколения в поколение, отбор животных по молочности и максимальное использование небольшого количества производителей-улучшателей без учета инбридинга привел к ряду нежелательных последствий. В результате в наследственности голштинов постепенно накопились нежелательные рецессивные мутации, одной из которых является синдром иммунодефицита (BLAD), имеющий наиболее серьезные экономические последствия. Ежегодный экономический ущерб от этого заболевания в США определяют в пределах 5 млн. долларов [14].
Организм животных, несущих в своем генотипе мутантный аллель в гетерозиготном состоянии (CD18tl/bl), не способен противостоять вирусным и бактериальным инфекциям, что приводит к снижению иммунитета животных и может закончиться летальным исходом в первые месяцы постнатального развития. Гомозиготные носители мутантного
TL/TL **
гена (CD18 ) фенотипических отклонений не имеют.
Мутация приводит к множественным дефектам функции лейкоцитов. Их миграция к месту проникновения патогенов оказывается заблоки-
рованной, что исключает эти клетки из процесса уничтожения инфекции. Мутация в гене CD 18 нарушает нормальную функцию нейтрофи-лов, которые теряют способность мигрировать через эпителий капилляров и субэпителиальные мембраны. Наблюдаются характерные изменения в сывороточных белках (гипоальбуминамия и гиперглобули-нонемия) и острая нейтрофилия. Картина крови у больных животных по лейкоцитарному составу напоминает лейкоз [1, 2].
Родоначальником синдрома является голштинский бык-производитель Осборндайла Айвенго 1189870 (1952 года рождения). Спустя 40 лет, когда стало известно, что он является носителем BLAD-синдрома, его наследственный материал оказался широко распространенным среди черно-пестрых и красно-пестрых пород крупного рогатого скота. Впоследствии потомки Осборндайла Айвенго попали в Западную Европу и страны СНГ. В США 14,1% племенных быков и 3,8% исследованной популяции коров были оценены как гетерозиготы. Согласно научным данным, в Германии встречаемость гена BLAD составляет 6,4%, во Франции - 6%, в Польше - 5%, в Чехии - 4%. В России частота встречаемости составляет 5,6-6,7%. [11,12].
BLAD (Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency) - это аутосомное, рецессивное, непатогенное заболевание, приводящее к нарушению иммунного ответа организма на инфекционные агенты (синдром врожденного иммунодефицита). Клинические симптомы проявления мутации в гомозиготном состоянии разнообразны, однако доминируют нарушения респираторной функции и функции желудочно-кишечного тракта. Организм животных, несущих в своем генотипе мутантный аллель в гомозиготном состоянии (CD18tl/tl), не способен противостоять вирусным и бактериальным инфекциям, что приводит к снижению иммунитета животных и заканчивается летальным исходом в первые месяцы развития. Гетерозиготные носители мутантного гена (CD18tl/bl) фенотипических отклонений не имеют.
Международными племенными службами США, Словакии, Голландии и других стран введены обязательные проверки производителей на данный генетический дефект (включая выбраковку потомков К.М. Иванхое Белл из систем искусственного осеменения и систем МОЕТ- эмбриопересадок), а также запись в родословные племенных каталогов носителей данной мутации. В большинстве развитых стран Европы и Америки созданы специальные программы по снижению частоты встречаемости аллеля BLAD-синдрома в популяциях скота черно-пестрой породы. Быки-производители, являющиеся носителями мутации гена CD18, не допускаются для племенного использования [13].
Своевременное выявление носителей данной мутации позволит избежать спаривания двух гетерозиготных особей или, наоборот, использовать при разведении под контролем в случае их высокой препо-тентности. Чтобы не допустить дальнейшего бесконтрольного распространения мутации, необходимо, наряду с тестированием быков-производителей, проводить тестирование популяций быкопроизводя-
щих коров и ремонтного молодняка. Выявление в популяциях скрытых генетических дефектов (мутаций), снижающих племенные качества животных, позволит решить проблему повышения резистентности племенного поголовья и сохранения молодняка. Поэтому актуальным является внедрение метода диагностики иммунодефицита крупного рогатого скота для исключения животных-носителей генетически обусловленного BLAD-синдрома и оздоровления селекционно-племенного поголовья республики. Исходя из вышеизложенного целью данной работы явилось изучение генетической структуры популяции быков-производителей различной селекции в РУСП «Гродненское племпред-приятие» по гену CD18.
Единственным существующим к настоящему времени методом, позволяющим безошибочно выявить носительство мутации BLAD в ге-терозиготе, является анализ продуктов амплификации участка гена CD18 по полиморфизму длин рестрикционных фрагментов, что позволяет определять генетические аномалии непосредственно на уровне ДНК. В таком случае отпадает необходимость сложной и дорогой генетической экспертизы по потомству. Методы выявления мутации на генном уровне позволяют при рецессивном наследовании генетических аномалий проводить весьма эффективную селекцию, ведущую к элиминации нежелательных аллелей и улучшению генофонда.
Цель работы - изучить генетическую структуру популяции быков-производителей различной селекции в РУСП «Гродненское предприятие» по гену CD18.
Материал и методика исследований. Исследования проводились на кафедре генетики и разведения сельскохозяйственных животных УО «Гродненский государственный аграрный университет», в лаборатории промышленной биотехнологии УО «Полесский государственный университет» и в лаборатории ДНК-технологий РУП «Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по животноводству». Объектом исследований являлся генетический материал (семя) быков-производителей черно-пестрой породы отечественной и западноевропейской селекции с различной кровностью по голштинской породе, содержащихся на Щучинском филиале РУСП «Гродненское племпред-приятие». Было отобрано 75 спермодоз от быков-производителей различных линий голштинского (линии Рефлекшн Соверинг 198998, Монтвик Чифтейн 95679, Осборндейл Иванхое 1189870, Пакломар Астронавт 1458744, Вис Айдиал 933122, Тэд Бек Элевейшн 149007, Пабст Говернера 882933, Силинг Трайджун Рокит 252803, Пони Фарм Арлинда Чиф 1427381) и голландского (линии Аннес Адема 30587, Хильтьес Адема 37910, Нико 31652, Колдхостера Янке Катса 2233, Рутьес Эдуарда 31646) корня. Исходным материалом служили образцы ДНК, выделенные из замороженных образцов семени животных. ДНК-диагностику генотипов по гену CD18 (BLAD) проводили с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) и полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Ядерную ДНК выделяли из
разбавленной спермы (пайеты) перхлоратным методом с собственными модификациями. Основные растворы для выделения ДНК, амплификации и рестрикции готовили по Т. Маниатису, Э. Фрич, Дж.Сэмбруку [5].
Реакция ПЦР проводилась в оптимизированном составе реакционной смеси с использованием праймеров BLAD1 и BLAD2:
- BLAD1: 5' -TGA GAC CAG GTC AGG CAT TGC GTT CA- 3'
- BLAD2: 5'- CCC CCA GCT TCT TGA CGT TGA CGA GGT C -3'.
Для проведения рестрикции применялась эндонуклеаза TaqI [3].
Результаты расщепления продукто в ПЦР оценивались электрофоре-
тическим методом в агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, с помощью трансиллюминатора в ультрафиолетовом свете. Для анализа распределения рестрикционных фрагментов ДНК использовали компьютерную видеосистему и программу VITran [8,9].
Результаты исследований и их обсуждение. Распространение у крупного рогатого скота наследственного заболевания - синдрома врожденного иммунодефицита (BLAD-синдрома), связывают с широким использованием быков-производителей голштинской породы - носителей этой мутации. В большинстве развитых стран Европы и Америки проводится ДНК-диагностика носительства BLAD-синдрома у племенных животных, по результатам которой быки-производители, являющиеся носителями мутации гена CD 18, не допускаются для племенного использования [10].
Нами было протестировано 75 быков-производителей, содержащихся в РУСП «Гродненское племпредприятие», на наличие BLAD -синдрома. Данные о частоте встречаемости генотипов аллелей гена CD 18 в разрезе линий представлены в табл. 1.
Таблица 1. Частота встречаемости генотипов и аллелей гена CD18
Частота Частота
Линия n встречаемости аллелей встречаемости генотипов, %
TL BL TL/TL TL/BL
1 2 3 4 5 6
Голштинский корень
Монтвик Чифтейн 95679 8 0,938 0,063 87,5 12,5
Рефлекшн Соверинг 198998 11 1,000 - 100 -
Осборндейл Иванхое 1189870 2 1,000 - 100 -
Пакламар Астронавт 1458744 2 1,000 - 100 -
Вис Айдиал 933122 16 0,969 0,031 93,75 6,25
Тед Бек Элевейшн 149007 2 1,000 - 100 -
Пабст Говернор 882933 4 1,000 - 100 -
Силинг Трейджун Рокит 252803 5 1,000 - 100 -
Пони Фарм Арлинда Чиф 1427381 8 0,938 0,063 87,5 12,5
В среднем 58 0,983 0,017 96,53 3,74
Голландский корень
Аннас Адема 30587 4 1,000 - 100 -
Хильтес Адема 37910 7 1,000 - 100 -
Окончание табл. 1
1 2 3 4 5 6
Никко31652 3 1,000 - 100 -
Колдхостера Янке Катса 2233 1 1,000 - 100 -
Рутьес Эдуарда 31646 2 1,000 - 100 -
В среднем 17 1,000 - 100 -
Из данных табл. 1 видно, что генотип CD18TL/BL был идентифицирован только у трех производителей голштинского генеза линий Монтвик Чифтейн 95679, Вис Айдиал 933122, Пони Фарм Арлинда Чиф 1427381. Частота встречаемости генотипа CD18 ^ в популяциях быков данных линий составила 87,5%, 93,75, 87,5%, а генотипа CD18TL - 12,5%, 6,25 и 12,5%, соответственно. В популяции быков-производителей голландского корня животных с генотипом CD18TL/BL не выявлено.
Результаты исследования по определению генетической структуры быков-производителей различного происхождения по локусу гена CD18 представлены в табл. 2.
Таблица 2. Генетическая структура быков-производителей различного происхождения по локусу гена CD18
Линии Количество быков Количество быков с генотипом гена CD18
TL/TL TL/BL
гол. % гол. %
Голштинский корень 58 55 94,8 3 5,2
Голландский корень 17 17 100 - -
Данные, представленные в табл. 2, свидетельствуют о том, что у отобранных быков чаще встречается генотип CD18 L/TL, чем генотип CD18TL/BL Так, у быков линий голштинского корня он обнаружен у 58 животных (94,8%), а у быков линий голландского корня - у 17 (100%). Среди популяций быков-производителей голштинского и голландского корня генотип CD18BL/BL не выявлен.
При исследовании ядерной ДНК быков-производителей черно-пестрой породы и западноевропейской селекции Гродненского плем-предприятия выявлены генотипы TL/TL и TL/BL. Животных с генотипом BL/BL не обнаружено.
Заключение. Впервые изучена генетическая структура быков-производителей по гену CD 18, содержащихся на Щучинском филиале РУСП «Гродненское племпредприятие», что дает возможность эффективно использовать генотипирование по локусу данного гена в селекционном процессе.
Определение генетической структуры быков-производителей различной селекции по гену CD18 свидетельствует о том, что среди ли-
ний голштинского корня выявлено всего 3 быка-производителя с генотипом CD18tl/bl (3,74%), а генотип CD18 BL /BL не идентифицирован ни у одного животного. Популяция быков-производителей голландского корня представлена животными только с генотипом CD18TL/ TL (100%).
Таким образом, необходимо проводить мониторинг генетической устойчивости быков-производителей к наследственному заболеванию -синдрому иммунодефицита крупного рогатого скота с целью оздоровления поголовья республики.
ЛИТЕРАТУРА
1. Виннчук, Д.Т. Ген BLAD в наследственности голштинского скота / Д.Т. Виннчук, А.А. Созинов // Вюн. аграр. науки, 1994. № 6. С.44-46.
2. Введение в ДНК-технологию / В.И. Глазко, И.М. Дунин, Г.В. Глазко, Л.А. Калашникова. М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2001. С. 434.
3. Епишко, Т.И. Зоотехническая наука Беларуси / Т.И. Епишко, О.П. Курак // Сб. науч. тр.; науч.-практ. центр Нац. акад. наук Беларуси по животноводству. Жодино, 2008. Т. 42. С. 66.
4. ДНК-технологии оценки сельскохозяйственных животных / Л.А. Калашникова, И.М. Дунин, В.И. Глазко [и др.]. Лесные Поляны, 1999. 147с.
5. Маниатис, Т. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэм-брук. М.: Мир, 1984. С.480.
6. Скрининг гена BLAD-синдрома у животных черно-пестрого корня / Н.С. Марзанов, А.Н. Попов, Н.А.Зиновьева [и др.] // Ветеринарная медицина. 2000. N° 3. С.59-61.
7. Попков, Н.А. Республиканская комплексная программа по племенному делу в животноводстве. Основные зоотехнические документы по селекционно-племенной работе в животноводстве: сборник технологической документации / Науч.-практ. центр Нац. акад. наук Беларуси по животноводству; рук. разраб. Н.А. Попков [и др.]. Жодино, 2008. С.475.
8. Зоотехническая наука Беларуси / И.П. Шейко, О.П. Курак, Т.И. Епишко, Н.Ф. Жук, Л.В. Евтушевская // Сб. науч. тр.; науч.-практ. центр Нац. акад. наук Беларуси по животноводству. Жодино, 2008. Т. 41. Ч. 2. С. 109.
9. Методические рекомендации по применению ДНК-тестирования в животноводстве Беларуси / И.П. Шейко, Т.И. Епишко, О.П. Курак, Р.И. Шейко, И.С. Петрушко, Н.А. Федоренкова [и др.] // Науч.-практ. центр Нац. акад. наук Беларуси по животноводству. Жодино, 2006. С.12.
10. Engelhardt, I. Inzucht, bedeute ahnen und warschaeinlichtkeit fur BLAD-Merkmalstrauger in der Deutschen Schwarzbuntzucht / I. Engelhardt // Hannower, 1996. P. 184-201.
11. Kehrli, V.E. Molecular definition of the bovine granulocytopathy syndrome: identification of deficiency of the Mac-1 (CD1 lb/CD18) glycoprotein/ V.E. Kehrli, F.C.Schmalstieg, D.C.Anderson, V.J. Van der Maaten [et.] // Am. J. Vet. Res. 1990. 5l. № 11. P. 1826-1936.
12. Shuster D.E. et al, 1992, Kehrli M.E., Ackermann M.R., Gilbert R.O. Identification and prevalence of a genetic defect that causes leucocyte adgesion deficiency in Holstein cattle // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V.892. P. 9225-9229.
13. Tammen, I. Weiterentwicklung des DNA-Tests auf BLAD fur den Einsatz in Rinderzucht und klinischer Diagnostic/ I. Tammen // Hannover, 1994.
14. Taniyama, H. Request reprints Department of Veterinary Pathology, School of Veterinary Medicine / H. Taniyama // Rakuno Gakuen University, Bunkyodai-Midorimachi 582, Ebetsu, Hokkaido 069-8501. 1996. P. 32-34.
