CC BY
9
УДК 578.834.11
Е.В. АГАФОНОВА1- 2, И.Д. РЕШЕТНИКОВА1- 3, Л.Т. БАЯЗИТОВА1- 2, Е.В. ХАЛДЕЕВА1, Ю.А. ТЮРИН1- 2, Г.Ш. ИСАЕВА1- 2
1Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии, г. Казань 2Казанский государственный медицинский университет, г. Казань 3Казанский (Приволжский) федеральный университет, г. Казань
Нарушение антимикробных стратегий нейтрофила на уровне мукозального иммунитета у реконвалесцентов COVID-19
Контактная информация
Агафонова Елена Валентиновна — к.м.н., врач клинической лабораторной диагностики, ассистент кафедры пропедевтики детских болезней Адрес: 420015, г. Казань, ул. Большая Красная, 67, тел.: +7-917-876-16-44, e-mail: [email protected]
Антимикробным стратегиям нейтрофилов принадлежит ведущая роль в регуляции микробиоценозов. У реконвалесцентов COVID 19 оценивали состояние микробиоты верхних дыхательных путей и ротоглотки, функционально-метаболическую активность нейтрофилов cuстемы MALT. Изменения в составе микробиоты характеризовались двумя направлениями — повышением колонизации бактериальными и грибковыми патогенами — Staphylococcus aureus, Candida albicans, энтеробактериями (Escherichia coli, Klebsiella spp.) и нарастанием микст-инфицирования, в первую очередь 2-компонент-ными ассоциациями Staphylococcus aureus + Candida albicans. Нейтрофилы у реконвалесцентов COVID 19 характеризовались усилением деструктивных и апоптотических внутриклеточных процессов, а также нарушенными антимикробными стратегиями — угнетением кислородзависимой биоцидности, быстрой истощаемостью резервных возможностей, незавершенным фагоцитозом, ограниченной способность к захвату и киллингу патогенов, что определяет усиление колонизации патогенами и нарастание микст-инфицирования.
Ключевые слова: COVID-19 инфекция, нейтрофил, микробиота, антимикробная стратегия.
(Для цитирования: Агафонова Е.В., Решетникова И.Д., Баязитова Л.Т., Халдеева Е.В., Тюрин Ю.А., Исаева Г.Ш. Нарушение антимикробных стратегий нейтрофила на уровне мукозального иммунитета у реконвалесцентов COVID-19. Практическая медицина. 2022. Т. 20, № 7, С. 122-130)
DOI: 10.32000/2072-1757-2022-7-122-130
E.V. AGAFONOVA1-2- I.D. RESHETNIKOVA1-3- L.T. BAYAZITOVA1-2- E.V. KHALDEYEVA1- YU.A. TYURIN1-2-G.SH. ISAYEVA1-2
1Kazan Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Kazan 2Kazan State Medical University, Kazan 3Kazan (Volga) Federal University, Kazan
Violation of antimicrobial strategies of neutrophils at the level of mucosal immunity in COVID-19 convalescents
Contact details:
Agafonova E.V. — PhD (medicine), laboratory diagnostics doctor, Assistant Lecturer of the Department of Propedeutics of Children's Diseases Address: 67 Bolshaya Krasnaya St., Kazan, Russian Federation, 420015, tel.: +7-917-876-16-44, e-mail: [email protected]
Antimicrobial strategies of neutrophils play a leading role in the regulation of microbiocenoses. In COVID-19 convalescents, the state of upper respiratory tract and oropharynx microbiota and the functional and the metabolic activity of the MALT system neutrophils were evaluated. Changes in the microbiota composition were characterized by two directions — an increase in colonization by bacterial and fungal pathogens — Staphylococcus aureus, Candida albicans, enterobacteria (Escherichia coli, Klebsiella spp.) and an increase
in mixed infection, primarily by 2-component associations of Staphylococcus aureus + Candida albicans. Neutrophils in COVID-19 convalescents were characterized by increased destructive and apoptotic intracellular processes, as well as impaired antimicrobial strategies — inhibition of oxygen-dependent biocidity, rapid depletion of reserve capabilities, incomplete phagocytosis, limited ability to capture and kill pathogens, which determines increased colonization by pathogens and an increase in mixed infection.
Key words: COVID-19 infection, neutrophil, microbiota, antimicrobial strategy.
(For citation: Agafonova E.V., Reshetnikova I.D., Bayazitova L.T., Khaldeyeva E.V., Tyurin Yu.A., Isayeva G.Sh. Violation of antimicrobial strategies of neutrophils at the level of mucosal immunity in COVID-19 convalescents. Practical medicine. 2022. Vol. 20, № 7, P. 122-130)
Всемирная пандемия COVID-19 стала глобальной угрозой для человечества. Течение COVID-19 имеет крайне широкую вариабельность — от бессимптомных форм до тяжелых, с клиническими осложнениями и неблагоприятными исходами [1, 2]. Система мукозального иммунитета слизистых оболочек дыхательных путей (СОДП), являясь основным плацдармом для внедрения и репликации SARS-CoV-2, подвергается массивному цитопатогенному воздействию. Репликация вируса SARS-CoV-2 на уровне клеточной составляющей мукозального иммунитета [3] может вызывать высокий уровень деструкции и связанного с вирусом апоптоза — воспалительной формой запрограммированной гибели клеток, которая обычно наблюдается при цитопатической вирусной инфекции [4]. Массивное цитопатогенное действие, цитокиновые дисбалансы, воспалительная инфильтрация клеток на уровне локального мукозального иммунитета может привести к резким повреждениям клеточных структур через чрезмерную секрецию протеаз и активных форм кислорода в дополнение к прямому повреждению, вызванному вирусом [5-7]. С иммунными дисфункциями мукозального иммунитета при SARS-CoV-2 ассоциированы резкие нарушения на уровне микробиома [8]. При исследовании метатранскриптомов верхних и нижних дыхательных путей пациентов с cOvID-19 показано изменение представительства разных видов патогенов, уменьшение разнообразия микроорганизмов и паттернов экспрессии генов врожденного иммунитета. В единичных исследованиях продемонстрировано, что в когорте пациентов с COVю-19 состав микробиоты характеризовался истощением бактерий с иммуномодулирующим потенциалом [9]. Показано, что у пациентов с наличием SARS-CoV-2, находящихся в отделениях интенсивной терапии, бактериальная коинфекция развивалась в 3,5 раза чаще, чем у больных, получающих лечение в других общих отделениях [10]. Нейтро-филам (Ы) и их секреторным продуктам принадлежит ведущая роль в регуляции микробиоценоза СОДП. Наряду с эпителиальными клетками, микрофлорой и другими факторами неспецифической защиты они участвуют в формировании колонизационной резистентности слизистых [11]. N обладают селективной бактерицидностью — подавляют рост условно-патогенной флоры и не влияют на резидентные бактерии биотопов, участвуя в регуляции измененного микробиоценоза [12, 13]. Состояние мукозального иммунитета и ассоциированные с ним изменения микробиома СОДП приобретают особое значение в период реконвалесценции COVID-19 в связи с тем, что антигенная нагрузка при эскалации вирусных и бактериальных патогенов и подавляющее большинство иммунных ответов происходят
именно в барьерных тканях, и в частности в системе мукозо-ассоциированной лимфоидной ткани (МАЛТ). Антимикробные стратегии N на уровне системы МАЛТ могут непосредственно влиять на формирование нарушений микробиоценоза верхних дыхательных путей у реконвалесцентов COVID-19.
Цель исследования — оценить функционально-метаболическую активность N и их влияние на состояние микробиоты СОДП у реконвалесцентов COVID-19.
Материал и методы
У реконвалесцентов COVID 19 было проведено изучение показателей мукозального иммунитета и состояние микробиоты верхних дыхательных путей (ВДП) и ротоглотки через 1,5-2 месяца после перенесенной инфекции (n = 74). На каждого ре-конвалесцента заполнялась анкета, в которой были отражены клинические симптомы COVID-19 и проводилось исследование уровней IgG и IgM к SARS-CoV-2. В работе использовался двухстадийный непрямой вариант твердофазного ИФА (тест-системы SARS-CoV-2-IgG^OA^ECT, SARS-CoV-2-Ig М-ИФА-БЕСТ). Критериями включения в исследование были симптомы перенесенного COVID-19 по данным анамнеза (температуры тела, сухой кашель с небольшим количеством мокроты, боли в мышцах, утомляемость, одышка, ощущение заложенности в груди), наличие положительных результатов ПЦР (по данным анамнеза) и/или уровней специфических IgGк SARS-CoV-2 в сыворотке крови в период проведения исследований. В группе сравнения обследованы волонтеры, у которых данные анамнеза и иммунологического обследования были отрицательными по COVID-19 (n = 33). Бактериологическое исследование микробиоты носоглотки и ротоглотки проводи с использованием питательных сред Агар Columbia с добавлением 5% крови, Эндо, Сабуро и хромогенных сред. Идентификацию микроорганизмов проводили на основании фенотипи-ческих свойств согласно нормативным документам (Приказ № 535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений»). Оценивали резидентную популяцию N на СОВДП и функционально-метаболическую активность, эвакуируемых в полость носа [14] из сосудистого русла. В популяции резидентных N выделяли клетки с различными классами деструкции (n0, n1, n2, n3, n4), при этом как n0 рассматривали клетки без признаков деструкции; n1, n2 — клетки с минимальными и выраженными признаками деструкции цитоплазмы; n3, n4 — клетки с выраженными приз-
наками деструкции цитоплазмы и минимальными и выраженными признаками деструкции ядра. Рассчитывали индекс деструкции клетки (ИДК = n1 + n2 + n3 + n4 / 100), средний показатель деструкции (СПД = п1х1 + п2х2 + п3х3 + п4х4) и индекс цитолиза клеток (ИЦК = 4 / n1 + n2 + n3 + n4), где n0, n1, n2, n3, n4 — номера классов деструкции. Фагоцитарную активность резидентных (N клеточной стенки) в отношении аутофлоры оценивали с помощью показателей ФАН 1 — процент фагоцитирующих N и ФАН 2 — процент деструктурированных N, в цитоплазме которых сохранялись целые микроорганизмы, что является показателем незавершенности фагоцитоза. Для определения апоптоза N ^а) нами применялось исследование методом световой микроскопии мазков-отпечатков, окрашенных по Романовскому — Гимзе. Данный метод преимущественно позволяет выявлять реализацию апоптоза по уменьшению размеров, конденсированной цитоплазме, уплотненному бесструктурному хроматину, часто разделенному на несколько округлых телец. Интегральные показатели, характеризующие фагоцитарную активность N, эвакуируемых в назальный секрет, исследовали на классической модели с использованием микробной взвеси Staphylococcus aureus (S. aureus) (лабораторный штамм в изотоническом растворе с концентрацией 2 х 106/мл). Оценивали фагоцитарный индекс (ФИ) — процент «активных» лейкоцитов, захвативших микробы, фагоцитарное число (ФЧ) — среднее количество микробов, поглощенных одним N. ^особность к киллингу патогенов оценивали по проценту переваривания (% П) — отношению числа убитых бактерий к общему числу фагоцитированных бактерий и индексу переваривания (ИП) — среднему числу убитых бактерий на один посчитанный N. Исследование внутриклеточного кислородзави-симого метаболизма N, эвакуируемых в секрет, проводили, используя НСТ-тест. В исследовании определяли способность N отвечать повышением метаболической активностью на стимуляцию зи-мозаном (Sigma, США). Исследование содержания в назальном секрете мембранного маркера апоп-тоза — sCD95 (sAPO-1/FAS) осуществляли посредством иммуноферментного анализа (ELISA) c использованием коммерческих наборов Human sAPO-1/FAS ELISA (Bender MedSystems GmbH, Austria).
Для статистической обработки полученных данных использовали программу Биостатистика 4.03 для Windows. Нормальность распределения признака определяли с помощью критерия Колмогорова — Смирнова. Рассчитывали значения среднего арифметического, ошибки среднего значения, а также рассчитывали минимальное и максимальное значение для ненормально и несимметрично распределенных параметров. Сравнительный анализ основывался на определении статистической значимости показателей по t-критерию Стьюдента для параметрических и по U-критерию Манна — Уитни для непараметрических показателей. Критический уровень статистической значимости (р) при проверке статистических гипотез в исследовании принимали равным 0,05. Степень взаимосвязи между признаками оценивали, вычисляя коэффициент ранговой корреляции Спирмена.
Результаты
При сравнительном анализе микрофлоры у ре-конвалесцентов COVID-19 и группы сравнения не-
обходимо отметить, что уровень колонизации бактериальными патогенами выше в группе пациентов, перенесших новую коронавирусную инфекцию. Изменения в составе микробиоты характеризуются двумя направлениями — повышением колонизации бактериальными и грибковыми патогенами и нарастанием микст-инфицирования (табл. 1). В группе реконвалесцентов COVID-19 бактериальные и грибковые возбудители были выявлены в 67,6%, в группе сравнения — в 48,5% (p < 0,05). По сравнению с группой контроля статистически достоверные результаты получены для S. aureus (35,1; 9,1%), грибов рода Candida (29,7; 12,1%, p < 0,05), группы энтеробактерий (16,2; 6,1%, p < 0,05). S. aureus у реконвалесцентов cOviD-19 был выявлен в 35,7%, в контрольной группе — в 9,1% (p < 0,05). Высокая степень колонизации (104-6 КОЕ/мл) регистрировалась в 76,9%, низкая и умеренная (102-3 КОЕ/мл) — в 23,1% случаев. В группе реконвалесцентов COVID-19 S. aureus в 66,7% регистрировался в низких (p < 0,05), в 33,3% — в высоких титрах (p < 0,05). S. aureus в монокультуре у реконвалесцентов COVID-19 выявлен у 42,3%, в группе контроля — в 66,7% (p < 0,05). Микробные ассоциации (S. aureus + другой патоген) регистрировались в 57,7% (в группе контроля — в 33,3%, p < 0,05). 2-компонентные ассоциации были представлены S. aureus + Candida albicans — в 38,5%, S. aureus + Klebsiella spp. — в 7,8%, S. aureus + Streptococcus pyоgenes в — 7,8%, 3-компонентные микробные ассоциации (S. Aureus + Klebsiella spp. + Candida albicans) у реконвалесцентов COVID-19 регистрировались в 15,4%. В группе контроля S. aureus в монокультуре выявлен у 66,6% (p < 0,05),
2-компонентные микробные ассоциации — в 33,3% (p < 0,05), 3-компонентные микробные ассоциации не выявлялись. Грибы рода Candida у реконвалес-центов COVID-19 выявлены в 29,7%, в группе контроля — у 12,1% (p < 0,05), в видовом составе в 100% выделялись Candida albicans. В высоких титрах (104-5 КОЕ/мл) Candida albicans регистрировалась в 72,7%, в низких титрах (102-3 КОЕ/мл) — в 27,3% случаев. В монокультуре Candida albicans регистрировалась в 36,4% (в группе контроля — в 12,1%; p < 0,05), в ассоциациях — Candida albicans + другие патогены у реконвалесцентов COVID-19 — в 63,6%. У реконвалесцентов COVID-19 2-компо-нентные грибково-микробные ассоциации были представлены Candida albicans + S. aureus в 45,5%; Candida albicans + Streptococcus pyogenes — в 9,1%,
3-компонентные микробные ассоциации Candida albicans + S. aureus + Klebsiella spp. — в 18,2%. Микст-инвазии в группе контроля были представлены 2-компонентными микробными ассоциациями (Candida albicans + S. aureus) в 6,1%. Граммотри-цательные патогены Klebsiella spp., Escherichia coli у реконвалесцентов COVID-19 выявлены в 17,8%, в группе контроля — у 6,1% (p < 0,05). Моноинфицирование Klebsiella spp. регистрировалось в 16,6%, Escherichia coli — в 33,3%, коинфициро-вание 2-компонентными микробными ассоциации (Escherichia coli + St. pyogenes) — в 33,3%, 3-ком-понентными Klebsiella spp. + S. Aureus + Candida albicans — в 33,3%. Таким образом, нами показано, что у реконвалесцентов COVID-19 значимое место занимает колонизация 2- и 3-компонентными микст-патогенами, среди которых наиболее часто встречается S. aureus и Candida albicans. Нарастание у реконвалесцентов COVID-19 данной комбинации
вызывает особую тревогу. По данным литературы, в двухвидовой культуре S. aureus и Candida albicans показано наличие синергетических патогенных взаимодействий — усиление пролиферации S. aureus, образование биопленок, нарастание лекарственной устойчивости. По данным транскриптомного анализа бивидовой культуры, фактора вирулентности S. aureus, нарастала экспрессия генов устойчивости к бета-лактамам и ванкомицину, а у Candida albicans — гены устойчивости к азолу [15].
N и их секреторные продукты обладают широким спектром антимикробных факторов и оказывают регулирующее и нормализующее влияние на состав флоры слизистых оболочек, участвуя в селективной деконтаминации биотопов [13]. У реконвалесцен-тов COVID-19 отмечено существенное усиление деструктивных и апоптотических процессов (табл. 2) в N — содержание n1 нарастало в 1,9 (p < 0,05), n2 — в 2,5 (p < 0,05), n3 — в 3,8 (p < 0,05), n4 — в 2,4 (p < 0,05) раза, ИДК увеличивался в 2,3 (p < 0,001), СПД — в 2,6 (p < 0,05), ИЦК в 2 (p < 0,05)
раза. В популяции N отмечено нарастание содержания Ыа (11,1%; р < 0,05). На уровне Ы, эвакуируемых в назальные секреты, отмечалось снижение содержания «активных» N (ФИ — 22,7%; р < 0,05), объема захваченного патогена (ФЧ — 2,71; р < 0,05). Регистрировалось угнетение процессов киллинга патогенов — снижение % П (2,8%; р < 0,05) и ИП (0,3%; р < 0,05). Отмечалось резкое угнетение как спонтанной (6,91%; р < 0,001), так и индуцированной внутриклеточной бицидности Ы, «эвакуируемых» в носовую полость (33,9%; р < 0,001). В назальном секрете реконва-лесцентов СОУЮ-19, по сравнению с группой здоровых доноров, регистрировалось увеличением содержание мембранного маркера апоптоза — sCD95 (sAPO-1/FAS) (79,7 пг/мл; р < 0,05). Выявлены корреляции уровня sAPO-1/FAS с Ыа (г = 0,47; р < 0,05). Индукция процессов апоптоза у реконвалес-центов СОУЮ-19 на уровне мукозального иммунитета определяется дисрегуляцией, опосредованной TNF-a и Fas-рецепторами [16, 17].
Таблица 1. Некоторые представители микробиоты верхних дыхательных путей и ротоглотки у реконвалесцентов COVID-19
Table 1. Some representatives of the microbiota of the upper respiratory tract and oropharynx in COVID-19 convalescents
Группы микроорганизмов Реконвалесценты COVID-19 n = 74 Me (Q1;Q3) Группа сравнения n = 33 Me (Q1;Q3) р
Абс. % Абс. %
Staphylococcus aureus 26 35,1 (0,7; 25,6) 3 9,1 (1,5; 6,7) p < 0,05
Гр (+) бактерии Коагулазо- негативные стафилококки 2 3,5 (0,4; 2,0) 1 3,0 (1,6; 2,0) p > 0,05
Streptococcus pyogenes 5 16,2 (5,0; 12,8) 4 12,1 (2,8; 13,0) p > 0,05
Streptococcus pneumoniae 4 5,4 (1,7; 14,3) 2 6,1 (0,9; 2,5) p > 0,05
Бактерии семейства Escherichia coli 6 8,1 (2,5: 6,0) 1 3,0 (0,3; 2,6) p < 0,05
Enterobacteriaceae Klebsiella spp. 6 8,1 (3,7; 5,8) 1 3,0 (0,3; 2,2) p < 0,05
Неферментирующие грамотрицательные бактерии Pseudomonas aeruginosa 2 3,5 (1,9; 2,8) 1 3,0 (0,6; 4,6) p > 0,05
Грибы рода Candida Candida albicans 22 18,9 (1,3; 2,7) 4 12,1 (1,3; 6,7) p < 0,05
Всего 74 100% 33 100%
Примечание: статистическая значимость в сравниваемых группах (реконвалесценты и группа сравнения) оценивалась по U-критерию Манна — Уитни при p < 0,05.
Note: statistical significance in the compared groups (convalescents and comparison group) was assessed with the U-criterion of the Mann — Whitney test at p < 0,05.
Таблица 2. Маркеры деструкции и апоптоза, показатели функциональной активности нейтрофилов системы МАиГ у реконвалесцентов COVID-19
Table 2. Markers of destruction and apoptosis, indicators of functional activity of the MALT system neutrophils in COVID-19 convalescents
Показатель Реконвалесценты COVID-19 (n = 74); М (SD) Группа сравнения (n = 33); М (SD)
n0; % 24,1 (3,2)* 65,0 (7,3)
n1; % 32,4 (3,9)* 18,3 (1,5)
n2; % 21, 4 (2,8)* 9,1 (1,5)
n3;% 16,2 (3,2)* 4,6 (0,5)
n4;% 5,9 (0,9)* 2,8 (0,2)
na;% 11,1 (0,9) * 2,8 (0,2)
ИД 0,4 (0,05) * 0,19(0,1)
СПД 0,9 (0,06) * 0,3 (0,5)
ИЦ 0,06 (0,02) * 0,03 (0,01)
ФАН 1 18,7 (1,3) 19,9 (2,1)
ФАН 2 1,5 (0,6) 1,6 (0,02)
ФИ 22,7 (1,8) * 67,6 (5,2)
ФЧ 2,7 (0,8 * 7,6 (0,8)
ИП 45,3 (0,3)* 67,6 (5,2)
% П 3,8 (0,4)* 8,8 (0,8)
НСТ спонт.; % 6,91 (0,5)* 17,6 (0,2)
НСТ стим., % 33,9 (2,8)* 78,2 (6,2)
Примечание: * — статистическая значимость определена по парному t-критерию Стьюдента, p < 0,05. Note: * — statistical significance was assessed with the paired t-criterion of the Student test at p < 0,05.
Исследования взаимосвязей между показателями, характеризующими деструктивные и функционально-метаболические нарушения на уровне N СОДП нами проводились для S. aureus, Candida albicans, граммотрицательных патогенов (Klebsiella spp., Escherichia coli). Выделялись группы 1, 2, 3 с выделением патогенов в монокультуре (доминирующий колонизатор) и группы 1а, 2а, 3а — с выделением патогенов в 2- и 3-компонентных ассоциациях (доминирующий колонизатор при микст-инфицировании). При оценке силы связей между переменными (корреляционный анализ) использо-
вали шкалу Чеддока: от 0 до 0,3 — очень слабая; от 0,3 до 0,5 — слабая; от 0,5 до 0,7 —средняя; от 0,7 до 0,9 — высокая, от 0,9 до 1 — очень высокая. Для интерпретации использовали только значимые корреляции — средние, высокие и очень высокие [18]. В табл. 3 представлены результаты корреляционного анализа между колонизацией патогенами и маркерами деструкции и апоптоза N. Обращало внимание нарастание количества значимых корреляций при микст-инфицировании: группы 1, 1а — 10,13 ^ < 0,05), группы 2, 2а — 9,14 ^ < 0,05), группы 3, 3а — 3,10 ^ < 0,05). При моноинфици-
Таблица 3. Взаимосвязи между маркерами деструкции и апоптоза нейтрофилов системы МАЦГ и некоторыми представителями микробиоты
Table 3. Relationships between markers of destruction and apoptosis of the MALT system neutrophils and some representatives of the microbiota
Показатель Staphylococcus aureus Candida albicans Klebsiella spp., Escherichia coli
Группа 1 Моноинфицирование n = 11 Группа 1a Микробные ассоциации n = 15 Группа 2 Моноинфицирование n = 11 Группа 2a Грибково-бактериальные ассоциации n = 12 Группа 3 Моноинфицирование n = 9 Группа 3а Микробные ассоциации n = 8
Na % -0,61 p < 0,05 -0,82 p < 0,01 -0,59 p < 0,05 -0,78 p < 0,05 -0,61 p < 0,05 -0,67 p < 0,05
sCD95, мкг/мл -0,55 p < 0,05 -0,78 p < 0,01 -0,62 p < 0,05 -0,71 p < 0,05 -0,53 не дост. -0,73 p < 0,05
n1, % -0,47 не дост. -0,42 не дост. -0,43 не дост. -0,37 не дост. -0,33 не дост. -0,32 не дост.
n2, % -0,61 p < 0,05 -0,82 p < 0,01 -0,64 p < 0,05 -0,69 p < 0,05 -0,61 p < 0,05 -0,76 p < 0,05
n3, % -0,64 p < 0,05 0,73 p < 0,01 -0,69 p < 0,05 -0,73 p < 0,01 -0,58 не дост. -0,71 p < 0,05
n4, % 0,61 p < 0,05 0,71 p < 0,01 -0,64 p < 0,05 -0,78 p < 0,01 -0,51 не дост. 0,73 p < 0,05
ИДК -0,67 p < 0,05 -0,47 не дост. -0,67 p < 0,05 0,45 p < 0,05 -0,67 p < 0,05 -0,48 не дост.
СПД -0,65 p < 0,05 -0,44 p < 0,05 -0,65 p < 0,05 0,48 p < 0,05 -0,65 p < 0,05 -0,43 не дост.
ИЦК -0,69 p < 0,05 -0,72 p < 0,05 -0,41 p < 0,05 -0,73 p < 0,05 -0,47 не дост. -0,65 p < 0,05
Примечание: статистическая значимость r Спирмена при p < 0,05. R крит. При n = 8, p < 0,05-0,64; p < 0,01-0,83; r крит. при n = 9, p < 0,60; p < 0,01-0,78; r крит. при n = 11, p < 0,05-0,53; p < 0,01-0,72; r крит. при n = 12, p < 0,05-0,50; p < 0,01-0,71;. R крит. при n = 15, p < 0,05-0,43; p < 0,01-0,62.
Note: statistical significance by Spearman at p < 0.05. R crit. at n = 8 p < 0.05-0.64; p < 0.01 - 0.83; r crit. at n = 9 p < 0.60; p < 0.01 r - 0.78; r crit. at n = 11 p < 0.05-0.53; p < 0.01 - 0.72; r crit. at n = 12, p < 0.05-0.50; p < 0.01-0.71; R crit. at n = 15, p < 0,05-0,43; p < 0,01-0,62.
ровании регистрировались обратные взаимосвязи средней силы между количеством Na и доминирующими колонизаторами — S. aureus (r = -0,61; p < 0,05), Саndida albicans (r = -0,59; p < 0,05), граммотри-цательными патогенами (r = -0,61; p < 0,05). Нарастание силы обратных взаимосвязей между Na и доминирующими колонизаторами отмечалось при микст-инфицировании: в группах 1а — r = -0,82 (p < 0,01), 2а — r = -0,78 (p < 0,01), 3а — r = -0,67 (p < 0,05). Уровень sCD95 при моноинфицировании также коррелировал с доминирующими колонизаторами — регистрировались обратные взаимосвязи средней силы: в группе 1 — с S. Aureus, r = -0,55 (p < 0,05), в группе 2 — с Саndida albicans, r = -0,62 (p < 0,05). Нарастание силы обратных взаимо-
связей между уровнем sCD95 и доминирующими колонизаторами регистрировалось при микст-инфицировании: в группах 1а — r = -0,78 (p < 0,01), 2а — r = -0,71 (p < 0,05), 3а — r = -0,73 (p < 0,05). Таким образом, у реконвалесцентов COVID-19 отмечается нарастание уровня растворимой мембранной молекулы CD95 и содержания Nа, ассоциированных как с моно-, так и микст-инфицированием СОВДП. Деструктивные изменения N, определяющие нарушения функциональной активности, также взаимосвязаны с доминирующими колонизаторами. Обратные корреляции средней силы регистрировались между n2 и S. aureus (r = -0,61; p < 0,05), Саndida albicans (r = -0,64; p < 0,05), граммотрицательными патогенами (r = -0,61; p < 0,05). Также обратные
Также обратные корреляции средней силы регистрировались между субпопуляцией n3 и колонизацией S. aureus — r = -0,64 (p < 0,05) в группе 1, Саndida albicans — r = -0,69 (p < 0,05). Усиление обратных взаимосвязей между n3 и доминирующими колонизаторами отмечалось в группах 1а (r = -0,73; p < 0,01), 2а (r = -0,79; p < 0,01), 3а (r = -0,71; p < 0,05). Корреляции средней силы отмечались между субпопуляцией n4 и уровнем колонизации S. aureus (r = -0,61; p < 0,05) — в группе 1, Саndida albicans (r = -0,64; p < 0,05) — в группе 2. Нарастание силы взаимосвязей между субпопуляцией n4 и доминирующими колонизаторами при микст-инфицировании регистрировалось в группах 1а (r = -0,71; p < 0,01), 2а (r = -0,78; p < 0,01), 3а (r = -0,73; p < 0,05). СПД и ИДК, по данным литературы, отражают преимущественно средние степени деструкции клеток, ИДК — выраженные степени [19]. Для ИДК и СПД преимущественно регистрировались корреляции средней силы в группах 1, 2, 3 — для Staph. aureus (r = -0,67, p < 0,05; r = -0,65, p < 0,05 соответственно), для Саndida albicans (r = -0,67, p < 0,05; r = -0,65 p < 0,05 соответственно), для граммотрицательных патогенов (r = -0,67; p < 0,05; r = -0,65, p < 0,05 соответственно). В группах 1а, 2а, 3а регистрировались корреляции высокой силы для ИЦК с колонизацией S. aureus (r = -0,72; p < 0,01) и Саndida albicans (r = -0,73; p < 0,05).
Таким образом, обращало на себя внимание усиление отрицательных взаимовлияний между маркерами деструкции и апоптоза N при микст-инфицировании патогенами. Показано, что более глубокие деструктивные нарушения, нарастание апоптоза N определяют усиление инфицирования и в первую очередь S. aureus + Саndida albicans у реконвалесцентов COVID-19. По литературным данным, развитие бактериального и вирусного воспаления связано с процессами апоптоза N [20]. Предполагается, что повышенный уровень s-формы мембранной молекулы CD95 является одной из причин слабого иммунного ответа на вирусную инфекцию и, как следствие, ее длительной персистенции в организме [21]. Возможно, именно механизмами апоптоза определяется выявляемая и ожидаемая у реконвалесцентов COVID-19 персистенция различных респираторных вирусов. Кроме того, есть исследования, свидетельствующие о способности некоторых патогенов, особенно при микст-инфицировании, вырабатывать вещества, похожие на естественные активаторы процессов клеточной гибели [22]. Так, одним из механизмов персистиро-вания герпесвируса 4-го типа и вируса Эпштейна — Барра является ко-стимуляция протоонкогенов типа bcl-2; аденовирус и РС синтезирует белок, похожий на bcl-2; хламидии и Toxoplasma gondii, проникая в клетку, делают ее чувствительной к различным медиаторам апоптоза [23, 24].
Для эффективного взаимодействия N с бактериальными и грибковыми патогенами и возбуждения фагоцитоза необходимо предварительное связывание бактерий с опсонинами, которые распознаются специфическими рецепторами. Основными опсо-нинами являются иммуноглобулины и компоненты комплемента, которые связываются как с патогенами, так и специфическими рецепторами (FcR; CR), расположенными на внешней поверхности цито-плазматической мембраны N [12, 13]. Параметры ФИ и ФЧ отражают процессы инициации фагоцита за счет рецепции FcR и CR [12]. В 1, 2 и 3 группах
(табл. 4) установлены обратные корреляции средней силы между ФИ и доминирующими колонизаторами — S. aureus (r = -0,62; p < 0,05), Саndida albicans (r = -0,61; p < 0,05), граммотрицательными патогенами (r = -0,61; p < 0,05). В группах 1а, 2а, 3а отмечается значительное усиление обратных взаимосвязей (r = -0,72, p < 0,05; r = -0,72, p < 0,05; r = -0,88, p < 0,01 ^ответственно). В группах 1а, 2а, 3а установлены обратные корреляции между ФЧ и колонизацией S. aureus (r = -0,72; p < 0,01), Саndida albicans (r = -0,69; p < 0,05), граммотрица-тельными патогенами (r = -0,65; p < 0,05). В нашем исследовании показано, что нарушение рецепции N как представителя мукозального иммунитета определяет колонизацию патогенами при моно- и полиинфицировании. Интегральные показатели % П и ИП в группах 1а, 2а, 3а коррелируют с колонизацией S. aureus (r = -0,62, r = -0,61; p < 0,01, p < 0,01 ^ответственно), Саndida albicans (r = -0,60, 0,67; p < 0,05, p < 0,05 соответсвенно), граммотрица-тельными патогенами (r = -0,65, r = -0,69; p < 0,05, p < 0,05 соответственно). Показатели НСТ-теста отражают выработку активированных кислородных метаболитов, таких как H2O2 и HOCl — важной составляющей процессов внутриклеточного киллинга. Разрушение поглощенных микробов и вирусов фагоцитами происходит с привлечением кислородза-висимых механизмов, в результате действия на поглощенный объект надпероксидных анионов (О2-), перекиси водорода (Н2О2), синглетного кислорода (1О2), гидроксильных радикалов (ОН), образование которых происходит в результате активации метаболических процессов в клетке [25].У реконвалесцентов COVID-19 одновременное снижение показателей спонтанного и индуцированного НСТ-тестов указывает на глубокое поражение бактерицидных систем N. В группах 1, 2, 3 НСТ спонт. коррелирует с колонизацией доминирующими патогенами S. aureus (r = -0,76; p < 0,05), Саndida albicans (r = -0,62; p < 0,05). В группах 1а, 2а, 3а выявлены обратные корреляции высокой силы с доминирующими колонизаторами S. aureus и Саndida albicans (r = -0,74; r = -0,71; p < 0,05, p < 0,05 ^ответственно). Для НСТ стим. обратные корреляции высокой силы выявлены при микст-колонизации с S. aureus (r = -0,81; p < 0,05) и Саndida albicans (r = -0,88; p < 0,05). НСТ стим. отражает резервные потенции N, связанные с активировацией кислородных метаболитов и процессами киллинга. Угнетение резервного потенциала N у реконвалесцентов COVID-19 ассоциируется с микст-колонизацией S. Aureus + Саndida albicans.
Таким образом, функциональные нарушения N как представителя мукозального иммунитета на уровне опсонизации, рецепции и внутриклеточной биоцидности способствуют усилению колонизации патогенами S. aureus, Саndida albicans, гра-мотрицательными бактериями у реконвалесцентов COVID-19. Дальнейшее угнетение антимикробных стратегий N оказывает регулирующее влияние на формирование микст-инфицирования патогенами, в первую очередь S. aureus, Саndida albicans. Клиническими проявлениями нарушенных биоценозов является развитие воспалительных процессов, в том числе носящих хронический характер, развитии рецидивирующих ОРИ и низкая эффективность традиционной противовоспалительной терапии. При этом комплексные терапевтические подходы к коррекции топических нарушений местного
Таблица 4. Взаимосвязи между показателями функциональной активности нейтрофилов системы МАЦГ и некоторыми представителями микробиоты у реконвалесцентов COVID-19
Table 4. Relationships between indicators of the functional activity of the MALT system neutrophils and some representatives of the microbiota in COVID-19 convalescents
Показатель Staphylococcus aureus Candida albicans Klebsiella spp., Escherichia coli
Группа 1 Моноинфицирование n = 11 Группа 1a Микробные ассоциации n = 15 Группа 2 Моноинфицирование n = 11 Группа 2a Грибково-бактериальные ассоциации n = 12 Группа 3 Моноинфицирование n = 9 Группа 3а Микробные ассоциации n = 8
ФАН 1 -0,31 не дост. - 0,42 не дост. -0,50 не дост. -0,49 не дост. -0,3 не дост. -0,60 не дост.
ФАН 2 -0,41 не дост. -0,43 не дост. -0,50 не дост. -0,49 не дост. 0,20 не дост -0,55 не дост.
ФИ -0,62 p < 0,05 -0,72 p < 0,01 -0,51 не дост. -0,72 p < 0,01 -0,61 p < 0,05 -0,88 p < 0,01
ФЧ -0,42 не дост. -0,72 p < 0,01 -0,32 не дост. -0,69 p < 0,01 -0,32 не дост. -0,65 p < 0,05
% П -0,31 не дост. -0,62 p < 0,01 -0,34 не дост. -0,60 p < 0,05 -0,49 не дост -0,65 p < 0,05
ИП -0,34 не дост. -0,61 p < 0,01 -0,31 не дост. -0,67 p < 0,05 -0,36 не дост. -0,69 p < 0,05
НСТ спонт.,% -0,76 p < 0,01 -0,74 p < 0,01 -0,62 p < 0,05 -0,71 p < 0,05 -0,56 не дост. -0,61 не дост.
НСТ стим., % -0,42 не дост. -0,81 p < 0,01 -0,48 не дост. -0,88 p < 0,01 -0,58 не дост. -0,63 не дост.
Примечание: статистическая значимость r Спирмена при p < 0,05. R крит. при n = 8 p < 0,05-0,64; p < 0,01 -0,83; r крит. при n = 9 p < 0,60; p < 0,01 r -0,78; r крит. при n = 11 p < 0,05-0,53; p < 0,01 -0,72; r крит. при n = 12 p < 0,05-0,50; p < 0,01-0,71;. R крит. при n = 15 p < 0,05-0,43; p < 0,01 -0,62.
Note: statistical significance by Spearman at p < 0.05. R crit. at n = 8 p < 0.05-0.64; p < 0.01-0.83; r crit. at n = 9 p < 0.60; p < 0.01 r -0.78; r crit. at n = 11 p < 0.05-0.53; p < 0.01-0.72; r crit. at n = 12 p < 0.05-0.50; p < 0.01-0.71; r crit. at n = 15 p < 0.05-0.43; p < 0.01-0.62.
иммунитета и микрофлоры ротоглотки у реконвалесцентов COVID-19 до настоящего времени не разработаны. Полученные нами данные расширяют представление об участии нейтрофилов в формировании микробиоценоза слизистых оболочек системы MALT у реконвалесцентов COVID-19 и открывают перспективу для проведения клинических испытаний препаратов для коррекции дисбиоти-ческих и иммунологических нарушений на уровне СОВДП.
Выводы
1. Изменения в составе микробиоты у реконвалесцентов COVID-19 характеризуется двумя направлениями — повышением колонизации бактериальными и грибковыми патогенами S. aureus, Candida albicans, энтеробактериями (Escherichia coli, Klebsiella spp.) и нарастанием микст-инфицирования.
2. Усиление процессов деструкции и апоптоза N у реконвалесцентов COVID-19 определяют наруше-
ния на уровне функционально метаболической активности —рецепции, киллинга, внутриклеточной биоцидности N.
3. Угнетение антимикробных стратегий нейтрофилов на уровне мукозального иммунитета определяет нарастание колонизации бактериальными и грибковыми патогенами S. aureus, Candida albicans, энтеробактериями (Escherichia coli, Klebsiella spp.), а также нарастание микробных ассоциаций, в первую очередь (S. Aureus + Candida albicans) у реконвалесцентов COVID-19.
Работа выполнена за счет средств субсидии, выделенной в рамках государственной поддержки Казанского (Приволжского) федерального университета, в целях повышения его конкурентоспособности среди ведущих мировых научно-образовательных центров
Агафонова Е.В.
https://orcid.org/0000-0002-4411-8786
Литература
1. Zhou F., Yu T., Du R., Hu Z. et al. Clinical course and risk factors for mortality of adult inpatients with COVID-19 in Wuhan, China: a retrospective cohort study // Lancet. — 2020. — Vol. 395. — P. 1054-1062.
2. Tay M.Z., Poh C.M., Renia L. et al. The trinity of COVID-19: immunity, inflammation and intervention // Nat Rev Immunol. —
2020. — Vol. 20. — P. 363-374.
3. Juliana de Mel, Batista dos Santos, Camila Pereira Soares et al. In Nasal Mucosal Secretions, Distinct IFN and IgA Responses Are Found in Severe and Mild SARS-CoV-2 Infection // Front Immunol. —
2021. — Vol. 12. — P. 595343.
4. Zhou X., Jiang W., Liu Z. et al. Virus infection and death receptor-mediated apoptosis // Viruses. — 2017. — Vol. 9. — Р. 316-350.
5. Vabret N., Britton G.J., Gruber C. et al. Sinai Immunology Review Project. Immunology of COVID-19: current state of the science // Immunity. — 2020. — Vol. 52. — P. 910-941.
6. Liu J., Li S., Liu J. Longitudinal characteristics of lymphocyte responses and cytokine profiles in the peripheral blood of SARS-CoV-2 infected patients // E Bio Medicine. — 2020. — Vol. 55. — P. 1027-1063.
7. Mehta P., McAuley D.F., Brown M., Sanchez E., Tattersall R.S., Manson J.J. HLH Across Speciality Collaboration, UK. COVID-19: consider cytokine storm syndromes and immunosuppression // Lancet. — 2020. — Vol. 395. — P. 1033-1034.
8. Silan Gu, Yanfei Chen. Alterations of the Gut Microbiota in Patients with Coronavirus Disease 2019 or H1N1 Influenza // Clin Infect. — 2020. — Vol. 71 (10). — P. 2669-2678.
9. Lansbury L., Lim B., Baskaran V., Lim W.S. Co-infections in people with COVID-19: a systematic review and meta-analysis // J Infect. — 2020. — Vol. 20. — P. 30323-30326.
10. Qin C., Zhou L., Hu Z. et al. Dysregulation of immune response in patients with COVID-19 in wuhan, china // Clin Infect Dis. — 2020. — Vol. 12. — P. 248-250.
11. Шабашова Н.В., Данилова Е.Ю. Местный иммунитет и ми-кробиота ротовой полости (обзор) // Проблемы медицинской микологии. — 2015. — Т. 17. — С. 4-9.
12. Нестерова И.В., Колесникова Н.В., Чудилова Г.А. и др. Новый взгляд на нейтрофильные гранулоциты: переосмысление старых догм. Ч. 1 // Инфекция и иммунитет. — 2017. — C. 219-230.
13. Андреева Ю.С., Долгушин И.И. Роль нейтрофилов в формировании микробиоценозов слизистых оболочек // Вестник новых медицинских технологий. — 2009. — Т. 16. — С. 20-22.
14. Маланичева Т.Г., Агафонова Е.В., Можгина С.С. Особенности мукозального иммунитета у детей дошкольного возраста с внебольничной пневмонией, протекающей на фоне рекуррентных респираторных заболеваний // Практическая медицина. — 2016. — Т. 7. — С. 68-73.
15. Ильина Т.С., Романова Ю.М. Бактериальные биопленки: роль в хронических инфекционных процессах и поиск средств борьбы с ними // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. — 2021. — Т. 39 (2). — C. 14-24.
16. Jose R.J.C., Manuel A. COVID-19 cytokine storm: the interplay between inflammation and coagulation // Lancet Resp. Med. — 2020. — Vol. 8. — P. 46-47.
17. Mangalmurti N.C., Hunter C.A. Cytokine storms: understanding COVID-19 // Immunity. — 2020. — Vol. 53. — P. 19-25.
18. Харченко М.А. Корреляционный анализ: учебное пособие для вузов. — Воронеж: Изд-во ВГУ, 2008. — 31 с.
19. Азнабаева Л.Ф., Арефьева Н.А., Кильсенбаева Ф.А. Иммуно-цитологические исследования в диагностике ринита и риносину-сита: атлас. — Уфа: Изд-во ГБОУ ВПО БГМУ МЗ РФ, 2013. — 40 с.
20. Nagata S. Apoptosis by death factor // Cell. — 2007. — Vol. 88. — P. 355-365.
21. Savill J., Fadok V., Henson P., Haslett C. Phagocyte recognition of cells undergoing apoptosis [review] // Immunol. Today. — 2003. — Vol. 14. — P. 131-136.
22. Savill J. Fadok V. Corpse clearance defines the meaning of cell death // Nature. — 2000. — Vol. 407. — P. 784-788.
23. Uren A.G. Conservation of baculovirus inhibitor of apoptosis repeat proteins (BIRPs) in viruses, nematodes, vertebrates and yeasts // Trends Biochem. Sci. — 2008. — Vol. 23. — P. 159-162.
24. Perfet-tini J.L., Gissot M.P., Souque D.M. Modulation of apoptosis during infection with Chlamydia // Methods Enzymol. — 2002. — Vol. 12. — P. 202-210.
25. Afzal M.M., Jeshtadi A., Mohmmed AK. Study of neutrophilic function by nitroblue tetrazolium test in septicemias and immune deficiency diseases // Int J Res Health Sci. — 2014. — Vol. 2. — P. 581-591.
