CC BY
178
УДК 616.89-008.441.13+612-092.18 в. Е. ВЫСОКОГОРСКИЙ
Е. С. ЕФРЕМЕНКО Д. Е. БЫКОВ О. Ю. ЖУКОВА Г. А. ЛОПУХОВ
Омская государственная медицинская академия
НАРУШЕНИЕ ОБМЕНА ГЛУТАТИОНА ПРИ АЛКОГОЛИЗМЕ_____________________________________________
Представлены данные об интенсивности обмена глутатиона при алкогольном абстинентном синдроме, а также при сочетании алкогольной интоксикации с сахарным диабетом. Показано, что в условиях алкогольной зависимости возникают значительные нарушения обмена данного соединения.
Ключевые слова: глутатион, алкоголизм, сахарный диабет.
Сохранение стационарного уровня непрерывно протекающего процесса свободнорадикального окисления различных соединений считается одним из важнейших условий нормального функционирования клеток и организма в целом [1]. Широкий спектр заболеваний и патологических состояний имеет в структуре своих механизмов развития нарушения, сопряженные с трансформацией окислительновосстановительного статуса [2]. В некоторых случаях возникновение негативных изменений в окислительном метаболизме становится определяющим фактором развития патологии. Данные обстоятельства способствовали созданию концепции «свободнорадикального» генеза многих нозологических форм и составлению перечня «болезней свободных радикалов». В этом списке имеется указание на формирование окислительного стресса при различных экзогенных интоксикациях [3], среди которых злоупотребление алкоголем по-прежнему остается значимой медико-социальной проблемой, что связано с высокой распространенностью алкоголизма.
Активация свободнорадикальных процессов выявлена при острой и хронической алкогольной интоксикации [4]. В этих условиях неудовлетворительная инактивация соединений свободнорадикальной природы, осуществляемая антиокислительной системой, определяет возможность развития окислительного стресса.
Одной из важнейших составляющих антиокислительной системы является глутатионовая антипер-оксидная система, что обусловлено особенностями строения и функционирования ее основного компонента — глутатиона.
Глутатион — низкомолекулярный тиол, преобладающий во многих растительных, микробных и во всех животных клетках, в которых его молярная концентрация (1 — 10 мМ) выше, чем концентрация большинства органических веществ. Биосинтез и катаболизм глутатиона, который является трипепти-дом (Ь-гамма-глутамил-Ь-цистеинилглицин), осуществляется в так называемом глутамильным цикле. Функции глутатиона многообразны: восстановление и изомеризация дисульфидных связей, влияние на активность ферментов и других белков, поддержание мембранных функций, коферментные функции, участие в обмене эйкозаноидов, резервирование
цистеина, влияние на биосинтез нуклеиновых кислот и белка, пролиферацию, но важнейшей функцией данного трипептида является обеспечение антиокси-дантной защиты [5].
Наибольший интерес представляет оценка состояния системы глутатиона при алкогольном абстинентном синдроме, который является узловым этапом развития алкогольной зависимости, а также при сочетании алкоголизма с другими заболеваниями.
Для выяснения состояния системы глутатиона при алкогольном абстинентном синдроме нами было проведено исследование уровня восстановленного глу-татиона и активности ферментов его обмена в эритроцитах больных алкоголизмом. В число обследуемых вошли 70 пациентов Омского областного наркологического диспансера с диагнозом «психические и поведенческие расстройства в результате употребления алкоголя, средняя стадия. Синдром активной зависимости. Состояние отмены неосложненное, средней степени тяжести» (Б.10.242, Б.10.302). Были сформированы группы больных, у которых забор крови для исследования проводился в 1-е (группа А1), 3-и (группа А3), 5-е (группа А5) и 10-е (группа А10) сутки после поступления в стационар. Материалом для определения уровня восстановленного глута-тиона (СБИ) и активности ферментов антиокисли-тельной системы служил осмотический гемолизат осадка эритроцитов. Контрольную группу составили 10 условно здоровых лиц аналогичной возрастной категории.
При исследовании уровня восстановленного глу-татиона в эритроцитах больных алкоголизмом в 1-е сутки после поступления в стационар отмечается снижение данного показателя на 14 % (ри<0,01) по сравнению с контрольной группой. Глутатионпер-оксидазная активность увеличена в данный срок, отличаясь от контрольных данных в 1,5 раза (ри<0,001). Помимо усиленного использования восстановленного глутатиона в глутатионпероксидазной реакции, недостаточный уровень его восстановления глута-тионредуктазой в данный срок исследования, неблагоприятно сказывается на его концентрации в эритроцитах.
На 3-и сутки после поступления в стационар уровень восстановленного глутатиона эритроцитов остается сниженным на 14 % (рУ<0,05). К 10-м суткам
ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК № 1 (104) 2011 МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ
МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК № 1 (104) 2011
пребывания в стационаре уровень восстановленного глутатиона в эритроцитах снижен на 12 % (ри<0,05) по сравнению с контрольной группой, несмотря на повышение активности глутатионредуктазы в этих клетках в 1,3 раза (ри<0,01), что может быть обусловлено интенсивным использованием его глутатион-Б-трансферазой.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что неэффективность антиокисли-тельной защиты в период алкогольной абстиненции связана в первую очередь с нарушением обмена глутатиона.
Для выяснения механизмов данных нарушений нами было проведено исследование уровня восстановленного глутатиона и активности ферментов его обмена в печени крыс при моделировании алкогольной зависимости.
В эксперименте использовали 120 беспородных крыс-самцов массой 180 — 220 г. Для определения состояния процессов свободнорадикального окисления в период реакции отмены этанола применяли модель экспериментального алкоголизма, разработанную А. Х Абдрашитовым и соавт. (1987) [6]. Определение показателей обмена глутатиона проводили через одни сутки (группа А1), двое (группа А2), трое (группа А3) и пять (группа А5) суток после заключительного введения алкоголя. После измерения латентного периода животные подвергались декапитации под эфирным наркозом.
Содержание восстановленного глутатиона в гомогенатах печени определяли методом Л. БеШак е! а1. [7]. Определение активности глутатионредуктазы (ГР; КФ 1.6.4.2) проводили по методу I. Саг1Ъегд [8]. Активность глутатионпероксидазы (ГПО; КФ 1.11.1.9) определяли по методу Б. Е. РадЦа е! а1. [9]. Глутатион-Б-транферазную активность в гомогенатах печени измеряли по методике Ш. И. ИаЫд [10].
В результате проведенных исследований обнаружено снижение в печени в 2,3 раза (ри<0,05) уровня восстановленного глутатиона на первые сутки синдрома отмены этанола по сравнению с контролем.
Одним из важных параметров, лимитирующих протекание химических реакций, является наличие коферментов. Недостаток восстановленного глута-тиона, выступающего в данной роли для глутатион-Б-трансферазы, вероятно, ограничивает активность данного фермента в первые сутки реакции отмены этанола.
Однако уже во вторые сутки реакции отмены уровень активности глутатион-Б-трансферазы и содержание восстановленного глутатиона возвращается к значениям группы контроля. Статистически значимая положительная связь между исследуемыми параметрами (г = 0,61; р = 0,02) позволяет предположить, что возвращение концентрации восстановленного глутатиона приводит к увеличению глутатион-Б-трансферазной активности.
Следует также отметить происходящее смещение активности восстановленного глутатиона в сторону коферментной функции, по сравнению с первыми сутками реакции отмены этанола, когда, вероятно, вся свободнорадикальная защита осуществлялась данным серосодержащим трипептидом.
На пятые сутки развития реакции отмены этанола отмечается только увеличение на 14 % (ри<0,05) активности глутатионпероксидазы.
Таким образом, результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о нарушениях в системе обмена глутатиона, являющегося связующим компонентом между частями антиокислительной
системы, что, вероятно, обусловливает активацию свободнорадикального окисления в условиях моделирования алкогольной зависимости.
Весьма вероятно, что такое изменение окислительного статуса может играть важную роль в развитии поражений различных органов и систем организма при алкогольной интоксикации. В этом аспекте актуальность исследования состояния системы глутатиона при сочетании алкоголизма с другими заболеваниями, сопровождающимися возникновением окислительного стресса, достаточно высока.
Одним из распространенных заболеваний, при развитии которых отмечается развитие окислительного стресса, является сахарный диабет.
По данным П. И. Сидорова [11], хроническая алкогольная интоксикация сопутствует сахарному диабету, по крайней мере, у 8,3 % больных.
Учитывая, что основным местом синтеза восстановленного глутатиона и метаболизма этанола является печень, а также общность эмбрионального происхождения поджелудочной железы и печени необходимо установление молекулярных механизмов влияния алкоголизации на развитие окислительного стресса при сахарном диабете.
Для этого нами было проведено экспериментальное исследование состояние обмена глутатиона в печени при алкоголизации на фоне сахарного диабета.
Исследование выполнено на 228 самцах белых лабораторных крыс массой 180 — 220 г. Сахарный диабет моделировали интраперитонеальным введением 160 мг/кг аллоксана тетрагидрата. Алкоголизацию вызывали внутрибрюшинным введением 20 % раствора этанола в дозе 2 г/кг, что составляло около 1/4 DL50. Животные были разделены на 4 группы. В первую группу (К) вошли животные, получавшие по 1 мл 0,9 % раствора NaCl, во вторую (А) — животные, которым вводили алкоголь, третью (СД) составили крысы с явным хроническим СД, четвертую (СДА) — крысы с явным хроническим СД, которым вводили алкоголь. Животные группы сравнения (СД) получали вместо алкоголя 0,9 % раствор NaCl. Через 24 ч после последнего воздействия животных декапи-тировали, выделяли надмитохондриальную (супернатант) и митохондриальную фракции ткани печени.
В супернатанте гомогенатов ткани печени определяли активность глутатионпероксидазы, глутатион-трансферазы, активность у-глутамилтрансферазы — стандартным набором фирмы Human (Германия). В цельных гомогенатах ткани печени определяли концентрацию восстановленного глутатиона и количество доступных тиогрупп по методу J. Sedlak (1968).
Результаты исследований свидетельствуют о том, что при изолированной алкоголизации отмечается повышение содержания восстановленного глутатиона через 1 сутки на 45,1 % (р = 0,003) и 7 суток на 27,1 % (р = 0,025), снижение через 3 суток в 2,5 раза (р<0,001). Введение алкоголя на фоне сахарного диабета также сопровождалось увеличением уровня восстановленного глутатиона в ткани печени, через трое суток выше на 40,8 % (р = 0,001) по отношению к группе СД.
Содержание низкомолекулярных тиолов в клетке зависит также от активности глутатион-зависимых ферментов. Через сутки после введения алкоголя при отсутствии фонового состояния регистрируется низкая активность цитозольной глутатионперокси-дазы печени (на 7,4 % ниже контрольной группы, р = 0,011). При алкоголизации на фоне сахарного диабета наблюдается более ранняя индукция ферментов метаболизма глутатиона: глутатионперокси-
дазы печени через сутки, глутатион-Б-трансферазы печени через трое суток, что может быть связано с быстрым прогрессированием окислительного стресса.
В результате у животных группы СДА происходит срыв адаптации и падение активности глутатион-зависимой системы антиоксидантных ферментов печени: глутатион-Б-трансферазы на 26,2 % (р <0,001) через семь суток, глутатионпероксидазы печени на 22,3 % (р = 0,041) через 14 суток, относительно группы СД.
При изолированной алкоголизации достоверного изменения содержания доступных тиолов за исследуемый период не отмечалось. Прогрессирование окислительного стресса в печени при алкоголизации на фоне сахарного диабета приводит к резкому сокращению доступных тиогрупп, вследствие их окисления (на 16,5 %; р = 0,021, относительно группы СД).
Таким образом, алкоголизация на фоне сахарного диабета приводит к стремительному прогрессированию окислительного стресса в печени. Представленные данные показывают, что сахарный диабет как фоновое состояние при развитии алкоголь-индуцирован-ного свободнорадикального повреждения печени существенно влияет на динамику развития адаптационного синдрома. В результате при длительной алкоголизации на фоне сахарного диабета отсутствует адекватный ответ антиоксидантной системы на усугубление свободнорадикальных нарушений.
Поражение сердечно-сосудистой системы является основной причиной снижения трудоспособности и сокращения продолжительности жизни больных сахарным диабетом типа 2 [12]. При сахарном диабете гиперпродукция свободных радикалов также является одним из важных факторов поражения сердца.
В предупреждении окислительного стресса в сердце одна из ведущих ролей принадлежит глу-татионовой системе, что обусловлено синергизмом работы глутатион-зависимых энзимов, участием в регенерации ряда низкомолекулярных антиоксидантов и способностью восстановленного глутатиона путем прямого взаимодействия нейтрализовать активные кислородные интермедиаты.
Для установления особенностей нарушений и патогенетической роли изменения обмена глутатиона и свободнорадикальных процессов в сердце при сочетании сахарного диабета с хронической алкогольной интоксикацией нами было проведено исследование уровня восстановленного глутатиона и определение активности ферментов системы обмена глутатиона в сердце при различных вариантах сочетания хронической алкогольной интоксикации с сахарным диабетом.
В работе использовали плазму крови и ткань сердца половозрелых белых беспородных крыс-сам-цов массой 220 — 240 г. По завершении эксперимента крыс подвергали эвтаназии путем цервикальной дислокации.
Для формирования алкогольной интоксикации использовали модель, предложенную С. Са8еа1е8 е! а1. (1983), согласно которой в качестве единственного источника жидкости служил этанол в концентрации 150 мл/л в течение двух месяцев (группа Ап, п = 23) и четырех месяцев (группа Аш, п = 21). С целью оценки постинтоксикационных эффектов этанола моделировали алкогольную интоксикацию в течение двух месяцев с последующей двухмесячной отменой алкоголя (группа А1, п = 21). Суточное потребление алкоголя (в пересчёте на абсолютный этанол) составляло 5,35±0,27 мл.кг-1.
Сахарный диабет (группа СД, n = 20) у животных моделировали по методике предложенной F. Zhang et al., согласно которой животных содержали на специальной диете с высоким содержанием жира (зоостеролов) в течение двух месяцев, после этого однократно вводили раствор стрептозотоцина, приготовленный на 0,05 М цитратном буфере (рН = 4,5) в дозе 15 мг/кг массы тела. Интактным животным (группа КГ, n = 25) вводили аналогичный объем 0,05 М цитратного буфера (рН = 4,5). Для подтверждения формирования сахарного диабета у животных определяли на вторые сутки после введения стрептозо-тоцина уровень глюкозы крови натощак.
Учитывая зависимость течения сахарного диабета от формы потребления алкоголя, а также индивидуально-типологические паттерны поведения в критических ситуациях, использовали различные варианты сочетания сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации. Были созданы экспериментальные условия, при которых алкоголизацию крыс осуществляли в двухмесячном периоде, который прекращали после введения стрептозотоцина (группа СД-А1, n = 20). Для выяснения характера воздействия алкоголя на изучаемые процессы при уже сформированном сахарном диабете моделировали двухмесячную интоксикацию этанолом на вторые сутки после введения стрептозотоцина (группа СД-АП, n = 23). Также моделировали сочетание, при котором хроническая алкогольная интоксикация в течение двух месяцев проводилась до возникновения сахарного диабета и продолжающаяся в последующие два месяца после его начала (группа СД-АШ, n = 22). Учитывая развитие при сахарном диабете полидипсии, концентрация этанола в водном растворе была уменьшена в три раза. Всех животных содержали на стандартном сухом твердом корме. Питание и жидкость были доступны ad libitum. Для биохимических исследований использовали супернатант гомогенатов сердца и плазму крови.
В нашем исследовании обнаружено статистически значимое, по отношению к КГ, уменьшение уровня восстановленного глутатиона как в группах с изолированным течением алкогольной интоксикации на 48 % (pU0<0,001) и 33% (pU0<0,001), для групп Апи Аш, соответственно, так и в группе СД — на 47 % (pU0<0,001). В большой степени уменьшение уровня восстановленного глутатиона, в сравнении с КГ, выявлено в группах СД-А1, СД-АП и СД-АШ на 53 (pU0<0,001), 65 (pU0<0,001) и 69 % (pU0<0,001) соответственно.
В группах СД-АП и СД-АШ содержание восстановленного глутатиона было статистически значимо ниже, чем у представителей с изолированным стреп-тозотоцин-индуцированным сахарным диабетом, соответственно, на 34 (pUoa,=0,003) и 41 % (pUQa,<0,001).
Полученные данные свидетельствуют о том, что как при изолированном течении хронической алкогольной интоксикации и сахарного диабета, так и при их различных вариантах сочетания наблюдается уменьшение основного компонента глутатионо-вой антиоксидантной системы, принимающей наиболее значительное участие в антиокислительной защите сердца.
При анализе активности глутатионпероксидазы в сердце нами выявлено статистически значимое снижение по отношению не только к КГ, но и к группе СД, вне зависимости от типа сочетания хронической алкогольной интоксикации и сахарного диабета.
Таким образом, при сочетании хронической алкогольной интоксикации и сахарного диабета в сердце
ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК № 1 (104) 2011 МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ
МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК № 1 (104) 2011
отмечается более выраженная интенсификация процессов свободнорадикального окисления, чем при изолированном течении хронической алкогольной интоксикации и сахарного диабета. Подобные изменения могут быть обусловлены значительным уменьшением уровня восстановленного глутатиона и снижением эффективности ферментативных глутатион-зависимых механизмов антиокислительной защиты сердца при хронической алкогольной интоксикации в сочетании с сахарным диабетом.
В представленных вариантах сочетания хронической алкогольной интоксикации и экспериментального сахарного диабета отмечается более выраженное проявление окислительного стресса в сердце. Это обусловлено, вероятно, не только простой суммацией эффектов сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации, а качественными изменениями функционирования антиокислительной глутатионовой системы, возникающими при их сочетании.
В целом при моделировании состояния отмены этанола, в условиях алкогольной абстиненции, а также при сочетании алкоголизма с сахарным диабетом наблюдается ограничение защитного потенциала глутатионового звена антиокислительной системы.
Библиографический список
1. Владимиров, Ю. А. Свободные радикалы и антиоксиданты / Ю. А. Владимиров // Вестник РАМН. — 1998. — № 7. — С. 43-51.
2. Role of oxidative stress, endoplasmic reticulum stress, and c-Jun N-terminal kinase in pancreatic beta-cell dysfunction and insulin resistance / Y. Kaneto [et al.] // Int. J. Biochem. Cell Biol. - 2006. - Vol. 38, № 5-6. - Р. 782-793.
3. Свободнорадикальное окисление и старение / В. Х. Ха-винсон [и др.]. - СПб. : Наука, 2003. - 327 c.
4. Alcohol-induced oxidative stress in rat liver / O. Koch [etal.] // Xenobiotica. - 1991. - Vol. 21, № 8. - P. 1077-1084.
5. Мазо, В. К. Глутатион как компонент антиоксидантной системы желудочно-кишечного тракта / В. К. Мазо // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 1998. - № 1. -С. 47-52.
6. Успенский, А. Е. Степень анальгезии как показатель выраженности синдрома отмены этанола в эксперименте / А. Е. Успенский, В. П. Нужный, А. Х. Абдрашитов // Мед. биол пробл алкоголизма : материалы Всесоюз. научн. конф. -Воронеж, 1987. - С. 85-89.
7. Sedlak, J. Estimation of Total, Protein-Bound and Nonprotein Sulfhydryl Groups in Tissue With Ellmans Reagent / J. Sedlak, R. H. Lindsey // Analyt. Biochem. - 1968. - Vol. 25, № 2. -P. 192-205.
8. Carlberg, I. Glutatione reductase / I. Carlberg, B. Manner-vik // Mol. Enzimol. - 1985. - № 113. - P. 484-490.
9. Paglia, D. E. Stadies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase / D. E. Pag-lia, W. N. Valentine // J. Clin. Lab. Med. - 1967. - №. 70. -P. 158-169.
10. Habig, W. H. Glutathione-S-transferases. The first step in mercapturic acid formation / W. H. Habig, M. J. Pabst, W. B. Jacoby // J. Biol. Chem. - 1974. - Vol. 249, № 22. - P. 7130-7139.
11. Сидоров, П. И. Форма потребления алкоголя и течение сахарного диабета / П. И. Сидоров, А. Г. Соловьев, И. А. Новикова // Наркология. - 2002. - № 5. - С. 28-33.
12. Wright, JR. E. Oxidative stress in type 2 diabetes: the role of fasting and postprandial glycaemia / JR. E. Wright, J. L. Scism-Bacon, L. Glass // Int. J. Clin. Pract. - 2006. - Vol. 3. -P. 308-314.
ВЫСОКОГОРСКИЙ Валерий Евгеньевич, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой биохимии и лабораторной медицины с курсом клинической лабораторной диагностики последипломного образования (ПДО).
ЕФРЕМЕНКО Евгений Сергеевич, кандидат медицинских наук, доцент кафедры биохимии и лабораторной медицины с курсом клинической лабораторной диагностики ПДО.
БЫКОВ Денис Евгеньевич, ассистент кафедры биохимии и лабораторной медицины с курсом клинической лабораторной диагностики ПДО.
ЖУКОВА Ольга Юрьевна, кандидат медицинских наук, ассистент кафедры биохимии и лабораторной медицины с курсом клинической лабораторной диагностики ПДО.
ЛОПУХОВ Геннадий Алексеевич, кандидат медицинских наук, доцент кафедры биохимии и лабораторной медицины с курсом клинической лабораторной диагностики ПДО.
Адрес для переписки: e-mail: efremenko-online@ mail.ru
Статья поступила в редакцию 18.08.2010 г.
© В. Е. Высокогорский, Е. С. Ефременко, Д. Е. Быков,
О. Ю. Жукова, Г. А. Лопухов
Книжная полка
Правда о прививках. - М. : Альфа-Пресс, 2010. - 40 с.
Вакцины существуют чуть более двух веков, и все это время не утихают споры об эффективности и безвредности их применения. При этом в нашей стране сложилась преступная традиция вакцинировать «всех подряд, из-за удобства с организационной точки зрения», что приводит к плачевным результатам, когда 80 — 85 % детей, заболевших дифтерией, оказываются «правильно и своевременно» привитыми. Туберкулез тоже не хочет «ликвидироваться», несмотря на противоправную медицинскую помощь, оказываемую в роддомах нашим младенцам посредством БЦЖ-вакцины в первые дни их жизни. Особую тревогу вызывают факты, свидетельствующие о проводимых на наших детях «широкомасштабных испытаниях безопасности» новых вакцин под благовидным предлогом «календарных прививок». В данном издании рассказывается о том, что на самом деле стоит за вакцинацией населения и безопасны ли прививки для детей.
