CC BY
5УДК 577.21:602.6:604.6
Л.В. Хотылева, А.В. Кильчевский, О.Ю. Урбанович
НАУЧНОЕ НАСЛЕДИЕ АКАДЕМИКА НАН БЕЛАРУСИ КАРТЕЛЯ
НИКОЛАЯ АЛЕКСАНДРОВИЧА
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
1 апреля 2013 г. на 76-м году жизни скончался известный белорусский ученый, академик НАН Беларуси, профессор, доктор биологических наук Николай Александрович Картель, внесший большой вклад в становление и развитие молекулярно-генетических исследований в Беларуси.
Научная карьера Н.А. Картеля началась в Белорусском лесотехническом институте им. С.М. Кирова (ныне Белорусский государственный технологический университет). Его первые научные работы, опубликованные в 60-е годы ХХ столетия, посвящены генетике и цитогенетике лесных пород.
С 1968 года научные исследования Н.А. Картеля связаны с Институтом генетики и цитологии НАН Беларуси, в который он пришел работать по приглашению академика Н.В. Турбина после возвращения из Швеции, где прошел стажировку под руководством известного генетика, профессора А. Густафссона. В первые годы работы Николай Александрович активно изучает проблему радиационного мутагенеза у сельскохозяйственных растений и публикует серию научных работ, в которых приводит результаты исследований о влиянии различных доз радиации на сорта ячменя, оценке их мутагенного эффекта и критериев радиочувствительности тканей растений.
С середины 70-х годов Н.А. Картель увлекается вопросами молекулярной генетики, которая в то время начала активно развиваться в мире. По инициативе академика Н.В. Турбина, сначала совместно с Институтом прикладной молекулярной биологии и генетики ВАСХНИЛ, а затем самостоятельно, Николай Александрович разрабатывает проблему генетической трансформации у растений, выполняя оригинальные эксперименты по введению экзогенной ДНК в клетки растений ячменя. Им, совместно с сотрудниками, отрабатываются методы получения высокоочищенной
ДНК из растительного материала, методы эффективного введения тотальных препаратов ДНК в различные органы и клетки растения, изучаются факторы, повышающие эффективность включения ДНК в клетки и ядра растений. В процессе исследований были выявлены физиологические и цитологические эффекты влияния экзогенной ДНК на реципиентные растения. Показано, что экзогенная ДНК способна индуцировать наследственные изменения у злаков, частота, характер проявления и наследование которых отличаются от типичных мутаций. Были получены формы ярового ячменя, характеризующиеся рядом новых признаков по сравнению с исходными образцами. Это были пионерские исследования не только для нашей страны, но и для всего мира. Результаты работы были опубликованы в крупных международных научных журналах и монографии «Эффекты экзогенной ДНК у высших растений» (1981 г.), а также легли в основу докторской диссертации Николая Александровича, успешно защищенной в 1984 г.
В 70-х годах прошлого столетия большое внимание стали уделять агробактерии Agrobac-terium tumefaciens, которая способна инфицировать двудольные растения и индуцировать у них генетическую трансформацию с образованием корончатых галлов. В процессе исследований онкогенных свойств бактерий A. tumefaciens, выполненных группой сотрудников Н.А. Картеля было выявлено, что на онкогенность A. tumefaciens оказывают супрессирующее действие плазмиды psa и R388, присутствие которых приводит к снижению синтеза индоли-луксусной кислоты у бактерий. Молекулярно-генетический анализ штаммов бактерий, характеризующихся высоким уровнем синтеза ИУК, позволил сделать вывод, что фитопатогенные бактерии синтезируют ИУК преимущественно через индолил-3-ацетамид и ген iaaM, кодирующий ключевой фермент этого пути триптофан-
2-монооксигеназу. Было установлено, что свойство плазмиды R388 супрессировать функцию генов, связанных с контролем синтеза ИУК у A. tumefaciens, распространяется на ИУК-синтезирующие бактерии других родов. Была показана возможность трансформации протопластов табака штаммами A. tumefaciens, содержащими антионкогенные R-плазмиды рSa и R388. В то же время эти трансконьюганты не были способны индуцировать опухолеобразо-вание на интактных растениях каланхое, что свидетельствовало о важной роли фитогормо-на ИУК на первом этапе взаимодействия клеток агробактерий с клетками растений. Были получены новые данные о роли ИУК в фито-патогенности бактерий, а также во взаимодействии агробактерий с клетками растений. Показано, что ИУК-продуцирующая способность является свойством, присущим широкому ряду бактерий, независимо от их таксономической принадлежности и характера взаимодействия с растениями. Эти данные внесли вклад в понимание и разработку методов биологического контроля болезней растений, связанных с фитогормональной активностью обитающих в ризосфере бактерий.
Работы по молекулярной генетике микроорганизмов позже были продолжены в другом направлении. Совместно с лабораторией биотехнологии соединений нуклеиновой природы Института микробиологии НАН Беларуси из штамма E. coli был выделен ген пурин-нуклеозидфосфорилазы и созданы векторы экспрессии нуклеозидфосфорилаз (пуринну-клеозидфосфорилаза, уридинфосфорилаза и тимидинфосфорилаза). Выделены штаммы-сверхпродуценты на основе штамма E. coli BL21 с активностью целевых ферментов, в 2030 раз превышающей активность ферментов, традиционно используемых штаммов E.coli. Разработаны и оформлены технологические инструкции по получению препаратов реком-бинантных нуклеозидфосфорилаз. Результаты исследований применяются в технологии производства флуаробела, гуарана и рибавери-на - высокоэффективных противолейкозных и противовирусных препаратов последнего поколения.
С 1979 по 1994 гг. Николай Александрович Картель занимает должность заместителя директора по научной работе Института гене-
тики и цитологии НАН Беларуси, а с 1994 по 2004 гг. является его директором. В течение этого времени Н.А. Картель наиболее успешно реализует свой научный потенциал
В 1985 году Н.А. Картель возглавил лабораторию молекулярной генетики и объединил под своим руководством коллектив молодых, инициативных сотрудников, которые начали новые для Беларуси разносторонние исследования в области молекулярной генетики. В середине 80-х годов впервые в нашей стране в этой лаборатории были проведены экспертизы по ДНК-идентификации личности человека и выполнены анализы по установлению отцовства. Работы вызвали огромный интерес криминалистов и позже были переданы в соответствующие структуры МВД. Сотрудничество в этой области продолжалось на протяжении многих лет. Совместно с НИИ проблем криминологии, криминалистики и судебной экспертизы (НИИПККиСЭ) Минюста РБ был разработан новый метод выделения и очистки ДНК из криминалистических объектов, созданы две триплексные тест-системы и наборы реактивов для выделения ДНК и ге-нотипирования, разработаны протоколы использования созданных тест-систем. Данные разработки внедрены в практику производства судебно-генетических экспертиз по постановлениям следствия и судов в НИИПККиСЭ.
В связи с Чернобыльской катастрофой коллектив лаборатории под руководством Н.А. Картеля включился в исследования проблемы воздействия радиации на геном человека. Были изучены молекулярные факторы, влияющие на развитие папиллярных карцином щитовидной железы у белорусских пациентов, прооперированных в 1996-2005 гг., проживающих во время аварии на Чернобыльской АЭС в зоне радиационного облучения. Были обнаружены закономерности в распределении активирующих мутаций генов Braf и c-ret среди больных и показано, что онкогены Ret/PTd отмечены с большей частотой при случаях заболевания, которые наблюдались через 10-15 лет после аварии. Впервые установлено наличие альтернативного сплайсинга транскриптов Ret/РТС при папиллярном раке щитовидной железы. В опухолевых клетках обнаружены различные изоформы Ret/РТС, которые различались доменами на С-концевом участке белка. Выявлены также уникальные формы онкогена Ret/
РТС. Продемонстрирована предрасположенность к развитию папиллярного рака щитовидной железы, связанная с редкими формами аллеля гена Hrasl.
В середине 80-х годов в лаборатории молекулярной генетики были начаты исследования повторяющихся последовательностей геномов злаков. Впервые установлено присутствие простых повторов AT, CA, GA и GC в геноме ячменя. У растений удалось клонировать и секвенировать последовательность, содержащую АТ-повторы и использовать ее в качестве молекулярно-генетического маркера. Позже была продемонстрирована возможность модуляции активности промоторов простыми повторами (AT)n и (AC)n, а также способность простых повторов частично выполнять функции промотора.
В процессе исследований изучена роль отдельных классов повторяющихся последовательностей ДНК в структуре, организации и функционировании генома растений. Так, изучение диспергированной повторяющейся последовательности из семейства транскрип-ционно активных повторов в геноме ячменя позволило установить, что эта последовательность является членом нового семейства, на долю которого приходится около 5% генома ячменя и до 1% генома ржи и пшеницы. Члены семейства диспергированы по всем 7 хромосомам ячменя. Их гомологи представлены в геномах видов Secale, Triticum, Avena, Zea. Расхождение видов трибы Triticae в процессе эволюции сопровождалось изменением структуры данного повтора. Это была первая секвенированная последовательность, зарегистрированная в GenBank от Беларуси. Были клонированы и охарактеризованы диспергированные повторяющиеся последовательности из генома ржи и пшеницы, на долю которых приходится около 0,5% генома.
Сформированная библиотека низкокопий-ных и уникальных последовательностей ДНК ржи привела в дальнейшем к созданию. совместно с учеными из Санкт-Петербурга (Россия) и Гатерслебена (Германия), ряда насыщенных молекулярными маркерами генетических карт этой культуры. В общей сложности на ней было локализовано 20 генов, кодирующих хозяйственно ценные признаки, и обнаружено 124 локуса, контролирующих количественные признаки.
Впервые совместно с исследователями из Санкт-Петербурга с помощью цитологического анализа метафазы I мейоза были выделены и охарактеризованы мутантные растения у шести гибридных F2 популяций ржи, расщепляющихся по признаку «нарушение синапса гомологичных хромосом». Показано моногенное наследование по синаптическим мутациям: 5у1, $у9, sy10, 8у18, 8у19. Построены генетические карты сцепления участков хромосом 2R и 7R ржи, включающие изоферментные локусы, микро-сателлитные маркеры и гены, ответственные за синапсис хромосом. Создана генетическая ALFP карта генома ржи популяции F2, расщепляющейся по наличию десинаптической мутации 8у10, картированной на хромосоме 5R ржи. Впервые для ржи получены двойные мутанты по генам асинапсиса 5у1 и sy9.
Разработаны методы ДНК-тестирования хозяйственно ценных генов в геноме пшеницы и других сельскохозяйственных культур. В частности, предложен эффективный метод ДНК-тестирования аллельного состава генов, кодирующих некоторые запасные белки зерновок белорусских сортов пшеницы, и изучен аллельный состав глютенинов, определяющих вязкость и эластичность муки, пуроиндолинов, определяющих твердозерность, а также генов короткостебельности. Выявлены сорта пшеницы, обладающие наилучшим сочетанием аллелей высокомолекулярных глютенинов и твердо-зерности. Совместно с НПЦ НАН Беларуси по земледелию создано 3 сорта озимой пшеницы.
Разработана система ДНК-идентификации и паспортизации генотипов пшеницы, картофеля, томата, льна, свеклы и других культур. Метод основан на использовании SSR-маркеров, выявленных в результате полимеразной цепной реакции, что позволяет проводить анализ любых органов растений на различных стадиях онтогенеза. Для каждого вида подобран набор высокополиморфных SSR-маркеров, достаточный для идентификации сортов, форм и линий. Представлена система регистрации генотипов в виде генетических формул, которые отображают аллельный состав микросателлитных локусов. Предложенный метод ДНК-паспортизации обеспечивает возможность проверки соответствия сортов критериям ООС-теста (отличимость, однородность и стабильность). Он может быть использован для решения широкого круга задач,
таких как: оценка генотипической однородности сортов, линий или гибридов, соответствия сорта стандарту, для создания компьютерной базы данных ДНК-паспортов, охраняемых в РБ сортов растений.
Особое внимание Николай Александрович уделял созданию генетически модифицированных организмов. Под его руководством проводилась отработка условий регенерации растений в культуре in vitro. На модельных и хозяйственно ценных растениях апробировались различные методы трансформации: с помощью транспозонов, путем слияния протопластов, баллистическая, агробактериальная. Параллельно проводились исследования по созданию эффективных векторов для трансформации.
Сотрудники лаборатории одними из первых использовали векторы на основе транспозонов при создании трансгенных растений, также ими была показана возможность получения с их помощью модифицированных растений линий дикого вида картофеля S. chacoense. В дальнейшем разработка векторных конструкций разной степени сложности стала неотъемлемым этапом работ по созданию трансгенных растений. В частности, была создана серия рекомбинантных плазмид, содержащих вставки простых повторов (AC)n и (AT)n в различных областях 35S CaMV промоторов, а также в 3' нетранслируемой области генов cat и bar. Впервые показано, что эти последовательности способны модифицировать экспрессию генов в протопластах табака и клетках кишечной палочки. Выявлены общие закономерности влияния простых повторов на экспрессию генов, что свидетельствует об универсальности механизмов их действия в геномах, а также позволяет использовать данные повторы для модуляции экспрессии генов в экспериментах по генетической трансформации растений.
Были построены теоретические модели, обосновывающие модификацию нуклеотидных последовательностей гетерологических генов для их экспрессии в растениях. Осуществлены модификации нуклеотидных последовательностей ге-терологичных генов в соответствии с выбранными теоретическими моделями. Проведен синтез генов cry3A и ингибитора протеаз из S. gregaria с оптимизированным кодонным составом. Выполнена модификация гена SD2, которая заключается в замене части гена на последовательность дефензина из картофеля. Синтезирована форма
гена CYP11A1, лишенная последовательности лидерного полипептида. Получены векторные конструкции для трансформации растений модифицированными гетерологичными генами. Создан ряд оригинальных векторных систем, несущих хозяйственно ценные гены рамноли-пидов, хитиназы, глюкозооксидазы, цитохрома P450scc и др.
Разработанные векторные конструкции были успешно применены для создания трансгенных растений табака, арабидопсиса, картофеля и др. Так, в ходе исследований, выполненных совместно с английскими учеными, впервые были созданы модельные трансгенные растения табака и арабидопсиса с генами rhlA и rhlB биосинтеза рамнолипидов. Лабораторные эксперименты показали, что они могут обладать толерантностью к тяжелым металлам.
Проведены эксперименты по трансформации картофеля геном хитиназы. Показано, что система гетерологичной экспрессии гена эн-дохитиназы chiA из гриба Serratia plymuthica на основе вектора pGreen и pBI121 в агробак-териальных штаммах способна индуцировать трансформацию тетраплоидного картофеля. Интеграция трансгена в геном растений была подтверждена молекулярными методами. В результате были созданы трансгенные растения картофеля на основе белорусского сорта Дельфин. Введение трансгена эндохитиназы chiA приводило к синтезу в трансгенных растениях белкового продукта данного гена -функционально активного фермента хитиназы, способствующего подавлению роста фитопато-генных грибов. Были получены количественные данные об уровне ферментативной активности хитиназы в каждой индивидуальной трансгенной линии с использованием различных хитиназа-специфичных субстратов. Показано противогрибное влияние фермента хитиназы в белковых экстрактах трансгенных растений картофеля. Образцы с высокой активностью хи-тиназы были оценены как перспективные в качестве источника генотипов, способных ингиби-ровать рост и развитие фитопатогенных грибов. Показано, что ген хитиназы может способствовать подавлению роста патогенов - возбудителей Fusarium oxysporum, Botrytis cinerea и Аlternaria solani в лабораторных условиях.
Разработаны оригинальные системы гете-рологичной экспрессии гена cry3aM Bacillus
thuringiensis, кодирующего дельта-эндотоксин в растениях картофеля. Целью этих исследований было выявление наиболее эффективной экспрессионной системы для создания растений, устойчивых к колорадскому жуку. Получены и проходят испытание трансгенные растения картофеля, в которых происходит наработка белкового продукта гена с^уЗаМ.
Впервые показано, что гетерологичный ген, кодирующий полноразмерную последовательность кДНК CYPIIAI цитохрома p450scc животного происхождения, экспрессируется в растениях. В качестве объектов были выбраны табак и наперстянка. Показано, что в них происходит образование функционально активного белкового продукта. Выявлено, что экспрессия гетероло-гичного гена CYPIIAI в трансгенных растениях табака приводит к формированию фенотипа, характеризующегося сокращенным периодом вегетативного развития (раннее цветение и созревание семенных коробочек), увеличенной биомассой и повышенной продуктивностью. Впервые показано, что белковый продукт гена CYPIIAI животного происхождения интегрируется в стероидогенную систему растений, вызывая изменения в метаболизме стероидных соединений. Установлено, что содержание кар-диотонических стероидных гликозидов в листьях трансгенных растений наперстянки двух независимых генетических линий превышает таковое в листьях контрольных растений на 11-16%. Показано, что цитохром Р450ксс млекопитающих способен функционировать в растениях с образованием стероидного гормона - прегненолона. Работы проводились совместно с Институтом общей генетики (г. Москва, Россия). Полученные результаты могут быть положены в основу создания трансгенных растений, в частности, лекарственных, с более высокой продуктивностью биологически активных стероидных соединений.
В результате агробактериальной трансформации получены растения картофеля на основе сорта белорусской селекции Скарб, содержащие ген глюкозооксидазы (gox). Факт интеграции и экспрессии гетерологичного гена подтвержден молекулярно-генетическими и биохимическими методами. Показано, что отдельные линии в лабораторных условиях характеризуются устойчивостью к фитофторе.
Большое внимание Николай Александрович уделял вопросам биобезопасности. Под его непосредственным руководством в Институте генетики и цитологии НАН Беларуси была создана и аккредитована лаборатория по детекции ГМО в пищевых продуктах. Совместно с Республиканским центром гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья была подготовлена инструкция «Молекулярно-генетическая оценка продовольственного сырья, пищевых продуктов и кормов, полученных из генно-инженерных организмов или с их использованием».
Николай Александрович Картель оставил огромное научное наследие. Полученные им результаты опубликованы более чем в 490 научных работах, защищены 4 авторскими свидетельствами и 8 патентами на изобретения. Среди его научных работ 4 монографии, учебник «Биотехнология в растениеводстве» (2005 г.), толковый словарь «Генетика: энциклопедический словарь» (издан в 1999 г., в 2011 г. вышло второе переработанное издание), удостоенный Премии НАН Беларуси. Николаем Александровичем создана научная школа молекулярных генетиков в Беларуси и подготовлены 17 кандидатов наук. Под его руководством проводились совместные исследования с учеными из России, Украины, Израиля, Германии, Великобритании. Его ученики успешно работают в ряде зарубежных стран.
За выдающиеся научные заслуги Николай Александрович в 1986 г. был избран членом-корреспондентом, в 1996 г. - академиком НАН Беларуси. В 1998 году он становится академиком Центрально-Европейской академии науки и искусства, в 1999 г. ему присвоено звание заслуженного деятеля науки Беларуси, с 2006 г. он - академик Международной академии наук Евразии. Н.А. Картель был членом многочисленных научных и экспертных советов, редколлегий ведущих профильных научных журналов. Награжден почетными грамотами и медалями, в т.ч. медалью им. Н.И. Вавилова и медалью Франциска Скорины.
Академик Николай Александрович Картель оставил большое научное наследие. Оно заключается не только в его научных трудах, но и в том влиянии, которое он оказал на развитие отечественной молекулярной генетики.
Дата поступления статьи 18 мая 2014 г.
