CC BY
23DOI https://doi.org/10.47612/1999-9127-2021-31-134-146 УДК 575.852'113:575.858:57.082.13
А. Н. Верчук1'2, С. В. Кубрак1, А. В. Кильчевский1
НАПРАВЛЕНИЯ СОВРЕМЕННОЙ ПАЛИНОЛОГИИ И ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БАРКОДИРОВАНИЯ ДНК ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ РАСТЕНИЙ ПО ПЫЛЬЦЕ
Государственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: a.n.verchuk@mail.ru Государственное учреждение «Научно-практический центр Государственного комитета судебных экспертиз Республики Беларусь» Республика Беларусь, 220114, г. Минск, ул. Филимонова, 25
Классическая палинология основывается на морфологическом описании пыльцы, полученной методом световой микроскопии, которая наряду с преимуществами имеет и ряд ограничений. Благодаря генетическому исследованию палиномов (смесей пыльцы и спор разных видов растений) будет возможно получить более точную дифференциацию видового состава пыльцы и анализом ДНК заменить или эффективно дополнить морфологический анализ. Приведенный обзор литературы показывает большой потенциал использования баркодирования ДНК пыльцы в ряде областей прикладной палинологии.
Ключевые слова: палинология, баркодирование, пыльца, ДНК пыльцы, высокопроизводительное секве-нирование.
Введение
Палинология (от греч. paline — пыль) — комплексная биологическая дисциплина, объектом исследования которой являются споры и пыльца растений, грибов и бактерий. Споро-во-пыльцевой анализ появился еще в первой половине ХХ века и был основан на описании морфологических особенностей пыльцы, видимой в световой микроскоп. Пыльцевые зерна часто имеют специфическую морфологию с разнообразной структурой внешней оболочки. Благодаря тому, что форма, размеры, текстура и рисунок внешней оболочки зерен пыльцы и спор во многих случаях имеют отличия у разных групп растений, это дает возможность определить таксономическую принадлежность пыльцы.
Дифференциация видового происхождения пыльцы находит множество применений, включая реконструкцию древних растительных сообществ, мониторинг аллергенов, оценку сетей опылителей, установление подлинности и качества продукции, проведение судебных экспертиз. Возрастающие потребности в получении достоверных данных с по-
мощью анализа пыльцевого материала, с одной стороны, и расширение возможностей применения полученной палинологической информации, с другой стороны, приводит к совершенствованию методов палинологии, в том числе и за счет внедрения подходов молекулярной биологии.
Растения, особенно ветроопыляемые, вырабатывают пыльцу в огромных количествах. Из-за своих микроскопических размеров пыльца находится во взвешенном состоянии в воздухе и встречается повсеместно: оседает на поверхности земли и всего, что на ней находится, на поверхности и в толще вод, в грунтовых водах, глубоко в скалах, в помещениях, содержится в воздухе, вдыхаемом людьми и животными. Благодаря этому пыльца представляет собой широко распространенный биомаркер, используемый в основном для определения географического и временного происхождения объектов, сохранивших пыльцу растений на своей поверхности.
Современная палинология — во многом наука прикладная, и ее интенсивное развитие, наблюдаемое в последнее время, связано
с появлением все более новых направлений применения споро-пыльцевого анализа [1, 2]. Так, пыльца растений может быть важным криминалистическим маркером при расследовании уголовных и административных дел. Однако его использование в настоящее время ограничено необходимостью наличия узких специалистов в области морфологии пыльцы; большими трудовыми затратами, связанными с подготовкой препаратов и подсчетом пыльцевых зерен под световым микроскопом; относительно низким таксономическим разрешением, так как выявить морфологические различия пыльцы на видовом уровне не всегда возможно.
Метод определения пыльцы с использованием баркодирования ДНК (ДНК-штрихкодирование, генетический баркодинг, ДНК-баркодинг, англ. DNA barcoding) способен расширить возможности палинологии. Новые технологии секвенирования, стандартизированные генетические маркеры растений и принципы метабаркодирования дают возможность анализировать сложные пробы, такие как многокомпонентные смеси пыльцы различных видов растений.
Методы изучения пыльцы
В палинологии выделяют центральный, исторически первый раздел — палиноморфо-логию, которая занимается изучением морфологического строения пыльцевых зерен и спор, описанием их ультраструктуры и развития, классификацией морфологических признаков по палиноморфологическим типам, разработкой ключей для определения и сравнения близкородственных групп. Особенности строения спородермы являются информативным морфологическим признаком для определения надвидовых таксонов. Но не все растительные таксоны полно и всесторонне исследованы с палиноморфологической точки зрения, и палиноморфология в настоящее время представляет собой развивающуюся область ботанических исследований [3-6]. Полученные данные используются для уточнения вопросов систематики и филогении растений, для решения частных проблем селекции сельскохозяйственных культур, имеют широкое применение и в ряде других прикладных дисциплин.
Несмотря на разнообразное научное и прак-
тическое использование, метод микроскопии пыльцы имеет ряд существенных ограничений. Из-за отсутствия полной палиноморфологиче-ской информации многие типы пыльцы просто сгруппированы на уровне рода или семейства, а анализ данных о разнообразии пыльцы сильно ограничен. У некоторых групп растений нет морфологических различий пыльцы на видовом уровне, из-за чего метод имеет невысокое таксономическое разрешение и не позволяет провести границу между отдельными близкородственными видами [7-10]. Дифференциация пыльцы методами микроскопии является медленной, трудоемкой процедурой и требует высококвалифицированных специалистов-практиков. На протяжении десятилетий определение и количественная оценка пыльцевых зерен зависели от немногочисленных узкоспециализированных экспертов, к подготовке и опыту которых предъявлялись высокие требования. Кроме того, необходимо наличие эталонных коллекций постоянных препаратов, атласов микрофотографий пыльцевых зерен, системы морфологического описания и классификации пыльцы. Некоторые упрощения морфологического метода были достигнуты благодаря частичной автоматизации анализа пыльцы, которая позволяет достичь более высокой скорости обработки образцов, повысить объективность, облегчить дифференциацию на основе смешанных выборок, что сделает ее привлекательной для крупномасштабных исследований [11]. Были усовершенствованы методы автоматического анализа микропрепаратов, создано программное обеспечение обработки изображений для подсчетов и классификации пыльцы [12].
Альтернативой и/или дополнением морфологических методов в исследовании пыльцы стали молекулярные методы, использование которых существенно расширило возможности пыльцевого анализа. Благодаря разнообразию, постоянному усовершенствованию и открытию новых молекулярных подходов, стало возможным изучение пыльцы редких и слабо изученных растительных таксонов.
С начала 90-х в выделенной из пыльцы ДНК исследовали отдельные гены, ответственные за развитие поллинозов, за тканеспецифиче-ские процессы, протекающие в пыльце, применяя при этом доступные в то время методы:
выделение РНК и создание библиотек кДНК с последующим анализом конкретных генов, методом секвенирования по Сэнгеру и Но-зерн- и Саузерн-блоттинга [13, 14]. Тогда же были предприняты первые попытки определения растений по маркерным участкам внутреннего транскрибируемого спайсера и рибулозо-бисфосфат карбоксилазы (ITS — internal transcribed spacer и rbcL — ribulose-bisphosphate carboxylase), используя в качестве источника ДНК пыльцу [15]. Позже появилась методика извлечения ДНК из одиночных пыльцевых зерен с последующей амплификацией коротких (до 200 п. н., в отдельных случаях 300-400 п. н.) фрагментов исследуемых генов [16, 17]. На образцах ДНК пыльцы проводили AFLP-анализ (Amplified Fragment Length Polymorphism) для мультилокусного маркирования генотипов и STR-анализ (Short Tandem Repeat) для идентификации генотипов [16, 18, 19]. Для определения набора растительной пыльцы в образцах меда была адаптирована методика ПЦР в реальном времени, чтобы различить мед из различных географических регионов [20].
С распространением ДНК-баркодинга для определения видовой принадлежности растений этот метод стал применяться и на пыльце. ДНК-баркодинг (ДНК-штрихкодирование) — идентификация и классификация организмов по стандартной короткой нуклеотидной последовательности, часто и успешно применяется ко всем основным группам организмов, в том числе и к растениям. Материалом может служить любой фрагмент организма, из которого можно выделить качественный препарат ДНК, подходящий для последующего секвенирова-ния. Несмотря на то, что большинство ДНК-баркодов, используемых для идентификации растений, находятся в пластидном геноме, было показано, что гены пластидной ДНК могут амплифицироваться и в пыльце [21-24].
Чаще всего палинологические образцы пыльцы представляют собой смесь пыльцы и спор разных видов растений — т. н. палино-мы, поэтому для секвенирования ДНК по методу Сэнгера образцы необходимо разделить на отдельные компоненты. Это утомительная, подверженная ошибкам задача, требующая ручного разделения пыльцы по групповым признакам, каждая из которых должна ам-
плифицироваться и секвенироваться индивидуально. Существует метод, при котором под микроскопом из смеси извлекают отдельные пыльцевые зерна и проводят их секвенирова-ние. Такую сортировку, как и при морфологическом анализе пыльцы, можно использовать для единичных исследований, но она неудобна для массового применения [16, 18]. Другой способ разделения смеси заключается в выделении ДНК из смеси, совместной амплификации и последующем клонировании амплико-нов, метод также трудоемкий и не подходит для массового анализа [21].
Удобным инструментом генетического анализа, позволяющего работать со смешанными образцами и эффективно определять виды в многокомпонентных смесях, является высокопроизводительное секвенирование или секвенирование нового поколения (MPS — massively parallel sequencing; NGS — next generation sequencing). Определение таксономического состава сложных образцов путем высокопроизводительного секвенирования последовательностей общих маркерных генов-баркодов (или штрихкодов) получило название метабаркодинг. Изучение видового состава пыльцы с помощью метабаркодинга сначала было применено для контроля качества меда, полученного от разных растений. Показано, что метод относительно прост в реализации, не требует специальных навыков для анализа, более надежен, чем классические методы и его легко применять для крупномасштабного исследования [25]. Результаты метобаркодинга пыльцы сравнивали с данными, полученными с помощью световой микроскопии тех же образцов; была получена большая разрешающая способность метода высокопроизводительного секвенирования, так как с его помощью было идентифицировано большее количество таксонов и не требовалось специальных знаний экспертов-палинологов [26]. С тех пор многочисленные исследования используют потенциал метабаркодинга для решения задач крупномасштабной идентификации пыльцевых смесей в целом ряде областей, отрабатывая рекомендации по стандартизации и совершенствованию метода и решая возникающие технические проблемы [23, 27, 28].
Области прикладной палинологии
Палеопалинология
Пыльца растений, покрывая в большом количестве поверхность земли, со временем перекрывается слоем грунта и переходит в ископаемое состояние. Пыльца и споры растений имеют прочную внешнюю оболочку, состоящую из спорополленина, одного из самых стойких органических веществ, способного выдерживать длительные температурные и химические воздействия. Благодаря этому пыльца может сохраняться в геологических отложениях на протяжении сотен миллионов лет.
На способности пыльцы существовать в практически неизмененном виде в течение длительных периодов основано первое из прикладных направлений палинологии — палео-палинология, которая изучает закономерности рассеивания и захоронения (фоссилизации) пыльцевых зерен и спор. Анализ пыльцы впервые был применен Леннартом фон Постом в 1916 г. в исследованиях озерных и болотных отложений для реконструкции растительного покрова прежних геологических эпох. К середине XX века метод пыльцевого анализа становился все более используемым в палеонтологических исследованиях, появились первые руководства по палеопалинологии [29].
Результаты анализа помогают реконструировать растительный покров и климат прошлых эпох, устанавливать стратиграфические границы в геологических разрезах. Анализ пыльцы осадочных пород и торфов позволяет решать задачи других естественнонаучных дисциплин — палеоботаники, палинотаксономии, систематики растений, палеогеографии, геоморфологии, геологии, стратиграфии [2, 30].
ДНК, извлеченная из ископаемых образцов, относится к так называемой аДНК (ancient DNA, древняя ДНК). Из-за гидролитического и окислительного повреждения выделение ДНК из образцов старше 100 тыс. лет крайне неэффективно. Это особенно верно в отношении растений, у которых хорошо сохраняется только окаменелая твердая древесина, не пригодная для выделения ДНК [31]. Разработка метода извлечения аДНК из ископаемой пыльцы помогает избежать таких ограничений, как проблемы с загрязнением, методологические трудности, редкая встречаемость подходящих окаменелых образцов и способствует более
широкому использованию генетического анализа для популяционных и эволюционных исследований. Генетическая информация, извлеченная из пыльцы, является наиболее полной и доступной, по сравнению со всеми другими группами окаменелостей, поэтому во временных рамках в десятки тысяч лет она играет ведущую роль в решении вопросов скорости геномных изменений и понимания темпов эволюции. Сравнение древних последовательностей ДНК с современными, дает возможность установить прямую генетическую связь и генетическую преемственность между современными и ископаемыми образцами [32].
Как дополнение к традиционному морфологическому мониторингу биоразнообразия древних почвенных отложений используют метабаркодинг. В этом случае универсальными маркерами стали более короткие фрагменты пластидного генома, так как обычные баркоды растений не всегда можно амплифицировать с деградированных молекул аДНК. Одной из таких коротких маркерных последовательностей является область петли Р6 интрона trnL пластидной ДНК, которая эффективна при оценке биоразнообразия в древних смешанных отложениях. В случае палеопалинологии, баркодинг предлагается именно как дополнение микроскопического анализа ископаемой пыльцы, так как данные, полученные обоими методами, дали в основном неперекрывающиеся списки таксонов, каждый из двух методов способен обнаружить свой состав флоры, и ни один не является полностью исчерпывающим [33]. Так, микроскопический анализ пыльцы растений голоцена позволил обнаружить большее число таксонов, чем анализ ДНК, но растения, вырабатывающие ограниченное количество пыльцы, легче идентифицировались методом секвенирования. Кроме того, анализ ДНК позволяет идентифицировать образцы на более низком таксономическом уровне. Сравнение двух методов секвенирования — клонирование и секвенирование по Сэнгеру с метабаркодированием, выявило, что оба метода дают схожие результаты [33].
Метод анализа пыльцы успешно применяется при решении задач археологической палинологии — исследовании археологических памятников, изучении окружающей среды человека в древности и средневековье, оцен-
ке влияния изменений климата на различные аспекты жизни человека в прошлом [34]. Палинологические исследования археологических памятников позволяют реконструировать растительность на конкретной территории, воссоздавать климат, определять тип хозяйства древнего населения, оценить влияние антропогенного фактора на окружающую среду. Палинологический анализ применяется для уточнения хронологии на археологических памятниках, в случае, когда стратиграфический метод — определение хронологии по материальным находкам, залегающим в культурных слоях, оказывался недостаточно эффективным [34, 35].
Аэропалинология
Пыльца и споры растений, находящиеся во взвешенном состоянии в воздухе, составляют существенную часть так называемых биоаэрозолей — микроскопических частиц биологического происхождения в атмосфере. Биоаэрозоли, которые помимо пыльцы и спор содержат микроскопические фрагменты растений, животных, лишайников, водорослей, грибов, а также вирусы, бактерии, простейшие, распространяются на большие расстояния между континентами и на большие высоты, достигая пределов тропосферы [36, 37]. Пыльцу и споры, пассивно циркулирующих в атмосферных потоках, изучает аэропалинология, одна из задач которой состоит в оценке качественного и количественного составов аэроспектра, в выявлении суточной и сезонной динамики пыления растений. Аэропалинологические исследования необходимы при ландшафтном обустройстве городов и рекреационных мест, при проведении экологических, географических и климатических исследований [38, 39].
В период цветения в атмосферу попадает большое количество пыльцы, которая подхватывается вихревыми вертикальными потоками и попадает в более высокие слои, намного выше растительного покрова [40, 41]. Горизонтально биологические аэрозоли могут разноситься на большие расстояния, оказываясь над океанами и над другими континентами за тысячи миль от предполагаемых источников [42]. В верхних слоях атмосферы наиболее мелкая пыльца и споры могут быть центрами конденсации облаков — частицами, на которых конденсируется водяной пар, становясь
тем самым регулирующим фактором в образовании осадков и влияя на гидрологический цикл и климат [43]. В морской среде твердые частицы биологического происхождения являются наиболее активными центрами образования кристаллов льда, так называемой биологической нуклеации льда [44].
Биологические аэрозоли атмосферы в настоящее время активно изучаются. Несмотря на непосредственное участие в атмосферно значимых процессах, пока нет достаточной информации об их составе, численности, источниках происхождения [45]. Биологическую составляющую аэрозолей, так называемый атмосферный микробиом, анализируют с использованием методов MPS, что позволяет всесторонне определить разнообразие организмов в пробе аэрозоля [36, 46, 47]. Являясь репродуктивными единицами, пыльца и споры в составе биоаэрозолей играют важную роль в распространении растений и грибов, так как конвекционное перемещение слоев атмосферы позволяет преодолевать большие расстояния и любые географические барьеры. Таким способом происходит генетический обмен между разными ареалами обитания, заселение новых для вида территорий и осуществление географических сдвигов биомов. Биоаэрозоли рассматриваются как важный элемент в развитии, эволюции и динамике экосистем, воздействующий на фундаментальные процессы экологии и эволюции растений [48]. Изучение особенностей рассеивания спор патогенных грибов в зависимости от географического положения источника и направления распространения позволяет предотвратить экономические потери в сельском хозяйстве [46].
Экологическая палинология
Экологическая палинология — самостоятельная часть экологического мониторинга состояния окружающей среды, опирающаяся на анализ видового состава пыльцы, полученной из современных или ископаемых источников. Она занимается изучением экологии отдельных регионов, сменой биоценозов, прогнозом изменений состояния окружающей среды. Видовой состав пыльцы в поверхностном слое почвы отражает существующее в данной местности разнообразие растительности. Использование молекулярных методов в палинологическом анализе поверхностного слоя
почвы позволяет оценить биоразнообразие и установить особенности локального изменения растительности [49].
Существенным аспектом экологической палинологии является проблема взаимодействия растений и их опылителей. Движение пыльцы имеет важное значение для долгосрочной структуры и функций растительных сообществ как естественных, так и управляемых систем сельского хозяйства [50]. Вопросам сохранения и использования опылителей уделяется внимание, например, в Конвенции о биологическом разнообразии, как ключевом документе в процессе принятия более устойчивых решений для перехода к созданию эффективных продовольственных систем [51]. Знание флоры в регионе, динамики переноса пыльцы, конкуренции между опылителями необходимо для успешного пчеловодства, как в вопросах содержания пчел, так и для производства продуктов пчеловодства [52].
Использование метабаркодинга для анализа ДНК смешанных проб пыльцы, собранных с опылителей или с растений, позволяет получить более четкое представление о биологии опыления, повысить таксономическое разрешение структуры сетей растение-опылитель, изучать конкуренцию между растениями и/ или опылителями, а также биогеографию растений. Полученные результаты помогают отслеживать изменения в растительных сообществах, анализировать динамику взаимодействия между растениями и опылителями с течением времени, что в итоге дает информацию об антропогенных изменениях ландшафта, таких как фрагментация среды обитания или изменение климата [53, 54, 55]. Экологическая палинология может использовать материал исторических коллекций насекомых-опылителей, многие из которых при сборе содержали пыльцу. Эти данные важны для сохранения эталонных состояний сообществ в проектах, направленных на экологическое восстановление [1].
Выращивание генетически модифицированных (ГМ) сельскохозяйственных культур вызывает многочисленные опасения во многих странах мира. Ауткроссинг генетически модифицированных организмов (ГМО) с самого начала был критической проблемой, поскольку пыльца, переносимая по воздуху, считалась
важным способом распространения ГМО. Использование генетического анализа проб пыльцы из воздуха в сочетании с микроскопическим анализом позволило проводить экологический мониторинг выращивания ГМО на определенной территории. Продемонстрирована применимость этого подхода в различных климатических условиях, в сельских и пригородных районах, даже при очень низком уровне переносимой по воздуху пыльцы, что может помочь в наблюдениях за зонами, свободными от ГМО (например, такими, как центры происхождения, природные заповедники) [56].
Анализ видового состава гранул пыльцы, переносимой медоносными пчелами и собранной из ульев, позволил выявить, что на состав пыльцы в значительной степени влияет местное флористическое биоразнообразие, фенология растений и присутствие чужеродных цветущих видов. Благодаря собранной эталонной базе данных ДНК-баркодов гЬЛ и trnH-psbA стало возможным идентифицировать пыльцу на уровне видов растений, что оказалось полезным при получении продуктов пчеловодства с конкретными пищевыми или терапевтическими характеристиками, востребованных на рынке [21].
Мелиссопалинология
Мелиссопалинология изучает пыльцевой состав меда и других продуктов пчеловодства. В настоящее время существует проблема разработки критериев палинологической аутентичности меда в зависимости от региона происхождения и видового состава пыльцы. Видовая принадлежность пыльцы, содержащейся в меде, позволяет установить его натуральность и эколого-геоботаническую привязку по спектру представленных семейств растений, и является одной из важнейших характеристик качества меда наряду с органолеп-тическими и биохимическими показателями. Идентификация образцов цветочной пыльцы, присутствующих в меде, важна для определения его лекарственной ценности, а также для выборочного выращивания местных растений, важных для медоносных пчел [57].
Характеристика и стоимость меда зависят от растений, с которых он был собран, поэтому при маркировке меда требуется обязательное указание источника пыльцы. Существуют монофлоральные сорта меда (если содержание
пыльцы одного вида превышает 45%) и муль-тифлоральные, стоимость которых значительно ниже, что может приводить к заведомой фальсификации. Видовой состав нектара необходимо выяснять и с точки зрения безопасности, так как отмечены случаи, когда мед содержал пыльцу ядовитых растений и представлял опасность для здоровья человека [58].
Поскольку мед содержит пыльцу нескольких десятков видов растений, для его анализа преимущественно используются методы, позволяющие работать со смешанными образцами пыльцы. Традиционное микроскопическое исследование позволяет выявить количественный состав видов в пыльце, особенно тех, которые присутствуют в небольших количествах. Однако, как и во всех областях прикладной палинологии, микроскопические наблюдения трудоемки, требуют много времени и специальных палинологических знаний. В то же время преимущество метабаркодиро-вания ДНК состоит в том, что оно позволяет провести скрининг крупных выборок и обеспечивает большее разрешение для некоторых семейств растений [22].
Видовой состав флоры конкретного региона имеет определяющее значение для того, какие ДНК-баркоды окажутся наиболее эффективными для анализа меда. Баркодирование по отдельным локусам выявило, что для флоры одного региона разрешающая способность пластидных баркодов (matK, rbcL) выше, чем рибосомного ДНК-шрихкода (ITS) [24]. Тогда как для определения видового состава флоры другого региона максимальное количество видов идентифицировано с помощью ITS2 и matK [59]. Таким образом, мультилокусное баркодирование смешанного образца пыльцы может быть более надежным, чем отдельный анализ индивидуальных локусов. В связи с этим, актуален поиск новых вариантов бар-кодов и их комбинаций, оптимизированных для молекулярной мелиссопалинологии. Отсутствие баз данных по пыльце растений изучаемого региона или отсутствие достаточной информации для таксономической классификации пыльцы является фактором, снижающим эффективность методов анализа образцов меда [59].
Медицинская палинология
Пыльца растений — один из основных ал-
лергенов, вызывающий у людей поллинозы. Тяжесть симптомов поллинозов зависит от таксономического происхождения пыльцы, вызвавшей аллергию и концентрации аллергена. Мониторинг пыльцы аллергенных растений, особенно в составе городских насаждений, позволяет получить информацию, полезную для врачей-аллергологов и их пациентов. В последние десятилетия были разработаны различные программы мониторинга пыльцы, созданы базы данных наблюдения за пыльцой, доступ к которым позволяет медицинским службам лучше контролировать аллергенную обстановку и проводить медицинские мероприятия по профилактике сезонных заболеваний [1]. Распространенность и тяжесть аллергических заболеваний также зависит от факторов, связанных с изменением климата. Изменения климата влияют на физиологию и распространение растений и грибов: повышение температуры, грозы, концентрации CO2 влияют на производство пыльцы и спороношение грибов, содержание аллергенов в спорах и пыльце, на закономерности распределения аэроаллергенов [46]. Усложняется ситуация в городах, когда пыльца смешивается с выхлопными газами и иными загрязняющими веществами, характерными для города.
Нет единого мнения о том, сколько видов растений продуцируют пыльцу с аллергенной активностью, их количество у разных авторов варьирует от 50 до 2 000 [60]. Существует мнение, что в той или иной степени аллергенными являются все покрытосемянные растения [60]. Таким образом, данная ситуация требует повышенного внимания со стороны медицинских служб, что, в свою очередь, создает потребность в инструменте, который будет способен быстро и максимально полно идентифицировать пыльцу различных видов растений.
Как и в других областях прикладной палинологии, для анализа видового состава пыльцы, содержащейся в воздухе и вызывающей аллергию, в последнее время стали использовать метабаркодинг ДНК на основе секвени-рования нового поколения MPS по технологии полупроводникового секвенирования (Ion Torrent) с анализом участка trnL дало возможность провести более точное таксономическое разделение видов растений по выделенной из
пыльцы ДНК, чем проводившийся параллельно с использованием метода световой микроскопии [23].
Судебная палинология
Судебная палинология — это раздел палинологии, где изучение пыльцы используется для доказательства или опровержения связи между объектами, людьми и определенными местами [61, 62].
Растения произрастают в определенных физико-географических условиях, формируя ареал вида. Однако хозяйственная деятельность человека приводит к существенным изменениям природных ландшафтов, интро-дуцируя несвойственные растения в природные фитоценозы, где наряду с коренными видами встречаются нехарактерные для данной местности растения, особенно это характерно для городских ландшафтов. Пыльца и споры, в значительных количествах производимые растениями, оседают и накапливаются на поверхностях различных предметов, формируя сложный и уникальный спорово-пыльцевой комплекс. Благодаря этой особенности становится возможным отвечать не только на вопросы, касающиеся определения географического и временного происхождения объектов, но и решать идентификационные и диагностические задачи. Благодаря высокой летучести пыльцы круг исследуемых объектов-носителей крайне разнообразен. Это анонимные документы, лекарственные препараты, наркотические вещества, продукты питания, одежда и многое другое.
Судебная палинология полезна в случаях, когда имеет место перемещение вещественных доказательств, например, для сокрытия следов преступления при перезахоронении; помогает установить происхождение самодельных взрывных устройств, компьютеров и других трудно отслеживаемых объектов [63]. В настоящее время судебная палинология проводится на индивидуальной основе в исключительных случаях, когда следствию не хватает информации от более распространенных видов экспертиз. Однако значение судебно-палиноло-гической экспертизы растет, а ее применение в разных странах наглядно иллюстрирует, насколько данные о палиноморфах стали важным фактором раскрытия многих дел [64, 65].
В экспертной среде и научных статьях об-
суждается потенциал палинологии, но признается, что он в настоящее время лимитирован типичными для всех направлений палинологии ограничениями [1, 66]. Генетические методы изучения ДНК в криминалистике в основном применяются для идентификации человека, как правило, с помощью STR (Short Tandem Repeat) и в последнее время SNP (Single Nucleotide Polymorphism) анализа. С недавнего времени распространяются генетические методы в криминалистике для идентификации диких и домашних животных, а также отдельных особо важных видов растений, в основном с помощью STR и сек-венирования. Применяемые методы требуют разработки молекулярных инструментов для каждого вида отдельно, который не применим к другим видам или объектам исследования, произошедшим от нескольких особей, т.е. к смесям. Чаще всего учреждения, которые проводят исследования, вынуждены формировать свою собственную, как правило, закрытую базу генотипов образцов, опираясь на самостоятельно полученные показатели частот. Это приводит к невозможности сформировать единую базу данных в короткосроч-ной перспективе и потенциальным ошибкам из-за отсутствия межлабораторных сличений.
ДНК баркодирование помогает преодолеть сложности путем секвенирования ви-доспецифичных генетических областей, универсальных для больших групп живых организмов. Основные преимущества метода ДНК-баркодирования в судебной палинологии следуюшие: он может использоваться для большого количества таксономических групп, не требует привлечения узких специалистов, позволяет установить таксономию образца при отсутствии выраженных таксономических признаков. В уголовных и административных делах важное значение имеет достоверность полученных выводов. Используя световую микроскопию в судебно-палинологической экспертизе, крайне важно, сколько спор было подсчитано исследователем. Высокопроизводительное секвенирование нового поколения дает возможность исследовать весь пул пыльцевых зерен в образце, в том числе в сложных смесях, тем самым максимально увеличивая достоверность полученных выводов [1].
Заключение
С начала своего появления и до настоящего времени палинологические исследования основывались на методах световой микроскопии. Благодаря успешному решению ряда научных и прикладных вопросов классическая палинология получила широкое распространение, области ее применения многочисленны и разнообразны. Однако необходимость в преодолении ограничений световой микроскопии стимулировала дальнейшее совершенствование методов анализа пыльцы, что привело в итоге к использованию молекулярно-генетических подходов в палинологии. Проводимые в последнее десятилетие исследования палиномов с помощью секвенирования пыльцевой ДНК, которые заменяют или дополняют традиционную микроскопию и дают большее таксономическое разрешение, применимы к широкому кругу исследовательских задач. Микроскопический анализ в некоторых отраслях заменяется анализом ДНК, в других используется по-прежнему, но эффективно дополняется генетическим анализом.
Приведенный аналитический обзор научной литературы показывает большой потенциал использования баркодирования ДНК пыльцы в экологической, социальной, экономической, судебной и других областях прикладной палинологии. Несмотря на достигнутые успехи, технологии секвенирования многокомпонентных образцов нуждаются в дальнейшей оптимизации. Для успешного проведения баркодирования ДНК пыльцы необходимы следующие составляющие: эффективный метод выделения ДНК из пыльцевого материала, универсальные генетические маркеры и ре-ференсная база данных последовательностей ДНК генетических маркеров. Кроме этого, в некоторых случаях, как любой генетический анализ, баркодирование ДНК требует деструктивного отбора проб. Это означает, что возможно, анализируемый объект для других методов исследования будет непригоден. Для решения этой проблемы следует, по возможности, генетический анализ пыльцы проводить в последнюю очередь после завершения всех остальных исследований. Однако, если позволяет объем проб, можно аликвотировать отобранный материал, параллельно проводя генетические и морфологические исследо-
вания. Таким образом, решение технических проблем и стандартизация протоколов исследований позволит эффективно использовать палинологическую информацию, полученную с помощью методов молекулярной биологии, в различных направлениях научной и практической деятельности человека.
Список использованных источников
1. Bell, K. L. Pollen DNA barcoding: current applications and future prospects / K. L. Bell [et al.] // Genome. - 2016. - Vol. 59, № 9. - P. 629640.
2. Малолетко, А. М. К интерпретации спо-рово-пыльцевых спектров / А. М. Малолетко // География и природопользование Сибири.
- 2013. - № 15. - С. 98-109.
3. Трошкина, В. И. Палиноморфологиче-ские особенности таксонов рода Geranium (Geraniaceae) Алтайской горной страны / В. И. Трошкина // Turczaninowia. - 2017. -Т. 20, № 3. - С. 36-54.
4. Цымбалюк, З. Н. Палиноморфология видов родов Scrophularia, Verbascum и Celsia (Scrophulariaceae) / З. Н. Цымбалюк, Е. Э. Северова // Бюл. Моск. о-ва Испытателей природы. отд. биол. - 2012. - Т. 117, № 3. - С. 33-42.
5. Золала, Х. А. Особенности ультраструктуры пыльцевых зерен семейства Campanulaceae / Х. А. Золала, С. В. Полевова, Е. Э. Северова // Бот. журн. - 2011. - Т. 29, № 8. - С. 1076-1084.
6. Гаврилова, О. А. Разнообразие форм пыльцевых зерен и ихраспределение у некоторых видов и гибридов крыжовниковых / О. А. Гаврилова, О. А. Тихонова / Труды Карельского научного центра РАН. - № 3. - 2013.
- С. 82-92.
7. Davies, C. P. Modern pollen precipitation from an elevational transect in central Jordan and its relationship to vegetation: Modern vegetation and pollen in Jordan / C. P. Davies, P. L. Fall // J. Biogeogr. - 2002. - Vol. 28, № 10. - P. 11951210.
8. Effects of plant community composition and flowering phenology on honeybee foraging in Mediterranean sylvo-pastoral systems / S. Ba-gella [et al.] // Appl. Veg. Sci. - 2013. - Vol. 16, № 4. - P. 689-697.
9. Mullins, J. Sampling pollens / J. Mullins, J. Emberlin // J. Aerosol Sci. - 1997. - Vol. 28, № 3. - P. 365-370.
10. Rahl, M. Microscopic Identification and Purity Determination of Pollen Grains / M. Rahl // Allergy Methods and Protocols: Methods in Molecular Medicine / coll. J. M. Walker; eds. M.G. Jones, P. Lympany. - Totowa, NJ: Humana Press, 2008. - Vol. 138. - P. 263-269.
11. Stillman, E. C. The needs and prospects for automation in palynology / E. C. Stillman, J. R. Flenley // Quat. Sci. Rev. - 1996. - Vol. 15, № 1.
- P. 1-5.
12. Holt, K. A. Principles and methods for automated palynology / K. A. Holt, K. D. Bennett // New Phytol. - 2014. - Vol. 203, № 3. - P. 735742.
13. Lafter, S. Complementary DNA cloning of the major allergen Phi p I from timothy grass (Ph-leum pratense); recombinant Phi p I inhibits IgE binding to group I allergens from eight different grass species / S. Lafter [et al.] // J Allergy Clin Immunol. - 1994. - Vol. 94, № 4. - P. 689-698.
14. Vaienta, R. Homology of the major birch-pollen allergen, Bet v I, with the major pollen allergens of alder, hazel, and hornbeam at the nucleic acid level as determined by cross-hybridization / R. Vaienta [et al.] // J Allergy Clin Immunol. -1991. - Vol. 87, № 3. - P. 677-682.
15. Petersen, G. PCR and sequencing from a single pollen grain / G. Petersen, B. Johansen, O. Seberg // Plant Mol. Biol. - 1996. - Vol. 31, № 1.
- P. 189-191.
16. Matsuki, Y. The determination of multiple microsatellite genotypes and DNA sequences from a single pollen grain: Technical article / Y. Matsuki, Y. Isagi, Y. Suyama // Mol. Ecol. Notes. - 2007. - Vol. 7, № 2. - P. 194-198.
17. Single-Pollen Genotyping // Single-Pollen Genotyping of Holocene Lake Sediments / L. Parducci, Y. Suyama; edit. Y. Isagi, Y. Suyama. -Springer, 2011. - Ch.8. - P. 102-106.
18. Aziz, A. N. Genetic mapping of Echinacea purpurea via individual pollen DNA fingerprinting / A. N. Aziz, R. J. Sauve // Mol. Breed. - 2008.
- Vol. 21, № 2. - P. 227-232.
19. Schield, C. Identification and persistence of Pinus pollen DNA on cotton fabrics: A forensic application / C. Schield [et al.] // Sci. Justice. -2016. - Vol. 56, № 1. - P. 29-34.;
20. Laube, I. Development of primer and probe sets for the detection of plant species in honey / I. Laube [et al.] // Food Chem. - 2010. - Vol. 118, № 4. - P. 979-986.
21. Galimberti, A. A DNA Barcoding Approach to Characterize Pollen Collected by Honeybees / A. Galimberti [et al.] // PLoS ONE. - 2014. - Vol. 9, № 10. - P. e109363.
22. Hawkins, J. Using DNA Metabarcoding to Identify the Floral Composition of Honey: A New Tool for Investigating Honey Bee Foraging Preferences / J. Hawkins [et al.] // PLOS ONE. -2015. - Vol. 10, № 8. - P. e0134735.
23. Kraaijeveld, K. Efficient and sensitive identification and quantification of airborne pollen using next-generation DNA sequencing / K. Kraaijeveld [et al.] // Mol. Ecol. Resour. - 2015. - Vol. 15, № 1. - P. 8-16.
24. Richardson, R. T. Rank-based characterization of pollen assemblages collected by honey bees using a multi-locus metabarcoding approach / R. T. Richardson [et al.] // Appl. Plant Sci. -2015. - Vol. 3, № 11. - P. e1500043.
25. Valentini, A. DNA Barcoding for Honey Biodiversity / A. Valentini, C. Miquel, P. Taberlet // Diversity. - 2010. - Vol. 2, № 4. - P. 610-617.
26. Keller, A. Evaluating multiplexed next-generation sequencing as a method in palynology for mixed pollen samples / A. Keller [et al.] // Plant Biol. - 2015. - Vol. 17, № 2. - P. 558-566.
27. Richardson, R. T. Application of ITS2 Metabarcoding to Determine the Provenance of Pollen Collected by Honey Bees in an Agroecosys-tem / R. T. Richardson [et al.] // Appl. Plant Sci.
- 2015. - Vol. 3, № 1. - P. e1400066.
28. Sickel, W. Increased efficiency in identifying mixed pollen samples by meta-barcoding with a dual-indexing approach / W. Sickel [et al.] // BMC Ecol. - 2015. - Vol. 15, № 1. - P. 20.
29. Erdtman, G. An Introduction to the Study of Pollen Grains and Spores. / G. Erdtman / Handbook of Palynology. Morphology — Taxonomy
- Ecology. - 1969. - Т. 81, № 8-9. - P. 656-657.
30. Еловичева, Я. К. Палинология Беларуси : (к 100-летию Белорусского государственного университета) : в 4 ч. / Я. К. Еловичева // Интерпретация данных палинологического анализа в целях стратиграфии, палеогеографии и корреляции природных событий гляциоплей-стоцена и голоцена / Я. К. Еловичева. - Минск, 2018. - С. 204-217.
31. Gugerli, F. Ancient plant DNA: review and prospects / F. Gugerli, L. Parducci, R. J. Petit // New Phytol. - 2005 - P. 10.
32. Bennett, K. D. DNA from pollen: principles
and potential / K. D. Bennett, L. Parducci // The Holocene. - 2006. - Vol. 16, № 8. - P. 1031-1034.
33. Parducci, L. Molecular- and pollen-based vegetation analysis in lake sediments from central Scandinavia / L. Parducci [et al.] // Mol. Ecol. -2013. - Vol. 22, № 13. - P. 3511-3524.
34. Насонова Э. Д. Палинология и археология: способы взаимодействия / Э. Д. Насонова // Материалы 52-й международной научной конференции, Новосибирск 11-18 апреля 2014 г. / Новосиб. гос. ун-т. - Новосибирск, 2014. -С. 63-64.
35. Насонова, Э. Д. Палинологический метод как способ стратификации археологических объектов на примере поселения Оськино болото / Э. Д. Насонова, Н. А. Рудая // ДОСи-ГИК. - Т. 7, № 1. - С. 93-99
36. DeLeon-Rodriguez, N. Microbiome of the upper troposphere: Species composition and prevalence, effects of tropical storms, and atmospheric implications / N. DeLeon-Rodriguez [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. - 2013. - Vol. 110, № 7. - P. е 2575-2580.
37. Maki, T. Assessment of composition and origin of airborne bacteria in the free troposphere over Japan / T. Maki [et al.] // Atmos. Environ. -2013. - Vol. 74 - P. 73-82.
38. Ненашева, Г. И. Аэропалинологический мониторинг аллергенных растений г. Барнаула : монография / Г. И. Ненашева; Ин-т водн. и экол. проблем СО РАН. - Новосибирск, 2013.
- С. 29-31.
39. Despres, V. Primary biological aerosol particles in the atmosphere: a review / V. Despres [et al.] // Tellus B Chem. Phys. Meteorol. - 2012. -Vol. 64, № 1. - P. 15598.
40. Tackenberg, O. Modelling long-distance dispersal if plant diaspores by wind / O. Tackenberg // Ecol. Monogr. - 2003. - Vol. 73, №. 2. -P. 173-189
41. Soons, M. B. Determinants of long-distance seed dispersal by wind in grasslands / M.B. Soons [et al.] // Ecology. - 2004. - Vol. 85, № 11. -P. 3056 3068.
42. Hallar, A. G. Atmospheric bioaerosols transported via dust storms in the western United States: Bioaerosols in western u.s. dust storms / A. G. Hallar [et al.] // Geophys. Res. Lett. - 2011.
- Vol. 38. - P. L17801.
43. Pope, F. D. Pollen grains are efficient cloud condensation nuclei / F. D. Pope // Environ.
Res. Lett. - 2010. - Vol. 5, № 4. - P. 044015. -doi:10.1088/1748-9326/5/4/044015.
44. DeMott, P. J. New Directions: Need for defining the numbers and sources of biological aerosols acting as ice nuclei / P. J. DeMott, A. J. Prenni // Atmos. Environ. - 2010. - Vol. 44, № 15. - P. 1944-1945.
45. Fröhlich-Nowoisky, J. Bioaerosols in the Earth system: Climate, health, and ecosystem interactions / J. Fröhlich-Nowoisky [et al.] // Atmospheric Res. - 2016. - Vol. 182 - P. 346-376.
46. Fröhlich-Nowoisky, J. Biogeography in the air: fungal diversity over land and oceans / J. Fröhlich-Nowoisky [et al.] // Biogeosciences.
- 2012. - Vol. 9, № 3. - P. 1125-1136.
47. Womack, A. M. Biodiversity and biogeog-raphy of the atmosphere / A. M. Womack, B. J. M. Bohannan, J. L. Green // Philos. Trans. R. Soc. B Biol. Sci. - 2010. - Vol. 365, № 1558. - P. 36453653.
48. A movement ecology paradigm for unifying organismal movement research / R. Nathan [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. - 2008. - Vol. 105, № 49. - P. 19052-19059.
49. A molecular approach to species identification of Chenopodiaceae pollen grains in surface soil / L.-J. Zhou [et al.] // Am. J. Bot. - 2007. -Vol. 94, № 3. - P. 477-481.
50. Jordano, P. Pollen, seeds and genes: the movement ecology of plants / P. Jordano // Heredity. - 2010. - Vol. 105, № 4. - P. 329-330.
51. Конференция сторон конвенции о биологическом разнообразии: Четырнадцатое совещание. - Шарм-эш-Шейх, Египет, 17-29 ноября 2018 г. - CBD/COP/14/L.28 27 November 2018.
52. Mitchell, R. J. Ecology and evolution of plant-pollinator interactions / R. J. Mitchell [et al.] // Ann. Bot. - 2009. - Vol. 103, № 9. -P. 1355-1363.
53. Brosi, B. J. The effects of forest fragmentation on bee communities in tropical countryside: Bee communities and tropical forest fragmentation / B. J. Brosi [et al.] // J. Appl. Ecol. - 2007.
- Vol. 45, № 3. - P. 773-783.
54. How does climate warming affect plant-pollinator interactions? / S. J. Hegland [et al.] // Ecol. Lett. - 2009. - Vol. 12, № 2. - P. 184-195.
55. Applying Pollen DNA Metabarcoding to the Study of Plant-Pollinator Interactions / K. L. Bell [et al.] // Appl. Plant Sci. - 2017. - Vol. 5,
№ 6. - P. 1600124.
56. Detection of airborne genetically modified maize pollen by real-time PCR / S. Folloni [et al.] // Mol. Ecol. Resour. - 2012. - Vol. 12, № 5. -P. 810-821.
57. Ненашева, Г. И. Методологические аспекты мелиссопалинологических исследований медов / Г. И. Ненашева [и др.] // Биотехнология и общество в XXI веке. —Барнаул, 2015. — С. 217-220.
58. A DNA barcoding approach to identify plant species in multiflower honey / I. Bruni [et al.] // Food Chem. - 2015. - Vol. 170 - P. 308315.
59. Meta-barcoding in combination with paly-nological inference is a potent diagnostic marker for honey floral composition / R. C. Laha [et al.] // AMB Express. - 2017. - Vol. 7, № 1. - P. 132.
60. Федотова, В. Г. Фенология аллергенных растений санкт-петербурга и ленинградской области / В. Г. Федотова, Л. П. Достоевская, П. А. Лебедев // Biosfera. - 2017. - Т. 9, № 2. -С. 166-196.
61. Application of ITS2 Metabarcoding to Determine the Provenance of Pollen Collected by Honey Bees in an Agroecosystem / R. T. Rich-
ardson [et al.] // Applications in Plant Sciences.
- 2015. - Vol. 3, № 1. - P. 1400066.
62. Taylor, B. Forensic Palynology: Spatial and Temporal Considerations of Spora Deposition in Forensic Investigations / B. Taylor, K. R. Skene // Australian Journal of Forensic Sciences. - 2003.
- Vol. 35, № 2. - P. 193-204.
63. Brown, A. G. The use of forensic botany and geology in war crimes investigations in NE Bosnia / A. G. Brown // Forensic Science International. - 2006. - Vol. 163, № 3. - P. 204-210.
64. Mildenhall, D. C. Hypericum pollen determines the presence of burglars at the scene of a crime: An example of forensic palynology / D. C. Mildenhall // Forensic Science International. -2006. - Vol. 163. - P. 231-235.
65. Wood, P. Pollen helps war crime forensics / P. Wood // BBC NEWS. - 9 September, 2004.
- Mode of access: http://news.bbc.co.uk/2/hi/ science/nature/3640788.stm. - Date of access: 30.08.2021.
66. Review and future prospects for DNA bar-coding methods in forensic palynology / K. L. Bell [et al.] // Forensic Science International: Genetics. - 2016. - Vol. 21 - P. 110-116.
A. N. Viarchuk12, S. V. Kubrak1, A. V. Kilchevskiy1
TRENDS IN MODERN PALYNOLOGY AND PROSPECTS OF USING DNA BARCODING FOR THE DIFFERENTIATION OF PLANTS BY
POLLEN
institute of Genetics and Cytology of NAS of Belarus Minsk, 220072, the Republic of Belarus e-mail: a.n.verchuk@mail.ru 2State Institution Scientific and Practical Center of the State Forensic Examination Committee of the Republic of Belarus Minsk, 220114, the Republic of Belarus
Classical palynology is based on the morphological description of pollen obtained using the light microscopy technique, which has along with its advantages a number of limitations. Due to the genetic study of mixtures of pollen and spores of different plant species, it will be possible to obtain more accurate identification of pollen species composition and to replace or effectively supplement morphological analysis with DNA analysis. The presented literature review demonstrates great potential of using pollen DNA barcoding in a number of areas of applied palynology.
Keywords: palynology, barcoding, pollen, pollen DNA, next generation sequencing.
Дата поступления в редакцию: 06 сентября 2021 г.
