CC BY
3
УДК 571.27
Наноантитело широкого спектра к гемагглютинину вируса гриппа А подтипа Н3
Д. В. Щебляков1, Д. В. Воронина1*, И. А. Фаворская1, И. Б. Есмагамбетов1, И. А. Алексеева1, А. И. Коробкова1, Е. И. Рябова1,2, А. А. Деркаев1, В. Ю. Кан1, А. Ш. Джаруллаева1, А. И. Тухватулин1, А. С. Банделюк1, М. М. Шмаров1, Д. Ю. Логунов1, А. С. Гинцбург1 Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России, Москва, 123098 Россия
2Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии — МВА
имени К.И. Скрябина, Москва, 109472 Россия
*E-mail: [email protected]
Поступила в редакцию 24.01.2024
Принята к печати 09.02.2024
DOI: 10.32607/actanaturae.27374
РЕФЕРАТ Моноклональные антитела (мАт) и их антигенсвязывающие фрагменты являются перспективным средством борьбы с инфекционными заболеваниями. Наноантитела (VHH), благодаря уникальной структуре своего паратопа, имеют ряд преимуществ перед классическими мАт, особенно в случае вирусных инфекций. Вирусы гриппа А (ВГА) остаются серьезной угрозой для общественного здравоохранения. Основным протективным и иммунодоминантным антигеном ВГА является белок гемагглютинин (НА). В данной работе выделены три наноантитела с широкой реактивностью (D9.2, E12.2 и D4.2) к различным штаммам гриппа H3N2, а также получены и охарактеризованы слитые с Fc-фрагментом VHH (VHH-Fc). Эта модификация улучшила связывающую способность VHH и позволила взаимодействовать с более широким спектром штаммов. Антитело D9.2-Fc продемонстрировало 100% защиту мышей от летального исхода in vivo. Кроме того, показано, что протективная активность D9.2-Fc обусловлена Fc-FcyR-взаимодействием. Представленные результаты говорят о том, что антитело D9.2-Fc может применяться как препарат, эффективный против инфекции, вызванной H3N2.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА наноантитела, однодоменные антитела, вирус гриппа, гемагглютинин, Fc-фрагмент. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВГА - вирус гриппа А; НА - гемагглютинин; VHH - вариабельный домен тяжелоцепочечных антител представителей семейства Camelidae, наноантитело; ИФА - иммуноферментный анализ; EC50 - полумаксимальная эффективная концентрация; ЛД50 - полулетальная доза; мАт - моноклональные антитела; Fc - кристаллизующийся фрагмент антитела; SDS-PAGE - электрофорез белков в полиакриламидном геле; HRP - пероксидаза хрена; ОП450 нм - оптическая плотность, измеренная при длине волны 450 нм; РТГА - реакция торможения гемагглютинации; РН - реакция нейтрализации; ДТТ - дитиотреитол; SEM - стандартная ошибка среднего.
ВВЕДЕНИЕ
Вирусы ^N2 являются одними из возбудителей ежегодных сезонных эпидемий гриппа; представители данного подтипа ВГА циркулируют в человеческой популяции с 1968 г. [1]. Сезонную инфекцию ^N2 в разные годы связывают с беспрецедентным увеличением количества госпитализаций пациентов с пневмонией в отделения интенсивной терапии [2], а также с высокой летальностью и частотой осложнений [3-5].
Вакцинация остается наиболее распространенной мерой борьбы с гриппом; однако ее эффективность сильно варьирует в различные эпидсезоны [6, 7].
Помимо низкой эффективности профилактических мер, активность современных противовирусных препаратов также снижается из-за растущей резистентности вируса [8, 9]. В связи с этим актуальна разработка новых универсальных противовирусных препаратов и терапевтических мАт против гриппа. Антигенсвязывающие фрагменты тяжелоцепочечных антител представителей семейства СатеШае (наноантитела, VHH) являются перспективным инструментом для ранней этиотропной терапии инфекционных заболеваний. VHH представляют собой полностью функциональный домен, который связывается с антигеном с высокой аффинностью
и специфичностью. Наноантитела также обладают выдающимися биохимическими характеристиками, такими, как хорошая растворимость и термическая/ pH стабильность [10]. Более того, VHH кодируются одним полипептидом, поэтому их можно легко модифицировать, например, слить с Fc IgG [11, 12].
Основной мишенью иммунного ответа является гликопротеин НА; на сегодняшний день известно 18 различных вариантов НА [13, 14], образующих две филогенетические группы [15]. НА состоит из двух субъединиц - НА1 и НА2, играющих разную роль в инициации инфекционного процесса. Описано несколько антител, специфичных к НА подтипа H3 или всей филогенетической группе 2, с различными механизмами действия [16-27]. Одним из таких механизмов, вовлеченных в ликвидацию гриппозной инфекции, являются Fc-опосредованные функции антител [28, 29].
В данной работе мы выделили три Н3-специфич-ных VHH, которые связываются с HA различных штаммов H3N2, выделенных в разные годы. Мы расширили спектр связывания и активность VHH путем их слияния с Fc-фрагментом. Наиболее перспективное антитело D9.2-Fc при профилактическом или терапевтическом введении защищает мышей от летальной инфекции, вызванной вирусом H3N2.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Клеточные линии
Клеточная линия CHO-S получена от Thermo Fisher Scientific, США (кат. № R80007), клеточные линии MDCK и Caco2 - из Российской коллекции клеточных культур позвоночных (Санкт-Петербург, Россия).
Таблица 1. Рекомбинантные белки НА, использованные в
Вирусы
Использовали адаптированный к мышам ВГА A/Aichi/2/68 (H3N2).
Рекомбинантные белки
Список использованных в работе антигенов представлен в табл. 1.
Иммунизация верблюда, получение иммунной библиотеки, селекция индивидуальных клонов, экспрессия и очистка VHH
Двугорбого верблюда пятикратно иммунизировали рекомбинантным НА H3 HK внутримышечно в дозе 100 мкг с гидроксидом алюминия в качестве адъю-ванта. Спустя 5 дней после последней иммунизации проводили отбор крови (50 мл) у животного для выделения фракции периферических лимфоцитов.
Конструирование библиотеки и специфический скрининг клонов проводили согласно [30] с использованием в качестве антигена инактивированного ВГА A/Aichi/2/68 (H3N2).
Экспрессию и очистку наноантител выполняли как описано ранее [30].
Получение конструкций VHH-Fc, экспрессия и очистка модифицированных VHH
С помощью ПЦР получены последовательности генов D9.2-Fc, E12.2-Fc и D4.2-Fc, кодирующих соответствующее наноантитело, слитое с шарнирным участком и Fc человеческого IgG1 (GenBank: JQ666008.1). Полученные гены клонировали в вектор для эукариотической экспрессии pCEP4 (Thermo Fisher Scientific, США). Аналогичным образом получали плазмиду pCEP4-D9.2-mG2a, кодирующую наноантитело D9.2 с шарнирным участком и Fc IgG2а мыши (GenBank: V00798.1). Для создания
исследованиях in vitro
Подтип Аббревиатура Описание Источник Кат. № № в базе данных GenBank или GISAID
H3 H3 HA1 Swiz HA1 A/Switzerland/9715293/2013 (H3N2) Sino Biological 40497-V08H1 EPI541659
H3 HA1 Vic HA1 A/Victoria/210/2009 (H3N2) Immune Technology IT-003-00421p EPI272062
H3 Swiz HA0 A/Switzerland/9715293/2013 (H3N2) Sino Biological 40497-VNAB EPI541659
H3 Aichi HA0 A/Aichi/2/1968 (H3N2) Sino Biological 11707-V08H AAA43178.1
H3 Perth HA0 A/Perth/16/2009 (H3N2) Sino Biological 40043-VNAB ACS71642.1
H3 Sing HA0 A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016 (H3N2) Xema - EPI1341068
H3 HK HA0 A/Hong Kong/45/2019 (H3N2) - - EPI1691930
H4 H4 HA0 A/mallard/Ohio/657/2002 (H4N6) Sino Biological 11714-V08H1 ABI47995.1
H7 H7 Anhui HA0 A/Anhui/1/2013 (H7N9) Sino Biological 40103-V08H EPI439507
H10 H10 HA0 A/Jiangxi-Donghu/346/2013 (H10N8) Sino Biological 40359-VNAB EPI497477
плазмидной конструкции pCEP4-D9.2-mG2a LALA-PG в плазмиду pCEP4-D9.2-mG2a с помощью сайт-направленного мутагенеза вносили точечные мутации [31]. Экспрессию и очистку антител проводили как описано в [32]. Чистоту антител определяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) по Лэммли в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях.
Аналогичным образом получали и анализировали контрольное VHH-Fc - SD36-Fc, соответствующее наноантителу (SD36) к стеблевому домену (субъединица НА2) НА Н3, аминокислотную последовательность которого брали согласно [33], слитому с Fc IgG1 человека.
Иммуноферментный анализ (ИФА)
ИФА выполняли согласно [32]. Для детекции антител в сыворотке крови верблюда использовали конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) anti-Llama IgG (Bethyl, A160-100P). HRP-конъюгированные вторичные антитела anti-c-Myc (ab1326, Abcam), anti-human IgG и anti-mouse IgG (A8667 и A9044, MilliporeSigma, США) использовали для выявления связавшихся с антигеном VHH и VHH-Fc с Fc-фрагментом человека и мыши соответственно. Значения полумаксимальной эффективной концентрации (EC50) рассчитывали с использованием четырехпараметрической логистической регрессии в GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc., США).
Для проведения конкурентного ИФА VHH последовательно разводили в блокирующем буфере со стартовой концентрацией 800 нМ (~10 мкг/мл). Конкурентные антитела в формате VHH-Fc (5 нМ) добавляли в равном объеме в лунки, содержащие VHH. Связавшиеся VHH-Fc детектировали с использованием anti-human IgG HRP (A8667, MilliporeSigma, США). Оптическую плотность (ОП450 ) в лунках, содержащих только VHH-Fc, принимали за 100% уровень сигнала. Ингибирование выражали как процент снижения ОП450 нм в лунках, содержащих смесь VHH/VHH-Fc, по сравнению с лунками без VHH.
Вестерн-блотинг
Белки разделяли с использованием 10% готовых гелей Mini-PROTEAN® (Bio-Rad, США) и переносили на нитроцеллюлозную мембрану Amersham™ Hybond™ P (Cytiva, США). После блокировки мембраны добавляли VHH-Fc в конечной концентрации 1 мкг/мл. Далее вносили антитела antihuman IgG HRP (A8667, MilliporeSigma, США). Иммунодетекцию проводили с использованием субстрата Clarity™ Western ECL (Bio-Rad).
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)
РТГА проводилась согласно [34].
Реакция нейтрализации (РН) вируса
РН в формате микронейтрализации в 96-луночных культуральных планшетах проводили как описано ранее [35]. Не нейтрализованные вирусные частицы выявляли с использованием поликлональных антител кролика к белку NP и anti-Rabbit IgG HRP вторичные антитела (Cat: 11675-T62 и SSA003, Sino Biological, Китай).
Способность антител ингибировать выход вирусного потомства из клетки и уменьшать размер бляшек оценивали с помощью описанных методик [16].
Оценка профилактической и терапевтической эффективности антител in vivo
Все эксперименты с животными, проведенные в соответствии с Директивой 2010/63/EU, рекомендациями FELASA [36], были одобрены этическим комитетом ФГБУ НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (протокол № 19 от 2022 г.).
Во всех экспериментах использовали SPF мышей линии BALB/c в возрасте 6-8 недель, полученных из НПП «Питомник лабораторных животных» ФИБХ РАН. Животных интраназально инфицировали 5 ЛД50 вируса A/Aichi/2/68 (H3N2), адаптированного к мышам. За животными наблюдали в течение 14 дней после заражения и ежедневно взвешивали, после чего эвтаназировали. Мышей, масса тела которых снизилась на 25% или более, эвтаназировали.
Подробная информация о схемах введения антител представлена в разделе «Результаты».
Выживаемость анализировали с использованием теста Мантела-Кокса в GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc., США).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для получения наноантител, связывающихся с НА подтипа Н3, двугорбого верблюда (Camelus bactrianus) иммунизировали рекомбинантным полноразмерным белком HA0 Н3 НК, ранее полученным в клетках CHO-S (рис. 1А). Мониторинг уровня НА-специфических антител в сыворотке крови верблюда осуществляли методом ИФА (рис. 1Б). Иммунная сыворотка, полученная после всего цикла иммунизаций, проявляла, в отличие от контрольной, специфическую активность в отношении белка H3 HK с титром связывания более 1:1 500 000. Фаговую библиотеку размером 1.4 х 107 конструировали из кДНК, кодирующей последовательности VHH, выделенные из В-клеток. VHH, специфичные для НА H3, были отобраны методом фагового дисплея в ходе трех раундов биопэннинга против инактивированного
А Иммунизация х5
С
О
Конструирование фаговой библиотеки
3 раунда биопэннинга
VHH
14 i \/ 1
3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
\
ж
102 103 104 105 106 Разведение сыворотки
107
D9.2 1.28 13.30 1.57 515.50 5.94
D4.2 588.00588.00 1.64 0.87 1.33
E12.2 0.98 5.61 1.51 2.76 1.20
5.06 588.00 588.00 588.00
1.90 588.00588.00588.00
72.93 0.44 588.00588.00
D9.2 D4.2 E12.2
ДО иммунизации ПОСЛЕ иммунизации
старт. библ.1 раунд 2 раунд 3 раунд
Д
ф
У У î^ûï-c и ¡^ ч 'jj о
à С à < £ ^ I
-- ^С ср о-. ^^ q^ ^
< i х i т х £
-1- m £ х
D9.2-Fc D4.2-Fc E12.2-Fc
Рис. 1. Схема получения VHH, оценка связывающей способности выбранных VHH и схема их модификации: А - стратегия иммунизации животного и отбора VHH; Б - ИФА, показывающий уровень H3-специфичных антител в сыворотке крови верблюда до и после пятой иммунизации; В - результаты поли-клонального фагового ИФА. BSA - бычий сывороточный альбумин, H3N2 - инак-тивированный ВГА A/Aichi/2/1968, старт. библ. - стартовая библиотека; Г - активность отобранных VHH в ИФА в отношении НА филогенетической группы 2 подтипов Н3, Н4, Н7 и Н10, выраженная в ЕС50 (нМ); Д - схема повышения эффективности VHH - модификация Fc-фрагментом
Б
В
Г
400
200
вируса A/Aichi/2/68 (H3N2) (рис. 1А). После третьего раунда пэннинга наблюдали значительное обогащение специфичными VHH к вирусу H3N2 (рис. 1В). Из полученной панели антител для дальнейших исследований отобрали три VHH (D4.2, D9.2 и E12.2), которые связывались с H3 НК (рис. 1А).
Иммунореактивность VHH анализировали с помощью ИФА на рекомбинантных HA, принадлежащих к подтипам Н3, Н4, Н7 и Н10 (рис. 1Г). Все VHH прочно связывались с иммобилизованными НА разных штаммов H3N2, включая изоляты 2009, 2013 и 2019 гг. Кроме того, E12.2 и D4.2 связывали НА штамма A/Aichi/2/1968. E12.2 также взаимодействовал с НА подтипа Н4. И D9.2, и E12.2 узнавали субъединицу HA1 белка HA. В свою очередь, D4.2 не связывался с HA1, но взаимодействовал с полноразмерными HA0.
Для того чтобы повысить активность выбранных наноантител посредством естественной ди-меризации, увеличить период полувыведения из сыворотки и добавить Fc-опосредованные эф-фекторные функции, мы модифицировали VHH Fc-фрагментом (рис. 1Д). Последовательности выбранных VHH были слиты с шарнирной областью и Fc-доменом IgG1 человека. Таким образом получали конструкции VHH-Fc: D9.2-Fc, D4.2-Fc и E12.2-Fc. Димеризацию VHH-Fc подтверждали с помощью электрофореза (рис. 2А). Полоса с молекулярной массой примерно 80-90 кДа в невосстанавливающих условиях соответствует димерной форме VHH-Fc.
Широту связывающей способности VHH-Fc изучали в непрямом ИФА с использованием рекомбинантных белков HA0 и HA1 разных штаммов ВГА (рис. 2Б). Введение Fc-фрагмента в структуру мо-
А
кДа 1
100 75
50 37
Д
5
4 ■ J3-
1 ■■ 0
2 3 4
5 6 7
D9.2-Fc 0.39 0.23 0.20 0.46 0.30 1.03 0.16 1.53 12.50 12.50
D4.2-Fc 12.50 12.50 0.02 0.04 0.03 0.13 0.14 0.06 12.50 12.50
E12.2-Fc 0.18 0.32 0.2 8 0.23 0.42 9.3 8 0.92 0.17 12.50 12.50
Ы У Ы IE -с Ф ^ ^ "5 °
§ > 5 u И .£ i I -с ^
£ £ < « ¡л ^
;; < ? ^ £ £ х
< I х I т х £
-1- m £
кДа
250 ■ 150 ■ 100 -75
50
D9.2-Fc
1 2 3 4 5 6
Ш
S ¡я —■ HA-тример
- ■ - HA-димер
ш *т HA0
кДа
75 50 37
25 20
1 2 3
D4.2-Fc
E12.2-Fc
рН 7.0 рН 6.0 рН 5.5 рН 5.0 рН 4.5
рН 4.5 + ДТТ
0 -1 -2 Концентрация, нМ (log)
Е
D9.2
(С 2 120 (С 2 120 •
от 100 от 100 .
-Fc 80 -Fc 80
H-H 60 * D9.2-Fc H-H 60
V е 40 • E12.2-Fc V е 40
ни а 20 SD36-Fc ни а 20
м 0 м 0
и i I i 100 101 102 103 и
0 -1 -2 Концентрация, нМ (log)
D4.2
0 -1 -2 Концентрация, нМ (log)
E12.2
D4.2-Fc D9.2-Fc E12.2-Fc SD36-Fc
120 ■■ 100 -80 ■ 60 ■ 40 20 0
E12.2-Fc
D9.2-Fc
SD36-Fc
Рис. 2. Получение VHH-Fc и их характеристика in vitro: А - SDS-PAGE очищенных VHH-Fc в невос-станавливающих (2-4) и восстанавливающих (5-7) условиях: маркер молекулярных масс (1), D9.2-Fc (2, 5), E12.2-Fc (3, 6) и D4.2-Fc (4, 7); Б - спектр связывания VHH-Fc с различными НА филогенетической группы 2 по результатам ИФА, выражен в ЕС50 (нМ);
В - вестерн-блот-анализ специфичности антител D9.2-Fc (1, 2), D4.2-Fc (3, 4) и E12.2-Fc (5, 6) к HA0 H3 Swiz в восстанавливающих (1-3) и невос-станавливающих (4-6) условиях;
Г - вестерн-блот-анализ специфичности VHH-Fc к НА1 или НА2 субъединице НА: инактивирован-ный ВГА A/Aichi/2/1968 в восстанавливающих условиях, детектированный D9.2-Fc (1), D4.2-Fc (2) или E12.2-Fc (3); Д - результаты непрямого ИФА, показывающие связывание VHH-Fc с H3 Aichi, обработанным трипсином-TPCK и инкубированным в буферах с различным pH или ДТТ; Е - конкурентный ИФА для определения эпи-топной специфичности VHH-Fc
Концентрация VHH, нМ
100 1 01 102 1 03 Концентрация VHH, нМ
100 1 01 102 1 03 Концентрация VHH, нМ
Б
5
В
лекулы VHH повышало эффективность связывания каждого выбранного VHH-Fc, но в разной степени. Наиболее заметное увеличение аффинности продемонстрировало D4.2-Fc: его значение ЕС50 для Н3 Swiz составило 22 пМ, в то время как ЕС50 мономера - 1642 пМ. Мономерная форма D9.2 едва могла связываться с Н3 АшЫ, в то время как ЕС50 Fc-слитой формы для этого штамма составила 0.46 нМ. И D9.2-Fc, и D4.2-Fc также получили способность связывать НА подтипа Н4. Наименее выражен-
ный эффект модификация Fc-фрагментом оказала на Е12.2.
Оценка специфичности VHH-Fc в вестерн-блот-анализе показала, что все отобранные антитела распознают как мономерную, так и ди- и тримерную формы НА (рис. 2В). Также с помощью иммуно-блотинга показано, что антитела D9.2-Fc и Е12.2-Fc специфически связываются с субъединицей НА1, в то время как D4.2-Fc - с субъединицей НА2 (рис. 2Г). Далее мы определяли, разрушают-
Л
CT-
и
0
<и га
m у
1
.о
со
100
50-
1—I-Г—Г i —I—I—I-1—I—I-1—Г
0 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Дни после инфицирования
Б о 120
о
Í 110 ал
5 100
го
н 90 о
80
с е
СО 70
1—I—I—I—Г—I—I—I—I—I—I—I—I—Г 0 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Дни после инфицирования
* D9.2-Fc -*- D4.2-Fc " E12.2-Fc
IgG1^30^n » SD36-Fc
Рис. 3. Профилактическая эффективность VHH-Fc in vivo: Л - кривые выживаемости, показано различие между контрольной и группой D9.2-Fc (**p = 0.002); Б - кривые изменения массы тела выживших мышей, данные представлены как средние значения ± SEM
0
ся ли распознаваемые нашими антителами эпитопы при снижении рН (рис. 2Д). Как известно, в процессе слияния мембран НА претерпевает значительные конформационные изменения, вызванные понижением рН в эндосомах клетки-хозяина. Несмотря на то, что субъединица НА1 не претерпевает таких серьезных перестроек, как НА2 [37, 38], активность связывающих HA1 антител (D9.2-Fc и E12.2-Fc) уменьшалась с уменьшением pH и полностью терялась при добавлении ДТТ, поскольку он удаляет субъединицу HA1 из HA. Однако D4.2-Fc одинаково связывалось с HA при различных значениях рН, как и с HA, обработанным ДТТ, что подтверждает нахождение его эпитопа именно в субъединице НА2.
По результатам конкурентного ИФА показано, что три отобранных клона VHH-Fc узнают различные не перекрывающиеся эпитопы на поверхности НА (рис. 2Е). Связывающее субъединицу НА2 антитело D4.2-Fc не конкурировало с контрольным VHH-Fc к НА2, SD36-Fc.
Протективную активность VHH-Fc in vivo изучали с использованием летальной мышиной модели (рис. 3). Мышам BALB/c интраназально вводили 1 мг/кг VHH-Fc за 1 ч до инфицирования. Животным контрольной группы вводили изотип IgG1 - нерелевантное VHH-Fc к S-белку вируса SARS-CoV-2; положительным контролем служило антитело SD36-Fc.
Антитело D9.2-Fc защищало 100% животных от летального исхода, потеря веса в данной группе в среднем не превышала 10%, к концу эксперимента вес мышей превышал изначальный. В свою очередь, ни E12.2-Fc, ни D4.2-Fc не показали протек-тивной активности, поэтому D9.2-Fc было выбрано для дальнейшего исследования in vivo.
Далее мы оценили профилактическую эффективность системного введения D9.2-Fc в отноше-
нии летальной инфекции H3N2 (рис. 4А,Б). Мышам вводили антитела в дозе 10 мг/кг внутрибрюшинно за 24 ч до заражения ВГА. У животных, получавших D9.2-Fc, не наблюдалось признаков заболевания, потеря веса отсутствовала или была незначительной, в то время как контрольные мыши пали спустя 7 суток.
Для определения терапевтической эффективности D9.2-Fc мышам вводили внутрибрюшинно 40 мг/кг D9.2-Fc спустя 24 ч после инфицирования (рис. 4В,Г). Мыши из контрольной группы пали к 9 дню после заражения. Из животных, получивших D9.2-Fc, 80% выжили; изменение массы тела не превышало 15%, к концу наблюдения вес всех мышей вернулся к начальным значениям.
Чтобы изучить механизм противовирусного действия D9.2-Fc, мы оценивали активность VHH-Fc в РТГА и различных вариантах РН. Данное антитело не тормозило гемагглютинирующую активность ВГА в реакции микронейтрализации, и в реакции нейтрализации бляшкообразования D9.2-Fc не обладало вируснейтрализующей активностью. При определении способности VHH-Fc ингибировать выход вируса из клетки антитело D9.2-Fc также не показало нейтрализующих свойств.
Поскольку D9.2-Fc не обладало способностью нейтрализовать ВГА, мы предположили, что эффективность данного антитела in vivo опосредована Fc-зависимыми эффекторными функциями. Поэтому были получены две дополнительные формы D9.2: VHH с Fc IgG2a мыши (D9.2-mG2a), а также D9.2-mG2a LALA-PG, в которой в Fc внесены мутации L234A, L235A и P329G (рис. 5). Комплекс мутаций LALA-PG ингибирует связывание с FcyR и C1q, в то время как взаимодействие с FcRn и стабильность Fc не затрагиваются [39]. С помощью ИФА показано, что эти мутации не влияют на связывание D9.2 с НА (рис. 5Б). Для оценки и сравнения
А
50-
50
TV
1—I—I—I—I—I ¥ I—I—I—I—I—I—I 0 12 3 4 56 78 910 11 12 13 14
Дни после инфицирования
"1—I—I—I—I—I—I—Г
"1—I—I—I—I
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Дни после инфицирования
го 120-
ог
н 110
ь
л
а
ч а 100н
н
з
и 90
от
80
с,
е 70
В
о н ь л а ч а н з и т
о с,
е В
120-, 110 100 90 80 70
Hiü ;
\
1—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I
0 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Дни после инфицирования
D9.2-Fc
IgG1-изотип
SD36-Fc
1—i—i—I—i—i—I—i—I—I—i—i—I—i 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Дни после инфицирования
D9.2-Fc
IgG1-изотип
SD36-Fc
Рис. 4. Эффективность D9.2-Fc in vivo в режиме профилактического (А и Б) и терапевтического (В и Г) введения: А и В - кривые выживаемости (***р = 0.0002, **p = 0.0021); Б и Г - кривые изменения массы тела выживших мышей, данные представлены как средние значения ± SЕМ
Б
0
В
0
протективных свойств полученных конструкций мышам вводили внутрибрюшинно антитела в дозе 5 мг/кг за 24 ч до заражения (рис. 5В,Г). Мыши (4 из 5), получавшие антитело D9.2-mG2a, были защищены от летального исхода, тогда как все мыши, получавшие антитело LALA-PG, пали к 6 дню, как и мыши контрольной группы. Следовательно, взаимодействие Fc-FcyR необходимо для защиты животных in vivo с помощью ненейтрализующего антитела D9.2.
ОБСУЖДЕНИЕ
В настоящее время одним из перспективных направлений в медицине является использование мАт для профилактики и лечения инфекций. В частности, наноантитела (VHH) рассматриваются как практичная и эффективная альтернатива классическим IgG. В последнее время активно изучается возможность использования VHH в качестве антибактериальных [40, 41] или противовирусных антител [32, 42, 43]. VHH, состоящие из одного полипептида, могут успешно использоваться для пассивной иммунизации в составе аденовирусных векторов [44, 45], аденоассоциированных вирусных векторов [46, 47] или мРНК [48]. В данной работе нами выделены три VHH: D9.2, D4.2 и E12.2, специфичные к разным
эпитопам молекулы НА вируса ^N2. D9.2 и Е12.2 связываются с субъединицей НА1, тогда как D4.2 взаимодействует с субъединицей НА2. Полученные VHH узнают НА различных штаммов ^N2. Кроме того, Е12.2 в формате мономера может связывать НА подтипа Н4.
Ранее сообщалось об усилении противовирусного действия VHH путем мультимеризации. Например, димеризация VHH Р2С5 приводила к 200-кратному увеличению нейтрализующей активности против SARS-CoV-2 [49], в то время как димер другого анти^ VHH Fu2 в 10 раз эффективнее нейтрализовал вирус в отличие от его мономерной формы [50]. Согласно данным Ни1Ше^ А. и соавт., можно получить 4000-кратное усиление активности VHH, что и было показано для бивалентной формы VHH, нейтрализующего респираторно-синцитиальный вирус [12]. Аналогичное наблюдение сделано для молекул VHH, слитых с Fc, так как через Fc-фрагмент происходит естественная димеризация [51, 52]. Более того, показано расширение спектра связывания некоторых VHH в результате мультимеризации. Например, противогриппозный VHH R1a-B6 в бивалентном формате приобрел способность нейтрализовать вирусы ^N2 [53], а G2.3, слитый с Fc-фрагментом, подтипы ^N2 и ^N2 [32]. Fc-
i—i—i—i—i—I 9 10 11 12 13 14
12 3 4 5 6 7 8
Дни после инфицирования
D9.2-mG2a D9.2-mG2a LALA-PG IgG1^3o™n
Т-1—I—I—г
012345678
Дни после инфицирования
1—I—I—I—I—I 9 10 11 1213 14
В
0
Рис. 5. Протективность D9.2 in vivo зависит от Fc-FcyR-взаимодействий. А - SDS-PAGE-анализ полученных конструкций в невосстанавливающих (1, 3) и восстанавливающих (2, 4) условиях: D9.2-mG2a (1, 2) и D9.2-mG2a LALA-PG (3, 4), маркер молекулярных масс (5). Б - результаты ИФА, отражающие связывание указанных антител с НА Н3 Aichi и H3 Sing. В - кривые выживаемости (различия между группами D9.2-mG2a и IgG1: *р = 0.0361; между группами D9.2-mG2a и LALA-PG - * p = 0.0116). Г - кривые изменения массы тела выживших мышей, представлены средние значения ± SEM
слитая форма VHH, активного в отношении SARS-CoV-1, демонстрировала перекрестную реактивность с SARS-CoV-2 [54]. Кроме того, модификация с помощью Fc позволяет задействовать эффекторные функции, включая активацию комплемента и/или антителозависимую клеточную цитотоксичность и фагоцитоз, которые имеют решающее значение при гриппозной инфекции [29]. Поэтому мы объединили наши VHH с Fc IgG1 человека, и опосредованная Fc димеризация привела к увеличению связывающей активности наряду с появлением способности реагировать с белком НА подтипа H4 (для VHH D9.2 и D4.2). Однако модификация E12.2 привела к минимальному (по сравнению с другими VHH) улучшению связывающей способности, что позволяет предположить, что потенциал увеличения эффективности и ширины спектра связывания антитела за счет мультимеризации зависит от его эпитопа.
Мы исследовали эффективность выбранных антител in vivo и показали, что D9.2-Fc при его интра-назальном введении за 1 ч до заражения полностью
защищает животных от летального исхода, тогда как D4.2-Fc и E12.2-Fc не смогли обеспечить защиту животных. Учитывая эти результаты, D9.2-Fc отобрали для дальнейшей оценки его профилактических и терапевтических свойств in vivo. При системном введении D9.2-Fc за 24 ч до заражения наблюдали 100% протективность данного антитела, в то время как при введении через сутки после инфицирования выживало 80% животных, получивших D9.2-Fc.
Мы оценили также вируснейтрализующую активность D9.2-Fc in vitro. Однако D9.2-Fc не обладает способностью нейтрализовать вирус H3N2, поэтому мы предположили, что его протективные свойства in vivo зависят от Fc-опосредованных эффектор-ных функций антитела. Как известно, Fc-фрагмент IgG1 человека способен связывать FcyR мыши [55]. Тем не менее, в определенных случаях подтип IgG играет решающую роль в протективности мАт на летальной мышиной модели. Например, показано, что связывающиеся с субъединицей НА2, а также и нацеленные на интерфейс HA варианты мАт
с константной областью тяжелой цепи IgG2a мыши улучшают защиту in vivo по сравнению с исходным субтипом IgG. Причиной этого является более высокое сродство Fc-фрагмента субтипа IgG2a к FcyR по сравнению с IgG1 [56, 57]. Несмотря на различия в представлениях ученых о том, до какой степени противовирусный эффект in vivo мАт, специфичных к НА1, зависит от Fc-опосредованных функций, опубликованы данные, подтверждающие по крайней мере частичную зависимость протективности анти-НА1 мАт от Fc-FcyR-взаимодействия [19, 25, 26, 58]. Мы сравнили протективные свойства in vivo D9.2, слитого с Fc IgG2a мыши (D9.2-mG2a), и D9.2 с мутациями LALA-PG (D9.2-mG2a LALA-PG) и показали, что D9.2-mG2a обеспечивало выживаемость 80% животных, в то время как вся группа мышей, получавших LALA-PG, пала. Таким образом установлено, что D9.2-Fc защищает животных благодаря Fc-FcyR-взаимодействию.
ВЫВОДЫ
В данной работе мы идентифицировали три клона VHH, узнающие неперекрывающиеся эпитопы в структуре НА и активные в отношении НА различных штаммов вируса гриппа H3N2. Мы расширили спектр их связывания, модифицировав VHH Fc-фрагментом. Из трех отобранных VHH-Fc только D9.2-Fc продемонстрировало протективную активность in vivo на мышиной модели гриппозной инфекции. Несмотря на отсутствие нейтрализующей активности в отношении ВГА H3N2, D9.2-Fc способно обеспечивать эффективную защиту in vivo с помощью Fc-опосредованных механизмов. •
Исследование выполнено в рамках Государственного задания Министерства здравоохранения Российской Федерации № 121031800132-4.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Cockburn W.C., Delon P.J., Ferreira W. // Bull W. Hlth Organ. 1969. V. 41. P. 345-348.
2. Burrell A., Huckson S., Pilcher D.V. // N. Engl. J. Med. 2018. V. 378. № 22. P. 2138-2139.
3. Huang S.Y., Huang W.C., Chen Y.C., Tsai C.Y., Lee I.K. // Am. J. Trop. Med. Hygiene. 2017. V. 97. № 6. P. 1945-1951.
4. Nateghian A., Gouya M.M., Nabavi M., Soltani H., Mousavi S.V., Agah E., Erfani H., Parchami P., Dadras M., Robinson J.L. // J. Clin. Virol. 2020. V. 124. P. 104281.
5. Tekin S., Keske S., Alan S., Batirel A., Karakoc C., Tasdelen-Fisgin N., Simsek-Yavuz S., Isler B., Aydin M., Kapmaz M., et al. // Inter. J. Infect. Dis. 2019. V. 81. P. 6-9.
6. Darvishian M., van den Heuvel E.R., Bissielo A., Castilla J., Cohen C., Englund H., Gefenaite G., Huang W.T., la Bastide-van Gemert S., Martinez-Baz I., et al. // Lancet Respir. Med. 2017. V. 5. № 3. P. 200-211.
7. Lewnard J.A., Cobey S. // Vaccines (Basel). 2018. V. 6. № 2. P. 28.
8. Hayden F.G., Sugaya N., Hirotsu N., Lee N., de Jong M.D., Hurt A.C., Ishida T., Sekino H., Yamada K., Portsmouth S., et al. // N. Eng. J. Med. 2018. V. 379. № 10. P. 913-923.
9. Stephenson I., Democratis J., Lackenby A., McNally T., Smith J., Pareek M., Ellis J., Bermingham A., Nicholson K., Zambon M. // Clin. Infect. Dis. 2009. V. 48. № 4. P. 389-396.
10. Huang K., Ying T., Wu Y. // Viruses. 2022. V. 14. № 6. P. 1162.
11. Hoefman S., Ottevaere I., Baumeister J., Sargentini-Maier M.L. // Antibodies. 2015. V. 4. № 3. P. 141-156.
12. Hultberg A., Temperton N.J., Rosseels V., Koenders M., Gonzalez-Pajuelo M., Schepens B., Ibanez L.I., Vanlandschoot P., Schillemans J., Saunders M., et al. // PLoS One. 2011. V. 6. № 4. P. e17665.
13. Ferrara F., Molesti E., Temperton N. // Future Virol. 2015. V. 10. № 6. P. 731-749.
14. Wu Y., Wu Y., Tefsen B., Shi Y., Gao G.F. // Trends Microbiol. 2014. V. 22. № 4. P. 183-191.
15. Tong S., Zhu X., Li Y., Shi M., Zhang J., Bourgeois M., Yang H., Chen X., Recuenco S., Gomez J., et al. // PLoS Pathog. 2013. V. 9. № 10. P. e1003657.
16. Bangaru S., Lang S., Schotsaert M., Vanderven H.A., Zhu X., Kose N., Bombardi R., Finn J.A., Kent S.J., Gilchuk P., et al. // Cell. 2019. V. 177. № 5. P. 1136-1152.e18.
17. Benjamin E., Wang W., McAuliffe J.M., Palmer-Hill F.J., Kallewaard N.L., Chen Z., Suzich J.A., Blair W.S., Jin H., Zhu Q. // J. Virol. 2014. V. 88. № 12. P. 6743-6750.
18. DiLillo D.J., Palese P., Wilson P.C., Ravetch J.V. // J. Clin. Invest. 2016. V. 126. № 2. P. 605-610.
19. Henry Dunand C.J., Leon P.E., Huang M., Choi A., Chromikova V., Ho I.Y., Tan G.S., Cruz J., Hirsh A., Zheng N.Y., et al. // Cell Host Microbe. 2016. V. 19. № 6. P. 800-813.
20. Iba Y., Fujii Y., Ohshima N., Sumida T., Kubota-Koketsu R., Ikeda M., Wakiyama M., Shirouzu M., Okada J., Okuno Y., et al. // J. Virol. 2014. V. 88. № 13. P. 7130-7144.
21. Kubota-Koketsu R., Mizuta H., Oshita M., Ideno S., Yunoki M., Kuhara M., Yamamoto N., Okuno Y., Ikuta K. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009. V. 387. № 1. P. 180-185.
22. Lee J., Boutz D.R., Chromikova V., Joyce M.G., Vollmers C., Leung K., Horton A.P., DeKosky B.J., Lee C.H., Lavinder J.J., et al. // Nat. Med. 2016. V. 22. № 12. P. 1456-1464.
23. McCarthy K.R., Watanabe A., Kuraoka M., Do K.T., McGee C.E., Sempowski G.D., Kepler T.B., Schmidt A.G., Kelsoe G., Harrison S.C. // Immunity. 2018. V. 48. № 1. P. 174-184.e9.
24. Son S., Ahn S. Bin, Kim G., Jang Y., Ko C., Kim M., Kim S.J. // Antiviral Res. 2023. V. 213. P. 105591.
25. Tan G.S., Leon P.E., Albrecht R.A., Margine I., Hirsh A., Bahl J., Krammer F. // PLoS Pathog. 2016. V. 12. № 4. P. e1005578.
26. Watanabe A., McCarthy K.R., Kuraoka M., Schmidt A.G., Adachi Y., Onodera T., Tonouchi K., Caradonna T.M., Bajic G., Song S., et al. // Cell. 2019. V. 177. № 5. P. 1124-1135.e16.
27. Yoon A., Yi K.S., Chang S.Y., Kim S.H., Song M., Choi J.A., Bourgeois M., Hossain M.J., Chen L.M., Donis R.O., et al. // PLoS One. 2015. V. 10. № 10. P. e0141312.
28. Gao R., Sheng Z., Sreenivasan C.C., Wang D., Li F. // Viruses. 2020. V. 12. № 3. P. 276.
29. Boudreau C.M., Alter G. // Front. Immunol. 2019. V. 10. P. 440.
30. Voronina D.V., Shcheblyakov D.V., Esmagambetov I.B., Derkaev A.A., Popova O., Shcherbinin D.N. // Acta Naturae. 2021. V. 13. № 4. P. 33-41.
31. Saunders K.O. // Front. Immunol. 2019. V. 10. P. 1296.
32. Voronina D.V., Shcheblyakov D.V., Favorskaya I.A., Esmagambetov I.B., Dzharullaeva A.S., Tukhvatulin A.I., Zubkova O.V., Popova O., Kan V.Y., Bandelyuk A.S., et al. // Viruses. 2022. V. 14. № 11. P. 2485.
33. Laursen N.S., Friesen R.H.E., Zhu X., Jongeneelen M., Blokland S., Vermond J., van Eijgen A., Tang C., van Diepen
H., Obmolova G., et al. // Science. 2018. V. 362. № 6414. P. 598-602.
34. Kaverin N.V., Rudneva I.A., Govorkova E.A., Timofeeva T.A., Shilov A.A., Kochergin-Nikitsky K.S., Krylov P.S., Webster R.G. // J. Virol. 2007. V. 81. № 23. P. 12911-12917.
35. He W., Mullarkey C.E., Miller M.S. // Methods. 2015. V. 90. P. 95-100.
36. Mähler M., Berar M., Feinstein R., Gallagher A., Illgen-Wilcke B., Pritchett-Corning K., Raspa M. // Lab. Anim. 2014. V. 48. № 3. P. 178-192.
37. Benhaim M.A., Prasad V.M., Garcia N.K., Guttman M., Lee K.K. // Sci. Adv. 2020. V. 6. № 18. P. eaaz8822.
38. Benton D.J., Gamblin S.J., Rosenthal P.B., Skehel J.J. // Nature. 2020. V. 583. № 7814. P. 150-153.
39. Mausser E., Nador E., Politch J.A., Pauly M.R., Marathe J.G., Moench T.R., Zeitlin L., Whaley K.J., Anderson D.J. // PLoS One. 2023. V. 18. № 3. P. e0282147.
40. Cawez F., Mercuri P.S., Morales-Yänez F.J., Maalouf R., Vandevenne M., Kerff F., Guerin V., Mainil J., Thiry D., Saulmont M., et al. // Antimicrob. Agents Chemother. 2023. V. 67. № 4. P. e01499-22.
41. Kumar S., Athreya A., Gulati A., Nair R.M., Mahendran
I., Ranjan R., Penmatsa A. // Commun. Biol. 2021. V. 4. № 1. P. 836.
42. Esmagambetov I.B., Shcheblyakov D.V., Egorova D.A., Voronina O.L., Derkaev A.A., Voronina D.V., Popova O., Ryabova E.I., Shcherbinin D.N., Aksenova E.I., et al. // Acta Naturae. 2021. V. 13. № 4. P. 53-63.
43. Wang R., Zhang H., Peng C., Shi J., Zhang H., Gong R. // Virol. Sin. 2021. V. 36. № 6. P. 1600-1610.
44. Burmistrova D.A., Tillib S.V., Shcheblyakov D.V., Dolzhikova I.V., Shcherbinin D.N., Zubkova O.V., Ivanova T.I., Tukhvatulin A.I., Shmarov M.M., Logunov D.Y., et al. // PLoS One. 2016. V. 11. № 3. P. e0150958.
45. Tutykhina I.L., Sedova E.S., Gribova I.Y., Ivanova T.I.,
Vasilev L.A., Rutovskaya M.V., Lysenko A.A., Shmarov M.M., Logunov D.Y., Naroditsky B.S., et al. // Antiviral Res. 2013. V. 97. № 3. P. 318-328.
46. Derkaev A.A., Ryabova E.I., Esmagambetov I.B., Shcheblyakov D.V., Godakova S.A., Vinogradova I.D., Noskov A.N., Logunov D.Y., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L. // Front Microbiol. 2022. V. 13. P. 960937.
47. Esmagambetov I.B., Ryabova E.I., Derkaev A.A., Shcheblyakov D.V., Dolzhikova I.V., Favorskaya I.A., Grousova D.M., Dovgiy M.A., Prokofiev V.V., Gosudarev A.I., et al. // Front. Immunol. 2023. V. 14. P. 1129245.
48. Panova E.A., Kleymenov D.A., Shcheblyakov D.V., Bykonia E.N., Mazunina E.P., Dzharullaeva A.S., Zolotar A.N., Derkaev A.A., Esmagambetov I.B., Sorokin I.I., et al. // Front. Immunol. 2023. V. 14. P. 1098302.
49. Favorskaya I.A., Shcheblyakov D.V., Esmagambetov I.B., Dolzhikova I.V., Alekseeva I.A., Korobkova A.I., Voronina D.V., Ryabova E.I., Derkaev A.A., Kovyrshina A.V., et al. // Front Immunol. 2022. V. 13. P. 822159.
50. Hanke L., Das H., Sheward D.J., Perez Vidakovics L., Urgard E., Moliner-Morro A., Kim C., Karl V., Pankow A., Smith N.L., et al. // Nat. Commun. 2022. V. 13. № 1. P. 155.
51. Liu H., Wu L., Liu B., Xu K., Lei W., Deng J., Rong X., Du P., Wang L., Wang D., et al. // Cell Rep. Med. 2023. V. 4. № 2. P. 100918.
52. Schepens B., van Schie L., Nerinckx W., Roose K., Fijalkowska D., Devos S., Weyts W., De Cae S., Vanmarcke S., Lonigro C., et al. // Sci. Transl. Med. 2021. V. 13. №. 621. P. eabi7826.
53. Hufton S.E., Risley P., Ball C.R., Major D., Engelhardt O.G., Poole S. // PLoS One. 2014. V. 9. № 8. P. e103294.
54. Wrapp D., De Vlieger D., Corbett K.S., Torres G.M., Wang N., van Breedam W., Roose K., van Schie L., Hoffmann M., Pohlmann S., et al. // Cell. 2020. V. 181. № 5. P. 1004-1015.e15.
55. Derebe M.G., Nanjunda R.K., Gilliland G.L., Lacy E.R., Chiu M.L. // Immunol. Lett. 2018. V. 197. P. 1-8.
56. DiLillo D.J., Tan G.S., Palese P.R.J.V. // Nat. Med. 2014. V. 20. № 2. P. 143-151.
57. Bruhns P. // Blood. 2012. V. 119. № 24. P. 5640-5649.
58. Ko Y.A., Yu Y.H., Wu Y.F., Tseng Y.C., Chen C.L., Goh K.S., Liao H.Y., Chen T.H., Cheng T.J.R., Yang A.S., et al. // PLoS Pathog. 2021. V. 17. № 8. P. e1009724.
