CC BY
9DOI https://doi.org/10.47612/1999-9127-2022-33-58-66 УДК 575.852'113:575.858:57.082.13
А. Н. Верчук1'2, С. В. Кубрак1, А. В. Кильчевский1
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ МЕТОДОВ ПРЕДОБРАБОТКИ ПЫЛЬЦЫ РАСТЕНИЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КАЧЕСТВЕННЫХ
ОБРАЗЦОВ ДНК
Государственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси», Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая 27 e-mail: a.n.verchuk@mail.ru Государственное учреждение «Научно-практический центр Государственного комитета судебных экспертиз» Республики Беларусь», 220114, г. Минск, ул. Филимонова 25
Дана оценка эффективности методов предобработки образцов пыльцы при получении препаратов ДНК, выделяемых из шести видов растений. Качество и концентрацию образцов ДНК оценивали с помощью спек-трофотометрии, флуориметрии и ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Были выявлены несколько наиболее универсальных методов, позволяющих увеличить количество выделенной ДНК у всех исследуемых растений. Установлен положительный эффект от гомогенизации с металлическими шариками и последующей обработки ксилолом; гомогенизации c металлическими шариками и растирания с кварцевым песком; растирания с кварцевым песком и последующей обработки ксилолом.
Ключевые слова: ДНК пыльцы, выделение ДНК, предобработка пыльцы, ПЦР-РВ, палинология.
Введение
Использование молекулярно-генетических методов в прикладной палинологии, в том числе в судебной палинологии, дает возможность получить больше информации об образцах пыльцы как объекте экспертизы [1]. После отбора проб специалисту необходимо получить образец ДНК, подходящий для дальнейшего анализа, так как от качества выделенного препарата ДНК будет зависеть эффективность всех последующих этапов исследования. В случае использования пыльцы процесс осложняется ее микроколичеством и особенностями строения оболочки. Наружная оболочка пыльцевого зерна образована воскоподобным биополимером спорополле-нином, устойчивым как к воздействию кислот и щелочей, так и к нагреванию до 200 °С. По этой причине выделение ДНК из пыльцевых зерен — сложная задача, которая в полной мере до сих пор не решена.
Одним из способов повышения эффективности выделения ДНК из пыльцы может стать обработка пыльцевых зерен, предшествующая основной методике выделения и направленная
на разрушение внешней оболочки. Предобработка должна не только максимально увеличивать количество выделенной ДНК, но и не допускать значительной деградации нуклеиновых кислот, минимизировать риски контаминации, а также не допускать потери образца. Чаще всего исследуемый препарат пыльцы состоит из сложной смеси пыльцевых зерен разных растений, строение которых варьирует у разных видов. В связи с этим изучение влияния предобработки на пыльцу разных видов растений представляется необходимым этапом методики выделения ДНК из такого сложного объекта, как пыльцевой материал. Цель данной работы состояла в изучении влияния различных методов предобработки и их комбинаций на эффективность выделения ДНК из пыльцы разных видов растений.
Материалы и методы
В данном исследовании тестировали четыре способа предобработки и их сочетание: гомогенизация с металлическими шариками диаметром 3 мм при 30 ударах в сек в течение 3 мин (Ш); температурные перепады от -54 °С до
+80 °С в дистиллированной воде (Т); гомогенизация кварцевым песком в ступке пестиком (П) и воздействие ксилола при +80 °С в течение 30 мин с периодическим вортексировани-ем (К) — всего 10 комбинированных методов, отображенных в таблице 1. Объектом исследо-
вания являлась пыльца шести видов растений: береза повислая (Betulapendula), сосна обыкновенная (Pinus sylvestris), ель обыкновенная (Picea abies), дуб черешчатый (Quercus robur), тюльпан гибридный (Tulipa hibrida) и кукуруза сахарная (Zea mays).
Таблица 1
Методы предобработки и их комбинации, протестированные в исследовании
гомогенизация с металлическими шариками (Ш) температурные перепады (Т) растирание кварцевым песком (П) обработка ксилолом при +80°С (К)
гомогенизация с металлическими шариками (Ш) 1 Ш - - -
температурные перепады (Т) 2 Ш х Т 3 Т - -
растирание кварцевым песком (П) 4 Ш х П 5 Т х П 6 П -
обработка ксилолом при +80 °С (К) 7 Ш х К 8 Т х К 9 П х К 10 К
Примечание. 1 — гомогенизация с металлическими шариками (Ш); 2 — совместное воздействие гомогенизации с металлическими шариками и температурных перепадов (Ш х Т); 3 — воздействие температурных перепадов (Т); 4 — совместное воздействие гомогенизации с металлическими шариками и растирания кварцевым песком (Ш х П); 5 — совместное воздействие температурных перепадов и растирание кварцевым песком (Т х П); 6 — растирание кварцевым песком (П); 7 — совместное воздействие гомогенизации с металлическими шариками и обработка ксилолом (Ш х К); 8 — совместное воздействие температурных перепадов и обработка ксилолом (Т х К); 9 — совместное воздействие растирание кварцевым песком и обработка ксилолом (П х К); 10 — обработка ксилолом (К)
Исследуемые виды представляют различные группы растений: древесные и травянистые формы, однодольные и двудольные, голосеменные и покрытосеменные. Выбранный видовой состав позволял учесть морфологические и химические особенности внешней оболочки разных типов пыльцы.
Отбирали приблизительно одинаковый объем пыльцы, при этом навески варьировали по массе от 2,69 до 9,28 мг в зависимости от вида. Повторности для каждого вида были предварительно выровнены и имели одинаковую массу (табл. 2). Измерения навесок проводились на аналитических весах Rаdwаg AS/C/2/N 82/220 (Польша), дискретность которых составляет 0,01 мг.
Выделение ДНК осуществляли с помощью
набора GeneJet Plant Genomic DNA Purification Kit (TS KO792, Thermo Fisher Scientific, США), согласно инструкции производителя. Образцы ДНК исследовались с помощью спектрофотометра DS-11 (Denovix, США), флуориметра Quantus (Promega, США) и ПЦР-РВ, которая проводилась на амплификаторе QuantStudio5 (Applied Biosystems, США).
ПЦР проводили при следующих условиях: 95 °С — 5 мин, 40 циклов: 95 °С — 15 сек, 60 °С — 60 сек. В качестве ПЦР смеси использовали мастер-микс ArtMix Low ДНК-по-лимераза (АртБиоТех, Беларусь) с интеркали-рующим красителем EvaGreen PCR-379 (Jena Bioscience, Германия). Итоговая концентрация праймеров в смеси — 0,2 пмоль/мкл, общий объем ПЦР смеси составлял 20 мкл. Первич-
Таблица 2
Масса навесок пыльцевого материала в каждой исследуемой пробе в зависимости от вида
растений
Вид образца Масса навески пыльцы (мг/образец)
береза повислая 9,28
сосна обыкновенная 9,09
ель обыкновенная 2,77
дуб черешчатый 2,69
тюльпан гибридный 4,89
кукуруза сахарная 8,22
ную оценку специфичности ПЦР проводили на этапе плавления ампликонов.
В ПЦР-РВ использовали две пары праймеров с различной чувствительностью: 18S и eEF1Art [2, 3]. Праймеры 18S синтезированы к участку рибосомальной 18S рРНК, которая входит в состав малой субъединицы рибосом эука-риот и является основным компонентом всех эукариотических клеток. Праймеры 18S универсальны и имеют большое количество мест посадки, образуя множество копий на каждую клетку организма. Праймеры eEF1Art разработаны к гену эукариотического фактора элонгации, который представляет собой набор белков, функционирующих в рибосоме во время синтеза белка. Для праймеров eEF1Art существует меньше мест посадки, чем для 18S, о чем свидетельствует широкая номенклатура факторов элонгации, поэтому с помощью eEF1Art синтезируется меньшее количество копий.
Результаты и обсуждение
Концентрации образцов ДНК, измеренные методом спектрофотометрии, находились в диапазоне от 4,45 до 11,20 нг/мкл в зависимости от способа предобработки. Значения концентраций, близкие к пороговым, имеют высокую погрешность, что отражается на точности измерения. То же самое касается показателей чистоты препарата, определяемых по отношению поглощения при 260/230 и 260/280 нм. Если концентрация ДНК составляет <20 нг/мкл, для таких образцов невозможно точное установление показателей 260/280 и 260/230 [4].
Абсолютные значения результатов флуори-
метрии были заметно ниже, чем спектрофо-тометрии, и составляли от 0,018 до 1,525 нг/ мкл (табл. 3). Флуорофор связывается только с двухцепочечной ДНК, поэтому измерение концентрации на флуориметре более корректно, так как не учитываются сильно деградированные молекулы ДНК.
Наиболее высокие значения концентрации ДНК были получены при обработке пыльцы тремя способами: гомогенизация с металлическими шариками и обработка ксилолом; гомогенизация с металлическими шариками и растирание кварцевым песком; растирание с кварцевым песком и обработка ксилолом (1,525 нг/мкл; 1,010 нг/мкл; 0,570 нг/мкл соответственно). Самый низкий результат получен при однокомпонентном воздействии температурных перепадов — 0,018 нг/мкл.
Измерение концентрации ДНК при помощи ПЦР-РВ позволяет оценить эффективную концентрацию ДНК, которая учитывает только те фрагменты ДНК, которые пригодны для ПЦР — неповрежденные цепи достаточной длины. Концентрация эффективной ДНК может отличаться от концентраций, измеренных спек-тро- и флуорометрически. С одной стороны, в ПЦР могут вступать и одноцепочечные фрагменты, с другой стороны, наличие примесей, особенно фенольной природы, оказывают ин-гибирующее действие на ПЦР [5]. Количество ДНК в образце оценивается по минимальному числу циклов амплификации исследуемого локуса, превышающему пороговое значение. Низкое значение порогового числа циклов (С) указывает на высокий уровень содержа-
Таблица 3
Показатели концентраций ДНК, измеренные на флуориметре, и Ct для маркеров 18S и eEF1Art в зависимости от методов предобработок (средние значения для шести видов)
Метод предобработки Концентрация ДНК, нг/мкл С 188 О еЕПАП
К 0,045 26,199 ± 3,211 34,675 ± 0,379
Ш 0,474 22,364 ± 2,095 34,272 ± 0,442
Ш х к 1,525 20,949 ± 3,111 34,489 ± 0,350
Ш х П 1,010 21,692 ± 3,375 33,252 ± 2,119
Ш х Т 0,218 22,423 ± 3,010 34,088 ± 1,069
П 0,414 23,083 ± 3,409 34,230 ± 1,002
П х к 0,570 22,427 ± 3,303 32,745 ± 2,804
П х Т 0,256 23,312 ± 3,778 34,270 ± 0,839
Т 0,018 27,578 ± 3,023 34,716 ± 0,386
Т х к 0,048 27,083 ± 3,169 34,976 ± 0,527
ния целевой ДНК в образце. Если значение О; оказывается больше 30 циклов, возрастает вероятность неспецифической амплификации.
Определение количества ДНК методом ПЦР в реальном времени согласуется с результатами определения концентрации на флуориме-тре. При амплификации ДНК с маркером 18S (табл. 3) более высокие результаты показали следующие методы: гомогенизация с металлическими шариками и обработка ксилолом; гомогенизация с металлическими шариками и растирание кварцевым песком; гомогенизация с металлическими шариками. Среднее пороговое число циклов для этих трех предобработок составляло 20,949 ± 3,111, 21,692 ± 3,375, 22,364 ± 2,095 соответственно, что свидетельствует о более высоком количестве ДНК в образцах, по сравнению со значением С; для температурных обработок — 27,578 ± 3,023. Результаты предобработки, оцененные по амплификации с маркером eEF1Art, были сопоставимы с результатами, полученными по маркеру 18S, но с более низким разбросом значений. Основные характеристики образцов ДНК, выделенных из пыльцы шести изучаемых видов растений, с учетом десяти вариантов предобработок, представлены в таблице 4.
Рассмотрение результатов измерения концентрации ДНК для каждого вида растений в отдельности показало, что для трех из ше-
сти видов (береза повислая, дуб черешчатый, ель обыкновенная) на количество выделенной ДНК наиболее положительно повлияла совместная гомогенизация металлических шариков и обработка ксилолом; для двух видов (сосна обыкновенная, кукуруза сахарная) — растирание кварцевым песком и гомогенизация металлическими шариками; для тюльпана гибридного наибольшее количество ДНК получено при растирании кварцевым песком с обработкой ксилолом. Однокомпонентное воздействие температуры и/или совместное воздействие с другими предобработками положительного влияния на выделение ДНК не оказывает. По-видимому, этот способ предобработки не приводит к разрушению внешней оболочки пыльцы. В отличие от показателей флуориметрии, образцы, обработанные температурными перепадами, имеют высокие значения концентрации ДНК при измерении на спектрофотометре. Подобную разницу можно объяснить тем, что температурные перепады могут способствовать деградации ДНК, тем самым снижая количество двухцепочечных молекул, фиксируемых флуориметром.
Таким образом, различные варианты механического воздействия на оболочку пыльцы или сочетание механического и химического воздействия показывают наиболее эффективный результат. Температурное воздействие только в отдельных случаях приводило к уве-
Таблица 4
Основные характеристики образцов ДНК, выделенных из пыльцы шести видов растений
Параметры К Ш Ш х К Ш х П Ш х Т П П х К П х Т Т Т х К
Береза повислая
Конц-ция ДНК, нг/мкл (спектрофотометр) 7,379 5,988 9,672 5,843 6,842 3,764 8,103 4,103 11,733 6,176
Конц-ция ДНК, нг/мкл (флуориметр) 0,002 0,058 1,905 1,095 0,266 0,408 0,251 0,269 0,032 0,010
Ct 18S 22,83 21,16 15,86 16,43 17,31 17,65 18,48 17,28 24,74 24,31
Ct eEFlArt 34,65 34,73 34,74 34,53 32,17 34,36 34,44 35,58 34,94 35,12
Ель обыкновенная
Конц-ция ДНК, нг/мкл (спектрофотометр) 7,386 4,627 9,933 4,583 6,675 4,672 8,052 4,472 6,396 6,198
Конц-ция ДНК, нг/мкл (флуориметр) 0,018 1,215 2,040 0,375 0,331 0,257 1,415 0,147 0,003 0,015
Ct 18S 30,18 24,39 23,71 26,03 25,61 26,66 23,98 27,15 31,57 30,21
Ct eEFlArt 34,65 34,11 34,25 34,55 34,10 33,94 32,50 33,61 34,05 33,85
Сосна обыкновенная
Конц-ция ДНК, нг/мкл (спектрофотометр) 7,238 4,670 14,793 12,312 5,783 6,451 6,610 10,940 15,609 6,299
Конц-ция ДНК, нг/мкл (флуориметр) 0,068 0,690 4,250 4,100 0,402 1,605 0,252 0,760 0,018 0,005
Ct 18S 29,52 25,26 24,05 23,39 24,43 25,25 27,07 26,04 30,83 30,34
Ct eEFlArt 35,04 34,77 34,61 34,61 35,10 34,58 33,29 33,92 35,20 35,01
Дуб черешчатый
Конц-ция ДНК, нг/мкл (спектрофотометр) 5,174 3,766 4,105 4,013 7,887 3,921 3,812 3,477 7,423 1,175
Конц-ция ДНК, нг/мкл (флуориметр) 0,038 0,073 0,057 0,005 0,008 0,045 0,01 0,001 0,003 0,001
Ct 18S 24,55 21,92 21,24 23,63 23,94 25,68 25,47 27,18 28,79 27,83
Ct eEFlArt 34,30 34,03 34,73 34,65 35,10 35,27 35,06 35,26 34,91 35,22
Тюльпан гибридный
Конц-ция ДНК, нг/мкл (спектрофотометр) 7,144 6,656 6,657 6,980 6,416 6,400 33,387 3,996 7,256 9,214
Конц-ция ДНК, нг/мкл (флуориметр) 0,132 0,760 0,875 0,368 0,277 0,074 1,410 0,327 0,003 0,243
Ct 18S 23,06 19,61 18,90 20,11 20,79 21,47 18,62 20,03 23,56 21,57
Ct eEFlArt 35,18 34,36 34,73 29,86 34,06 32,40 34,41 33,88 34,39 35,52
Окончание таблицы 4
Параметры К Ш Ш х К Ш х П Ш X Т П П х К П х Т Т Т х К
Кукуруза сахарная
Конц-ция ДНК, нг/мкл (спектрофотометр) 5,260 0,967 6,446 4,208 2,623 1,742 7,246 2,697 3,968 10,749
Конц-ция ДНК, нг/мкл (флуориметр) 0,011 0,048 0,020 0,118 0,023 0,097 0,084 0,033 0,051 0,017
С 18Б 27,06 21,85 21,93 20,57 22,46 21,78 20,94 22,19 25,98 28,23
О eEF1Art 34,23 33,62 33,89 31,31 34,00 34,83 26,76 33,37 34,81 35,14
личению выхода ДНК, но только в сочетании с механическим повреждением.
Поскольку эффективность ПЦР варьирует в зависимости от праймеров и матрицы, эффективность комбинации праймер-матрица оценивается в эксперименте по титрованию с последовательными разведениями ДНК-матрицы для создания стандартной кривой изменения С; при каждом разведении. Для каждого из шести исследуемых видов были отобраны по 2-3 варианта предобработок, отобранных исходя из проанализированных ранее данных. Всего было взято 17 образцов для определения их эффективной концентрации по трем этапам последовательных разведений ДНК (1/3, 1/9, 1/27). При амплификации с прайме-
рами eEF1Art продукты амплификации получались во всех случаях только в образцах без разведения. Дальнейшее разведение (1/3, 1/9) приводило к снижению эффективности амплификации, а целевой ампликон наблюдали в 47% и 11,8% случаев соответственно, а при разведении в 1/27 специфической амплификации не наблюдалось вовсе, что подтверждает низкие, но рабочие концентрации ДНК в исследуемых образцах без разведения. С прай-мерами 18S во всех исследуемых образцах при всех разведениях были получены специфические продукты амплификации (табл. 5). Таким образом, в случае использования праймера 18S, рабочими концентрациями оказались даже самые небольшие количества ДНК (разве-
Таблица 5
Изменения значения С; в зависимости от серии разведений образцов ДНК при
использовании праймеров 18S
Вид растения Обработка О 188 1С О 188 1/3С О 188 1/9С С 188 1/27С
Береза повислая Ш х П 12,32 13,80 15,37 17,18
П х к 13,93 15,67 18,23 18,68
Дуб черешчатый Ш 18,37 19,55 21,52 22,92
Ш х П 20,21 21,49 22,96 24,89
Ш х к 17,79 19,52 20,83 21,85
Сосна обыкновенная П х Т 23,61 23,89 25,51 26,77
П 22,92 23,51 24,95 26,01
Т х к 27,23 27,80 27,84 29,44
Ель обыкновенная Ш 21,53 23,60 24,91 26,86
П 23,71 24,99 26,25 27,26
П х к 21,54 23,21 24,65 25,82
Окончание таблицы 5
Вид растения Обработка О Ш 1С о т 1/зс о т 1/9С С Ш 1/27С
Тюльпан гибридный Ш 15,51 17,64 19,66 20,71
Ш х К 15,38 16,70 18,52 23,43
П х к 15,51 15,06 17,95 19,78
Кукуруза сахарная Ш х П 16,19 17,51 19,46 20,95
П 18,28 19,97 21,50 23,21
П х к 16,90 18,44 19,81 21,58
дение 1/27), полученные из микроколичеств пыльцевого материала.
Метод количественного определения ДНК с помощью ПЦР-РВ основан на построении графика зависимости флуоресценции от числа циклов в логарифмической шкале [6]. По графикам линейной регрессии, построенным на основании зависимости порогового значения С от разведений образов ДНК, определены уравнения прямой значения R2 и количество ДНК для С; 30 (табл. 6).
Среди исследуемых образцов минимальные
концентрации ДНК, которые должны быть для С; = 30, отмечены у березы повислой, дуба че-решчатого и кукурузы сахарной. Остальные образцы также имели небольшие эффективные концентрации ДНК, способные амплифици-ровать целевой продукт. Несмотря на низкие концентрации, все образцы пригодны для ПЦР, а риск получения неспецифического продукта минимален. По значению коэффициента детерминации ^2) можно судить о достоверности полученных результатов. В нашем исследовании все разведения и все образцы имели
Вид растения Обработка Значение R2 Уравнение прямой Количество ДНК нг/мкл для О 30
Береза повислая Ш х П 0,9977 у = -3,3825х + 12,379 0,0055
П х к 0,9434 у = -3,5231х + 11,989 0,0060
Сосна обыкновенная П х Т 0,9425 у = -2,3258х + 23,003 0,0494
П 0,9771 у = -2,2445х + 23,202 0,0484
Т х к 0,8218 у = -1,4015х + 23,792 0,0119
Ель обыкновенная Ш 0,9933 у = -3,6286х + 21,936 0,1084
П 0,9971 у = -2,5002х + 22,289 0,0458
ПхК 0,9939 у = -2,9905х + 16,202 0,0099
Дуб черешчатый Ш 0,9917 у = -3,2751х + 14,524 0,0089
Ш х П 0,9908 у = -3,2545х + 12,42 0,0045
Ш х к 0,9862 у = -2,8284х + 14,458 0,0088
Тюльпан гибридный Ш 0,9788 у = -3,6948х + 15,295 0,0187
Ш х к 0,9046 у = -5,4376х + 14,301 0,0557
П х к 0,8451 у = -3,2886х + 15,213 0,0111
Таблица 6
Уравнения прямой значения R2 и количество ДНК для С; 30 по серии разведений образцов
ДНК с праймером 18S
Окончание таблицы 6
Вид растения Обработка Значение R2 Уравнение прямой Количество ДНК нг/мкл для Ct 30
Кукуруза сахарная Ш х П 0,9950 y = -3,4040x + 12,924 0,0066
П 0,9996 y = -3,4204x + 14,826 0,0107
П х к 0,9975 y = -3,2315x + 13,387 0,0059
значения R2, близкие к 1, что свидетельствует о достоверности полученных данных.
Заключение
При тестировании физических и химического методов воздействия на пыльцу шести видов растений выявлены наиболее оптимальные способы предобработок: гомогенизация с металлическими шариками и последующая обработка ксилолом; гомогенизация с металлическими шариками и растирание кварцевым песком; растирание с кварцевым песком и последующая обработка ксилолом. Показано, что механическое воздействие на пыльцу совместно с обработкой ксилолом положительно влияет на результат выделения ДНК, вероятно, из-за повреждения наружной оболочки пыльцы. Вместе с тем растирание с кварцевым песком увеличивает риск контаминации и может привести к потере части образца. Гомогенизация с металлическими шариками помогает минимизировать данные риски и значительно снизить временные затраты на подготовку образцов. При использовании ксилола необходимо полностью удалять его из препарата ДНК, чтобы избежать ингибирова-ния ПЦР. Перепады температуры не оказали положительного влияния для выделения ДНК из образцов пыльцы.
При определении концентрации ДНК методом спектрофотометрии, необходимо учитывать, что низкое содержание ДНК в образце приводит к высокой погрешности в точности измерений как концентрации, так и чистоты образца. Данные, полученные с помощью флуориметра, более достоверны при измерении образцов с низкой концентрацией ДНК. Результаты определения количества ДНК с помощью ПЦР-РВ позволяют учесть, как наличие примесей, оказывающих ингибирующее действие на ПЦР, так и получить информацию о минимальных эффективных концентрациях,
что важно при работе с микроколичествами биологического материала.
Работа выполнена при финансовой поддержке Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований, грант № Б22М-068.
Список использованных источников
1. Верчук, А. Н. Направления современной палинологии и перспективы использования баркодирования ДНК для дифференциации растений по пыльце / А. Н. Верчук, С. В. Ку-брак, А. В. Кильчевский // Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. тр. / Институт генетики и цитологии НАН Беларуси; редкол.: А. В. Кильчевский (гл. ред.) [и др.]. - Минск: Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, 2021. - Т. 31. - С. 134-146. - ISSN 1999-9127.
2. Suppression of the AvrBs1-specific hypersensitive response by the YopJ effector homolog AvrBsT from Xanthomonas depends on a SNF1-related kinase / R. Szczesny [et al.] // New Phytol. - 2010. - Vol. 187, № 4. - P. 1 058-1 074.
- doi: 10.1111/j.1469-8137.2010.03346.x.
3. ANT1 alleles and flavonoid accumulation in tomato / G. Schreiber [et al.] // Theor. Appl. Genet. - 2012. - Vol. 124, № 2. - P. 295-307.
4. Koetsier, G. A practical guide to analyzing nucleic acid concentration and purity with microvolume spectrophotometers / G. Koetsier, E. Cantor // New England Biolabs Technical Note.
- 2019. - Vol. 7. - P. 1-8.
5. Балановский, О. П. Методы измерения концентрации ДНК: совпадение относительных величин и различия абсолютных / О. П. Балановский , Ж. А. Кагазежева, М. В. Олькова // ВЕСТНИК РГМУ. - 2019, № 3. - С. 27-33.
6. Carr, A. C. Robust quantification of polymerase chain reactions using global fitting / A. C. Carr, S.D. Moore // PLoS ONE. - 2012. -Vol. 7, № 5. - P. e37640.
A. N. Viarchuk12, S. V. Kubrak1, A. V. Kilchevskiy1
COMPARATIVE STUDY OF POLLEN PRETREATMENT METHODS TO OBTAIN QUALITATIVE DNA SAMPLES
1State Scientific Institution "Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus" 27 Akademicheskaya St., 220072 Minsk, Republic of Belarus e-mail: a.n.verchuk@mail.ru 2State Institution
"Scientific and Practical Center of the State Forensic Examination Committee of the Republic of Belarus"
25 Filimonov St., 220114 Minsk, Republic of Belarus
The effectiveness of pretreatment methods in obtaining of DNA preparations isolated from the pollen of six plant species was evaluated. The quality and concentration of DNA samples were assessed using spectrophotometry, fluorimetry and real-time PCR. Several of the most universal methods that allow increasing the DNA yield in all the studied plants have been identified. A positive effect of homogenization with metal balls and subsequent treatment with xylene has been established; homogenization with metal balls and rubbing with quartz sand; rubbing with quartz sand and subsequent treatment with xylene.
Keywords: pollen DNA, DNA extraction, pollen pretreatment, real-time PCR, palynology.
Дата поступления в редакцию: 12 сентября 2022 г.
