CC BY
21DOI: 10.24412/2226-079Х-2022-12431
Нарушения кальциевой сигнализации в клеточных моделях болезни Гентингтона
В.А. Вигонт1, Д.А. Грехнёв1, О.С. Лебедева2, Л.Д. Беликова2, 3, С.А. Клюшников4, Е.В. Казначеева1
1 ФГБУН "Институт цитологии"РАН (Санкт-Петербург) 2 ФГБУ "Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины" ФМБА России (Москва) 3 ФГБОУВО "Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова" 4 ФГБНУ "Научный центр неврологии"(Москва)
Введение
Болезнь Гентингтона (БГ) является тяжелым аутосомно-доминантным нейродегенеративным расстройством, вызванным экспансией CAG-по-второв в гене, кодирующем белок гентингтин. В норме длина тракта, состоящего из кодируемых данными повторами остатков глутамина, не должна превышать 35 остатков, в то время как более длинные полиглутаминовые тракты приводят к заболеванию. При этом чем длиннее будет полиглутаминовый тракт, тем в более раннем возрасте начнут проявляться первые симптомы и тем тяжелее будет протекать заболевание [1].
Несмотря на относительно невысокую частоту встречаемости БГ, порядка 4-10 случаев на 100 тыс. населения, данное заболевание активно изучается, и многие прорывы в понимании механизмов патологических процессов в центральной нервной системе и разработке нейропротек-тивных терапевтических препаратов неразрывно связаны именно с ним [2]. Поскольку БГ носит наследственный характер и связана с мутацией в конкретном гене, ее относительно легко моделировать. Благодаря этому клеточные и животные модели БГ представляют собой уникальную платформу для изучения молекулярных механизмов нейродегенерации, особенностей патологического протеостаза и клеточной сигнализации, поиска новых терапевтических мишеней и скрининга потенциально лекарственных соединений. Возможно, именно БГ станет первым нейродеге-неративным заболеванием, молекулярные основы которого будут полностью изучены, что не только поспособствует излечению пациентов с БГ, но и даст существенный импульс в разработке подходов к терапии таких социально значимых распространенных нейродегенеративных
патологий, как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона.
Моделирование БГ
Для того чтобы эффективно изучать нейро-дегенеративные патологии, необходимо иметь адекватные модели, в полной мере отражающие нарушения функционирования клеток органов и систем, присущие заболеванию. Для БГ было создано множество животных и клеточных моделей, адекватно реконструирующих патологическую картину заболевания. Животные модели БГ исключительно разнообразны и включают в себя организмы различного уровня сложности: от дрожжей до приматов. Среди наиболее распространенных вариантов можно выделить мышиные модели BACHD, YAC128 и R6/2 [3]. Большинство животных моделей связаны с генетическими способами заставить организм экспрессиро-вать ген мутантного гентингтина для воспроизведения патологического фенотипа. В то же время встречаются и негенетические модели, позволяющие получить сходный с БГ фенотип с помощью инъекций 3-нитропропионовой или хинолиновой кислоты [4, 5].
В качестве клеточных моделей использовались как иммортализованные линии клеток, так и первичные культуры нейронов и глии [6]. Здесь важно отметить, что наряду с моделями, экспрес-сирующими полноразмерный мутантный ген-тингтин или его ^концевой фрагмент, часто встречались модели, содержащие только сам длинный полиглутаминовый тракт. Такие модели имеют право на существование, но ограничены в применении и не могут считаться адекватными моделями именно БГ, поскольку на сегодняшний день известно 9 различных заболеваний, связан-
ных с полиглутаминовой экспансией в различных генах. Данные заболевания существенно различаются по клинико-физиологическим характеристикам, имеют различные паттерны ней-рональной гибели и не могут быть адекватно воспроизведены только с помощью длинного полиглутаминового тракта без учета того белка, в котором этот тракт находится. Таким образом, подобное моделирование заболеваний не дает нужной специфичности и малоэффективно для разработки таргетной терапии.
Одним из наиболее существенных прорывов в моделировании нейродегенеративных патологий стало открытие индуцированной плюрипотент-ности [7]. С помощью экспрессии факторов Яманаки фибробласты, полученные из биоптата пациента, репрограммируют в так называемые индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), а затем дифференцируют ИПСК в подходящий тип клеток. Такие модели можно назвать пациентспецифичными. Огромное преимущество пациентспецифичных моделей наследственных заболеваний заключается в эндогенной экспрессии мутантных генов. Также важным моментом является возможность моделировать заболевания именно на тех типах клеток, которые наиболее сильно поражаются при конкретных патологиях. Применительно к ней-родегенеративным заболеваниям такой подход дает возможность не просто исследовать молекулярный патогенез на нейронах человека, но и с помощью направленной дифференцировки сравнивать нарушения внутриклеточных процессов на различных типах нейронов. Таким образом, развитие пациентспецифичных моделей, в том числе за счет трехмерного культивирования, и протоколов дифференцировки позволит приблизиться к разрешению одной из наиболее интригующих проблем современной нейробио-логии, а именно селективной гибели нейронов при различных нейродегенеративных заболеваниях. Еще одной возможностью, которую открывает перед учеными использование пациент-специфичных моделей, является изучение спорадических случаев различных патологий, не связанных с мутациями в конкретных генах и потому крайне сложных для моделирования in vitro другими способами. Применительно к БГ пациентспецифичные модели также дали возможность изучать патологические проявления для аллелей с низким числом повторов, т.е. для
пациентов, у которых длина полиглутаминового тракта мутантного гентингтина невелика и находится на границе с нормой, лишь немного превышая ее. В отличие от пациентспецифичных нейронов с большим числом CAG-повторов, демонстрирующих очевидные нарушения внутриклеточной сигнализации, в более ранних моделях, основанных на экзогенной экспрессии низкоповторного гентингтина, как правило, не выявлялось существенных отличий от контроля.
Нарушения кальциевой сигнализации при БГ
Ионы кальция являются одним из наиболее важных внутриклеточных посредников, контролирующих широкий спектр клеточных процессов - от экспрессии генов и мышечных сокращений до пролиферации и апоптоза. Нарушения кальциевой сигнализации были отмечены при множестве заболеваний, включая нейродегене-ративные [8-13]. Кальциевая гипотеза нейроде-генерации, постулирующая центральную роль нарушения кальциевого гомеостаза в развитии нейродегенеративных заболеваний, была сформулирована еще в 1984 г. и получила новый импульс в 2004 г. [14, 15].
При БГ происходят множественные и мульти-направленные нарушения клеточного метаболизма и сигналинга [16]. Про кальциевую сигнализацию при БГ также можно сказать, что она дестабилизирована сразу по множеству направлений, включая приток кальция через рецептор NMDA, изменение экспрессии генов, кодирующих кальцийсвязывающие белки и взаимодействие с ними мутантного гентингтина, влияние мутантного гентингтина на депонирование кальция митохондриями и эндоплазматическим ре-тикулумом [17-24]. Дестабилизация содержания кальция в эндоплазматическом ретикулуме за счет прямого взаимодействия мутантного ген-тингтина с рецептором 1Р3 и потенциированием последнего [23, 24] позволила нам сформулировать гипотезу о нарушении притока кальция через депо-управляемые каналы, активация которых происходит в ответ на понижение уровня кальция во внутриклеточных депо, роль которых в различных клетках играет, как правило, эндо-плазматический или саркоплазматический рети-кулум.
Вообще, депо-управляемый вход кальция является одним из наиболее общих типов притока
ионов кальция в клетку, он характерен как для электроневозбудимых клеток, так и для нейронов. В 2011 г. при использовании модели БГ, основанной на экзогенной экспрессии полноразмерного гентингтина с длиной тракта 138 остатков глутамина в клетках нейробластомы человека SK-N-SH, мы впервые показали, что в БГ-специфичных клетках депо-управляемый вход оказался значительно повышен по сравнению с контрольными клетками, экспрессирую-щими нормальный гентингтин, либо с интакт-ными клетками SK-N-SH [25]. В той статье де-по-управляемый вход был впервые постулирован как перспективная мишень для разработки лекарств против БГ, а также был найден новый ингибитор депо-управляемого входа - соединение EVP4593, имеющее перспективы использования в фармакологии [25]. Ранее данное соединение было известно в качестве антагониста NK-кB сигнального пути [26], мы же впервые показали его действие на депо-управляемые каналы, продемонстрировав, что аномально увеличенный депо-управляемый вход может быть снижен аппликацией соединения EVP4593 в концентрации 300 нМ [25]. В дальнейшем полученные эффекты патологического увеличения депо-управляемого входа кальция были подтверждены на моделирующих БГ клетках нейро-бластомы мыши №шга2А [27], а также на первичной культуре срединных шипиковых нейронов стриатума мыши (СШН) [27], что имеет особенную ценность, поскольку именно данный тип нейронов является наиболее уязвимым при БГ [28].
Все вышеописанные модели были основаны на трансфекции либо лентивирусной инфекции, призванных доставить в клетки генетические конструкции для экспрессии полноразмерного мутантного гентингтина со 138 остатками глута-мина в тракте либо его ^концевого фрагмента, содержащего мутантный полиглутаминовый тракт. Однако столь длинные тракты являются скорее экзотикой, характерной для редких случаев младенческой формы заболевания. Известно, что длина тракта прямо коррелирует со степенью тяжести заболевания и обратно коррелирует с возрастом манифестации первых его симптомов [1]. Мы поставили цель изучить возможные нарушения кальциевой сигнализации в низкоповторных моделях БГ, что стало возможным благодаря пациентспецифичным ИПСК, которые
были дифференцированы в ГАМКергические СШН [29]. В исследуемых нами 3 нейрональных пациентспецифичных линиях длина тракта му-тантного гентингтина составляла 40, 42 и 47 остатков глутамина. В качестве контроля мы использовали 2 линии нейронов, полученных в ходе репрограммирования фибробластов здоровых доноров, и 1 линию нейронов, полученную в результате дифференцировки эмбриональных стволовых клеток также от здорового донора. Мы убедительно показали, что в таких низкоповторных моделях депо-управляемый вход кальция двукратно повышен в любой из БГ-специфичных линий по сравнению с любой контрольной линией [29]. При этом уровень депо-управляемого входа в здоровых нейронах, полученных из ИПСК либо эмбриональных стволовых клеток, не различался [29]. Таким образом, увеличение депо-управляемого входа кальция является хорошо воспроизводимым параметром и даже может являться одним из маркеров заболевания. Поскольку все пациенты с БГ из нашей выборки были гетерозиготами по гену, кодирующему ген-тингтин, мы с использованием аллельспецифич-ного нокдауна мутантного гена убедительно доказали, что наблюдаемое увеличение уровня депо-управляемого входа кальция в БГ-специ-фичных нейронах связано именно с экспрессией мутантного гентингтина.
Дальнейшие исследования с использованием ювенильной пациентспецифичной модели БГ (мутантный гентингтин с длиной тракта 76 остатков глутамина) [30] показали, что уровень входа кальция через депо-управляемые каналы в БГ-специфичных клетках не зависит от длины полиглутаминового тракта мутантного гентинг-тина: выраженность эффекта для ювенильной модели оказалась такой же, как и для низкоповторных моделей [29, 30], что, вероятно, может быть связано с лимитом порообразующих субъединиц каналов либо белков, их активирующих. Таким образом, даже небольшой длины полиглу-таминового тракта, выходящей тем не менее за границы нормы, уже достаточно, чтобы выра-женно дестабилизировать работу депо-управляе-мых каналов.
Кроме того, на примере ювенильной модели БГ нам удалось показать, что уровни белка ген-тингтина, а также известного активатора депо-управляемых каналов - сенсора кальция в эндо-плазматическом ретикулуме STIM2 двукратно
повышены в БГ-специфичных нейронах. Более того, у ранее изученного ингибитора депо-уп-равляемого входа EVP4593 обнаружился эффект снижать уровни гентингтина и STIM2 при длительной инкубации с клетками в течение 24-48 ч [30]. Впоследствии это увеличение было подтверждено и на низкоповторных моделях [30]. Данный эффект также может вносить вклад в нейропротекторные свойства EVP4593, которые он проявлял на различных моделях БГ [25, 27, 29]. Дополнительные исследования показали, что патологическое увеличение депо-управляе-мого тока в БГ-специфичных СШН связано именно с повышенным уровнем активатора STIM2, что подтверждается чувствительностью токов к G418, известному ингибитору STIM2, а также к снижению уровня STIM2 вследствие инкубации клеток с EVP4593 либо вследствие shRNA-опосредованного нокдауна [30]. Ранее мы продемонстрировали, что EVP4593 способно в остром эксперименте ингибировать вход кальция через различные типы депо-управляемых каналов [31]; это позволило сделать предположение о том, что мишенью EVP4593 является скорее какой-либо общий регуляторный белок, нежели каналообразующие субъединицы. Косвенные данные наталкивают на мысль, что таким белком может оказаться активатор депо-уп-равляемых каналов STIM2, однако требуются дальнейшие исследования для подтверждения либо опровержения этой гипотезы. В настоящий момент прямая молекулярная мишень для EVP4593 неизвестна, хотя некоторые работы предполагают в качестве мишени митохондри-альный комплекс I [32].
Помимо дисфункции депо-управляемых каналов мы также показали увеличение потенци-ал-управляемого кальциевого входа в БГ-специ-фичных СШН по сравнению с нейронами, полученными в результате репрограммирования клеток здоровых доноров [28]. Зарегистрированные токи были частично чувствительны к ингибитору L-типа потенциал-управляемых кальциевых каналов нифедипину, что говорит о возможном вкладе данного типа каналов в патологический кальциевый гомеостаз при БГ.
Заключение
Проведенные за последнее десятилетие исследования позволили прочно связать патогенез БГ со значительными нарушениями в кальциевой
сигнализации и утвердить депо-управляемые кальциевые каналы в качестве важной молекулярной мишени для таргетной терапии этого заболевания. Полученные и электрофизиологиче-ски охарактеризованные пациентспецифичные модели БГ стали важной платформой для изучения молекулярных основ нейродегенерации и планируются к использованию в качестве модельного объекта для проведения скрининга потенциально лекарственных соединений, в том числе с кальций-модулирующей активностью. Одним из перспективных соединений нейропро-текторного характера можно считать ингибитор депо-управляемых кальциевых каналов EVP4593, однако сложности, связанные с подтверждением его непосредственной молекулярной мишени, затрудняют переход к доклиническим и клиническим испытаниям. В настоящий момент ведется работа по изучению нарушений кальциевой сигнализации в полученных из ИПСК БГ-спе-цифичных нейронах различных типов для того, чтобы попытаться понять причины избирательной гибели СШН при БГ и заложить фундамент для кальциевой гипотезы селективной уязвимости нейронов при различных нейродегенеративных патологиях.
Работа поддержана грантом РНФ № 22-1400218.
Список литературы
1. Illarioshkin SN et al. Trinucleotide repeat length and rate of progression of Huntington's disease. Ann. Neurol. 1994;36(4):630-5.
2. Иллариошкин С.Н. Болезнь Гентингтона как модель для изучения нейродегенеративных заболеваний. Бюл. Нац. общ. изуч. бол. Парксинсона расстр. движ. 2016;1:3-11.
3. Farshim PP et al. Mouse models of Huntington's disease. Methods Mol. Biol. 2018;1780:97-120.
4. Borlongan CV et al. 3-nitropropionic acid animal model and Huntington's disease. Neurosci. Biobehav. Rev. 1997;21(3):289-93.
5. Lelos MJ, Dunnett SB. Generating excitotoxic lesion models of Huntington's disease. Methods Mol. Biol. 2018;1780:209-20.
6. Колобкова Ю.А. и др. Болезнь Хантингтона: нарушения кальциевой сигнализации и модели для изучения развития патологии. Acta Naturae. 2017;2(33):35-49.
7. Takahashi et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 2007;131(5):861-72.
8. Berridge MJ. The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease. Physiol. Rev. 2016;96(4):1261-96.
9. Bezprozvanny I. Calcium signaling and neurodegenerative diseases. Trends Mol. Med. 2009;15(3):89-100.
10. Egorova P et al. Disturbed calcium signaling in spinocerebellar ataxias and Alzheimer's disease. Semin. Cell Dev. Biol. 2015;40:127-33.
11. Grekhnev DA et al. Patient-specific iPSCs-based models of neurodegenerative diseases: focus on aberrant calcium signaling. Int. J. Mol. Sci. 2022;23(2):624.
12. Secondo A et al. On the role of store-operated calcium entry in acute and chronic neurodegenerative diseases. Front. Mol. Neurosci. 2018;11:87.
13. Surmeier DJ et al. Calcium and Parkinson's disease. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2017;483(4):1013-9.
14. Khachaturian ZS. Towards theories of brain aging. In: Handbook of studies on psychiatry and old age. Kay DW, Burrows GD, eds. Amsterdam, Netherlands: Elsevier; 1984: 7-30.
15. Bezprozvanny I, Hayden MR. Deranged neuronal calcium signaling and Huntington disease. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004;322(4):1310-7.
16. Иллариошкин СН и др. Молекулярный патогенез болезни Гентингтона. Биохимия. 2018;83(9):1299-310.
17. Fan MM et al. Altered NMDA receptor trafficking in a yeast artificial chromosome transgenic mouse model of Huntington's disease. J. Neurosci. 2007;27(14):3768-79.
18. Fan MMY et al. N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor function and excitotoxicity in Huntington's disease. Prog. Neurobiol. 2007;81(5-6):272-93.
19. Czeredys M et al. Expression of genes encoding the calcium signalosome in cellular and transgenic models of Huntington's disease. Front. Mol. Neurosci. 2013;6:42.
20. Luthi-Carter R et al. Dysregulation of gene expression in the R6/2 model of polyglutamine disease: parallel changes in muscle and brain. Hum. Mol. Genet. 2002;11(17):1911-26.
21. Choo YS et al. Mutant huntingtin directly increases susceptibility of mitochondria to the calcium-induced permeability transition and cytochrome c release. Hum. Mol. Genet. 2004;13(14):1407-20.
22. Panov AV et al. Early mitochondrial calcium defects in Huntington's disease are a direct effect of polyglutamines. Nat. Neurosci. 2002;5(8):731-6.
23. Tang TS et al. Huntingtin and huntingtin-associated protein 1 influence neuronal calcium signaling mediated by inositol-(1,4,5) triphosphate receptor type 1. Neuron. 2003;39(2):227-39.
24. Tang TS et al. Disturbed Ca2+ signaling and apoptosis of medium spiny neurons in Huntington's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005;102(7):2602-7.
25. Wu J et al. Neuronal store-operated calcium entry pathway as a novel therapeutic target for Huntington's disease treatment. Chem. Biol. 2011;18(6):777-93.
26. Tobe M et al. A novel structural class of potent inhibitors of NF-kappa B activation: structure-activity relationships and biological effects of 6-aminoquinazoline derivatives. Bioorg. Med. Chem. 2003;11(18):3869-78.
27. Vigont V et al. Both Orail and TRPC1 are involved in excessive store-operated calcium entry in striatal neurons expressing mutant huntingtin exon 1. Front. Physiol. 2015;6:337.
28. Vonsattel JP, DiFiglia M. Huntington disease. J. Neuro-pathol. Exp. Neurol. 1998;57(5):369-84.
29. Nekrasov ED et al. Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Mol. Neurodegener. 2016;11:27.
30. Vigont VA et al. STIM2 mediates excessive store-operated calcium entry in patient-specific iPSC-derived neurons modeling a juvenile form of Huntington's disease. Front. Cell Dev. Biol. 2021;9:625231.
31. Vigont V et al. Patient-specific iPSC-based models of Huntington's disease as a tool to study store-operated calcium entry drug targeting. Front. Pharmacol. 2018;9:696.
32. Krishnathas R et al. Identification of 4-N-[2-(4-phenoxy-phenyl)ethyl]quinazoline-4,6-diamine as a novel, highly potent and specific inhibitor of mitochondrial complex I. MedChemComm. 2017;8(3):657-61.
vj) № 2 • 2022
37
