CC BY
33
УДК 612.017.1:616-097
Наноантитела — потенциальный терапевтический препарат против лихорадки Эбола
И. Б. Есмагамбетов1*, Д. В. Щебляков1, Д. А. Егорова1, О. Л. Воронина1, А. А. Деркаев1, Д. В. Воронина1, О. Попова1, Е. И. Рябова1, Д. Н. Щербинин1, Е. И. Аксенова1, А. Н. Семенов1, М. С. Кунда1, Н. Н. Рыжова1, О. В. Зубкова1, А. И. Тухватулин1, Д. Ю. Логунов1, Б. С. Народицкий1, С. В. Борисевич2, А. Л. Гинцбург1
Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва, 123098 Россия
2«48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской
Федерации, Сергиев Посад, 141306, Россия
*E-mail: esmagambetovib@gmail.com
Поступила в редакцию 18.06.2021
Принята к печати 14.07.2021
DOI: 10.32607/actanaturae.11487
РЕФЕРАТ Лихорадка Эбола - высококонтагиозное вирусное заболевание, при котором смертность достигает 90%. В настоящее время в мире не существует зарегистрированных средств специфической терапии заболевания, вызываемого вирусом Эбола. Однако в качестве перспективных противовирусных препаратов рассматриваются моноклональные антитела, обладающие высокой специфичностью к поверхностному гликопротеину вируса Эбола (EBOV GP). За последнее десятилетие широкое применение в диагностике и терапии различных инфекционных и неинфекционных заболеваний получили на-ноантитела (однодоменные антитела, неканонические антитела семейства верблюдовых). В настоящей работе при помощи иммунизации альпака (Vicugna pacos) рекомбинантным аденовирусом человека 5-го серотипа, экспрессирующим ген EBOV GP (Ad5-GP), впервые получена панель наноантител, специфичных к EBOV GP. Наиболее перспективный клон наноантитела aEv6 был выбран для дальнейшего изучения на основе данных по специфической активности, констант аффинности и вируснейтрализу-ющей активности в отношении рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, псевдотипирован-ного EBOV GP (rVSV-GP). С целью улучшения фармакокинетических и иммунологических свойств клон aEv6 был модифицирован Fc-фрагментом человеческого IgG1 (aEv6-Fc). Для оценки протективной активности химерной молекулы aEv6-Fc разработана летальная модель инфекции мышей rVSV-GP при помощи иммуносупрессии. Испытания на летальной модели продемонстрировали защитные свойства наноантитела aEv6-Fc. Таким образом, полученное нами наноантитело и его модификация обладают потенциальными защитными свойствами против вируса лихорадки Эбола.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА вирус лихорадки Эбола, наноантитела, рекомбинантный аденовирусный вектор, ре-комбинантный вирус везикулярного стоматита.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ БВВЭ - болезнь, вызванная вирусом Эбола; БОЕ - бляшкообразующая единица; ИФА - иммуноферментный анализ; ТМБ - тетраметилбензидин; ФСБ-Т - фосфатно-солевой буфер с полисорбатом 20; HRP - пероксидаза хрена; PBMC - мононуклеарные клетки периферической крови; PRNT50 - 50% вируснейтрализующая доза антитела.
ВВЕДЕНИЕ
Вирус лихорадки Эбола, относящийся к семейству Filoviridae, роду Ebolavirus, вызывает геморрагическую лихорадку у людей и нечеловеческих приматов [1]. Род ЕЪоШугтив состоит из шести видов: Заир эбо-лавирус (EBOV), Судан эболавирус (SUDV), Бундибуге
эболавирус (BDBV), эболавирус Тайского леса (TAFV), Рестон эболавирус (RESTV) и Бомбали эболавирус (BOMV) [2]. Болезнь, вызванная вирусом Эбола (БВВЭ), сопровождается 60-90% летальностью [3, 4]. Последние вспышки БВВЭ зарегистрированы в Конго (2018 г.), Уганде (2019 г.), в Конго и Гвинее (2021 г.) [5].
Коктейли из моноклональных антител, специфичных к EBOV GP, могут обеспечить полную защиту нечеловеческих приматов от БВВЭ, и некоторые из них (Zmapp, MAb114, REGN-EB3 и GamEMab) в настоящее время проходят клинические испытания [6-8]. В предыдущем исследовании [9] с помощью иммунизации мышей Ad5-GP (компонент Б вакцины ГамЭвак Комби [10]) нам удалось получить два моноклональных антитела мыши (2c8 и 6g3), способных защищать от БВВЭ.
Помимо моноклональных антител, в последние 20 лет интерес вызывает возможность применения наноантител (неканонические формы моноклональ-ных антител семейства Верблюдовых), а также их модификаций в терапии инфекционных заболеваний [11, 12]. Однако существует лишь несколько исследований, направленных на разработку препаратов для лечения БВВЭ на основе наноантител [13-15]. Основные преимущества наноантител - относительная простая технология получения, а также способность связываться с труднодоступными антигенными эпитопами [13-15]. В то же время недостатки наноантител связаны с их быстрым выведением почками и отсутствием самостоятельной эффекторной функции у Fc-фрагмента. Для улучшения фармакокинетических и эффекторных свойств наноантител [12], а также для увеличения их авидности за счет димеризации молекулы необходима модификация Fc-фрагментом IgG.
Нами получено наноантитело, обладающее про-тективной активностью в отношении рекомби-нантного вируса везикулярного стоматита, псев-дотипированного гликопротеином вируса Эбола (rVSV-GP). С этой целью мы использовали технологию, включающую: (1) иммунизацию альпака Ad5-GP; (2) получение панели наноантител, специфичных к гликопротеину вируса Эбола (EBOV GP);
(3) отбор клона с оптимальной активностью in vitro;
(4) модификацию выбранного клона для улучшения его фармакокинетических и иммунологических свойств; (5) оценку защитной активности выбранного клона in vivo.
В результате работы нами отобран и охарактеризован наиболее перспективный клон наноантитела -aEv6. Протективность модифицированной формы этого клона (aEv6-Fc) оценивали на модели летальной инфекции иммуносупрессивных мышей rVSV-GP. Для создания иммуносупрессии мышам вводили дексаметазон и циклофосфамид. Такой подход использовали ранее [16, 17] для оценки активности противовирусных препаратов, а также для изучения факторов патогенеза вируса лихорадки Эбола. В нашем исследовании показана способность антитела aEv6-Fc защищать мышей от летальной инфекции
rVSV-GP, что может говорить о его потенциальной противовирусной активности в отношении вируса Эбола.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Вирусы и антигены
Ad5-GP - рекомбинантный дефектный по репликации аденовирус, полученный, как описано ранее [10, 18], и экспрессирующий ген GP Zaire ebolavirus (изолят Ebola virus/H. sapiens-wt/SLE/2014/ Makona-G3735.1, GenBank Accession Number KM233056).
rVSV-GP - рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, полученный, как описано ранее [10], и экспрессирующий ген GP Zaire ebolavirus (изолят Ebola virus/H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-G3735.1, GenBank Accession Number KM233056).
Рекомбинантный белок GP Zaire ebolavirus (штамм H. sapiens-wt/GIN/2014/Kissidougou-C15) -Sino Biological, Китай, кат. № 40442-V02H.
Фаг-помощник M13 Hyperphage M13 K07ApIII -Progen, Германия, кат. № PRHYPE.
Клеточные линии
Клеточная линия CHO-S - Thermo Fisher Scientific, США, кат. № R80007.
Клеточные линии Vero E6 (ATCC CRL 1586) и GMK-AH-l(D) (CVCL_L878) получены из Российской коллекции клеточных культур позвоночных (Санкт-Петербург, Россия, https://www. incras.ru/institut/struktura/ckp/rossijskaja-kollekcija-kletochnyh-kultur/).
Иммунизация альпака, получение иммунной библиотеки, экспрессия и очистка наноантител
Здорового 4-летнего самца альпака (Vicugna pacos) использовали для иммунизации и дальнейшего отбора крови. Животное предоставлено фермой «Российские Альпаки» (Походкино, Россия).
Ad5-GP (108 БОЕ) вводили внутримышечно, трехкратно, с трехнедельными интервалами, без адъю-вантов. Рекомбинантный белок EBOV GP (200 мкг) вводили внутримышечно спустя 3 недели после последней инъекции Ad5-GP вместе с неполным адъ-ювантом Фрейнда.
Отбор крови (150 мл) проводили спустя 5 дней после последней иммунизации, образцы крови помещали в стерильные вакуумные пробирки с гепарином лития.
Выделение мРНК, ПЦР, конструирование библиотеки и специфический скрининг выполняли согласно [19] с использованием рекомбинантного белка EBOV GP в качестве антигена.
Экспрессию и очистку наноантител осуществляли как описано ранее [19].
Секвенирование генов наноантител методом NGS
Ампликоны генов наноантител получали с помощью специальных праймеров [19] и очищали набором MinElute PCR Purification Kit (QiaGen, Нидерланды). Библиотеки готовили по протоколу для случайных фрагментов (Roche, Швейцария). Размер и качество библиотек контролировали с помощью набора Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent, США). Секвенирование выполняли с использованием набора GS Junior Titanium Sequencing Kit и GS Junior + Series XL + Kit GS Junior + Series XL (Roche) в соответствии с рекомендациями производителя.
Полную обработку ампликонов проводили с помощью программного обеспечения 454 Sequencing System Software v.3.0 и собственных программ.
Измерение констант аффинности наноантител
Константы аффинности наноантител определяли с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на приборе Biacore 3000 (GE Healthcare BioSciences AB, Швеция) как описано ранее [19] с ре-комбинантным белком EBOV GP
Получение модифицированной формы aEv6-Fc
Нуклеотидную последовательность гена aEv6-Fc, синтезированную в ЗАО «Евроген» (Россия), клонировали в плазмиду pShuttle-CMV (Stratagene, США) и получили таким образом плазмиду pShuttle-CMV-aEv6Fc.
Культуру клеток CHO-S (Thermo Fisher Scientific) транзиентно трансфицировали плазмидой pShuttle-CMV-aEv6Fc с использованием системы CHO Gro (Mirus Bio, США) в соответствии с протоколом производителя. Клетки культивировали в колбах Эрленмейера при 125 об/мин, 5% СО2, 80% влажности, 37°C, спустя 24 ч снижали температуру до 32°C и продолжали культивировать в течение 10 дней. Начиная с 3-го дня добавляли подпитки Cell boosts 7a (2%), 7b (0.2%) (HyClone, США) и 0.5% CHO Bioreactor Feed (Sigma, США) 1 раз в день. По истечении 10 дней культивирования культуральную жидкость осветляли центрифугированием при 5000 g. Антитело очищали аффинной хроматографией на системе AKTA start (Cytiva, Швеция), используя колонки MAbSelect SuRe 1 мл (Cytiva, Швеция) в соответствии с протоколом производителя. Дополнительную очистку и замену буфера проводили на колонке ХК 26/100 (Cytiva) с сорбентом Superdex 200 pg (Cytiva).
Получение контрольного антитела MAb114
Для получения контрольного антитела MAb114 использовали аминокислотную последовательность,
опубликованную Corti и соавт. [7]. Нуклеотидные последовательности, кодирующие тяжелую и легкую цепь антитела MAb114, синтезировали в ЗАО «Евроген», клонировали в плазмиду pShuttle-CMV (Stratagene). Полученными плазмидами pShuttle-CMV-Mab114HC и pShuttle-CMV-Mab114LC трансфицировали клеточную линию CHO-S. Процедуры трансфекции клеток и очистки антитела проводили как описано в предыдущем пункте.
Непрямой ИФА
Непрямой ИФА проводили согласно [9]. Конъюги-рованные с пероксидазой хрена (HRP) антитела - antihuman IgG (Sigma, cat. no A8667), anti-Myc-tag (Abcam, 1326) и anti-Llama IgG (Bethyl, A160-100P), использовали для обнаружения наноантител и антител (aEv6-Fc и MAb114) в сыворотке альпака соответственно.
Реакция нейтрализации вируса
Реакцию нейтрализации вируса проводили согласно [9], используя модель инфекции клеток Vero E6 вирусом rVSV-GP.
Изучение фармакокинетики aEv6-Fc
Трем интактным макакам резусам (Macaca mulatta), полученным из НИИ медицинской приматологии (Веселое, Россия), внутривенно вводили 10 мг/кг aEv6-Fc со скоростью инфузии 10 мл/ч. Образцы крови отбирали до инфузии и спустя 1, 4, 8, 16, 24, 48, 96 ч и через 7, 14, 21 дней после инфузии. Концентрацию aEv6-Fc в крови оценивали методом непрямого ИФА с использованием различных разведений aEv6-Fc в качестве стандартов. Фармакокинетические параметры рассчитывали с использованием программы Microsoft Excel и PKSolver softs.
Пассивная иммунизация и оценка протективной активности
Самки мышей BALB/c (возраст 4-6 недель, вес 18-20 г) предоставлены Пущинским филиалом Института биоорганической химии РАН (Пущино, Россия). Мышам для иммуносупрессии вводили дексаметазон (1 раз в день внутрибрюшинная инъекция 10 мг/кг/день за 10 дней до инъекции вируса) [17] и циклофосфамид (однократная внутрибрюшинная инъекция 150 мг/кг за 5 дней до введения вируса). rVSV-GP вводили внутривенно в дозе 109 БОЕ/мышь, антитело aEv6-Fc - внутривенно, в дозе 50 мг/кг. Подопытных животных наблюдали и взвешивали каждый день в течение всего эксперимента. Результаты выражали в процентах выживаемости мышей в различные временные точки.
Более детально схема эксперимента изложена в разделе «Результаты».
Определение титров rVSV-GP в органах и тканях инфицированных мышей
Органы и ткани инфицированных мышей выделяли в стерильных условиях. Кусочки органов (20 мг) гомогенизировали в 1 мл DMEM. Суспензию осветляли центрифугированием при 2000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбирали для определения титров rVSV-GP в реакции вирус-нейтрализации.
Статистический анализ
Данные анализировали в EXCEL 2010 и STATISTICA 7.0. Для оценки межгрупповых различий титров антител и выживаемости использовали U-тест Манна-Уитни и тест Гехана-Уилкоксона с уровнем значимости 0.05.
Соблюдение стандартов работы с животными
Экспериментальные процедуры проводили в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованному National Institutes of Health (NIH Publication #85-23, revised 1996), и с Национальным стандартом Российской Федерации ГОСТ Р 53434-2009. Все эксперименты были одобрены этическим комитетом ФГБУ НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (протокол № 27 от 2020 г.). Все лица, использовавшие животных или ухаживающих за ними в ходе исследований, проходили ежегодное обучение в соответствии с требованиями IACUC.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Получение панели наноантител, специфичных к EBOV GP
Панель наноантител, специфичных к EBOV GP, получали путем иммунизации альпака (V. pacos) рекомбинантным аденовирусом Ad5-GP и реком-бинантным белком GP в соответствии со схемой, представленной на рис. 1А.
На 5-й день после бустирующей иммунизации отбирали 150 мл крови альпака и выделяли сыворотку, в которой определяли титр антител, специфичных к EBOV GP, для подтверждения эффективности иммунизации. Титр антител к EBOV GP определен в разведении 1 : 16000, что свидетельствует о высоком иммунном ответе у иммунизированного животного (рис. 1Б).
Для создания иммунной библиотеки наноантител отбирали мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC). Нуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельные фрагменты наноантител, полученных из PBMC альпака, клонировали в фаг-мидный вектор pHEN1. Специфичные антитела отбирали методом фагового дисплея как описано в [19].
Результаты отбора анализировали с помощью поликлонального фаг-ИФА (рис. 1В). В дальнейшей работе использовали библиотеку второго раунда селекции с целью предотвращения умень-
Таблица 1. Результаты анализа библиотек наноантител при помощи NGS
Клон Частоты считываний, % Фактор амплификации CDR3 (аминокислотная последовательность)
Стартовая библиотека Библиотека после селекции
aEvl 0.33 18.89 57.79024 NVQLGRFGILE
aEv2 0.31 7.81 24.89199 KSRRYGVDYW
aEv3 0.01 3.70 282.6006 AAVNSWAVYSLSRNYDY
aEv4 0.05 2.01 38.44366 AMRRGGVSYTYW
aEv5 0.01 3.71 283.5078 AVRSERYTRRYDH
aEv6 0.01 0.42 31.75288 YVDARYGALHTYRS
aEv7 0.08 1.60 20.41256 NAHYWSRD
aEv8 0.01 3.38 258.5591 KVTRGDFLGRRTDY
aEv9 0.01 0.20 14.96921 AARPGSYSRDARRYD
aEvlO 0.03 2.08 79.609 NAQLSRSVLWGRY
aEvll 0.01 1.29 98.88753 QQKYAGRLY
aEv12 0.05 0.97 18.59811 AADRVLTSSSRNWDY
aEv13 0.01 1.54 117.9393 YARRRTYLAAY
aEv14 0.01 0.61 46.72209 AAGRSSMGLLDATDWRH
aEv15 0.01 0.85 65.3202 NSRGRHDWNRYN
aEv16 0.01 0.42 32.20649 AASPRTSMLVVGNVDH
aEv17 0.01 1.39 106.5989 NAQSHFFGSNY
aEv18 0.05 0.14 2.721675 AARPEYYSGTASYVSTSYDY
Другие 98.954 48.99 0.494915
5
i 3
Q
О
Альпака (4 года, самец)
Иммунизация Ad5-GP
I
21
Бустирующая
иммунизация Отбор крови рекомбинантным GP
/Ч\ I
т
42
63
I
68
Q
О
Стартовая 1 раунд 2 раунд 3 раунд фаговая селекции селекции селекции библиотека
Разведение сыворотки
Рис. 1. Схема иммунизации альпака (V. pacos) для получения панели наноантител (Л), определение титра антител к EBOV GP в сыворотке иммунизированного альпака (Б) и результаты поликлонального фаг-ИФА (б). Б - в иммунологические планшеты сорбировали 100 мкл (1 мкг/мл) EBOV GP (H. sapiens-wt/GIN/2014/Kissidougou-C15). На следующий день лунки промывали 5 раз 0.1% ФСБ-Т, а затем блокировали 5% раствором обезжиренного молока в ФСБ-Т. В лунки добавляли различные разведения сыворотки в ФСБ-Т и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. После промывки добавляли антитела 5х anti-Llama IgG (Bethyl, A160-100P) в блокирующем буфере (1 : 5000) и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. После пятикратной промывки добавляли субстрат ТМБ и оценивали результаты. б - в иммунологические планшеты сорбировали 100 мкл EBOV GP (1 мкг/мл) (H. sapiens-wt/ GIN/2014/Kissidougou-C15). На следующий день лунки промывали пятикратно 0.1% ФСБ-Т, а затем блокировали 5% раствором обезжиренного молока, разведенным в ФСБ-Т. Фаговые частицы (1011) с каждого этапа отбора добавляли в ФСБ-Т в лунки и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Затем после 5-кратной промывки не связавшихся фагов добавляли антитела - HRP-конъюгированные anti-M13 phage IgG (Abcam, Великобритания), разведенные в блокирующем буфере в соотношении 1 : 500, и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. После 5-кратной промывки добавляли субстрат ТМБ и оценивали результаты
Б
б
4
2
0
шения разнообразия наноантител. Нуклеотидные последовательности наноантител идентифицировали при помощи секвенирования нового поколения (NGS).
В результате анализа идентифицировали 18 клонов (аЕ1-18) (табл. 1). Фактор амплификации 16 клонов после двух раундов селекции составил более 20, что указывает на их специфическое накопление
в результате связывания с EBOV ОР. В то же время анализ библиотеки показал, что отобранные клоны составляют около 51% всех ампликонов библиотеки после селекции, тогда как в стартовой библиотеке число этих клонов было менее 1% (рис. 2А и 2Б).
По результатам непрямого ИФА с EBOV ОР в качестве антигена отобрали четыре клона (aEv2, aEv3, aEv6, aEv7) как наиболее специфичные (рис. 2В).
Л
Стартовая библиотека
Библиотека после селекции
Q
О
1
0.8 0.6 0.4 0.2 0
L
Ц
aEvl aEv2 aEv3 :. aEv4 aEv5 aEv6 aEv7 aEv8 aEv9 aEv10 aEv1l aEv12 aEv13 aEv14 aEv15 aEv16 aEv17 aEv18 ■ Другие
EBOV GP
Другие 48.99%
aEv5 3.71%
aEv16 0.42%
aEv15
0.85% aEv14 0.61%
■ BSA
■LLLLILLLLlL
rNm-^lO-OI^COOO-— rNCO-^lO-OI^CO v v v v v v v v v 1 1 1 1 1 1 1 1 1 EEEEEEEEEvvvvvvvvv aaaaaaaaaEEEEEEEEE
aaaaaaaaa
Клоны наноантител, 10 мкг/мл
Б
В
Рис. 2. Результаты сравнительного анализа соотношения специфических наноантител в библиотеках до и после отбора. А - процент клонов в стартовой библиотеке. Б - процент клонов в библиотеке после селекции. В - скрининг отобранных клонов в непрямом ИФА. aEv1-18 - клоны отобранных наноантител, EBOV GP - рекомбинант-ный EBOV GP, BSA - бычий сывороточный альбумин (отрицательный контроль)
На иммунологические планшеты сорбировали 100 мкл (1 мкг/мл) EBOV GP (Н. sapiens-wt/ GIN/2014/Kissidougou-C15). На следующий день лунки промывали 5 раз 0.1% ФСБ-Т, затем блокировали 5% обезжиренным молоком, растворенным в ФСБ-Т. Образцы отобранных клонов (10 мкг/мл) добавляли в лунки и инкубировали при 37°С в блокирующем буфере в течение 1 ч. После пятикратной промывки добавляли HRP-конъюгированные anti-Myc-tag IgG-антитела в блокирующем буфере (1 : 5000) на 1 ч при 37°С. После пятикратной промывки добавляли субстрат ТМБ и оценивали результаты.
Изучение отобранных клонов в реакции непрямого ИФА, поверхностного плазмонного резонанса и реакции нейтрализации вируса
Иммунологические свойства отобранных клонов aEv2, aEv3, aEv6 и aEv7 изучали с помощью ИФА, поверхностного плазмонного резонанса SPR (измерение констант аффинности, KD) и реакции нейтрализации в условиях in vitro; основные результаты представлены на рис. 3.
По результатам непрямого ИФА рабочие титры составляли не менее 1 мкг/мл, 500 нг/мл, 500 нг/мл и 50 нг/мл для клонов aEv2, aEv3, aEv7 и aEv6 соответственно (рис. 3A). Самые низкие значения
Q
О
1.2 1
0.8 0.6 0.4 0.2
100
- aEv2 aEv3
- aEv6
- aEv7
10 000 5000 1000 500 100 50 10 Концентрация антител, нг/мл
я и н а
m
о
m
а р
Ю
о о
X
3
я л
ю
е и н е
3
л
н
е м
>
80
60
40
20
aEv2 aEv3 aEv6 aEv7
10 000 2000
400
200
100
Концентрация антител, нг/мл
Рис. 3. Изучение активности отобранных клонов наноантител с помощью непрямого ИФА (Л) и вируснейтра-лизующей активности (Б). Л - на иммунологические планшеты сорбировали 100 мкл (1 мкг/мл) EBOV GP (H. sapiens-wt/GIN/2014/Kissidougou-C15). На следующий день лунки 5 раз промывали 0.1% ФСБ-Т, затем блокировали 5% обезжиренным молоком, растворенным в ФСБ-Т. Разведения антител в блокирующем буфере добавляли в лунки и инкубировали при 37°C в течение 1 ч. После 5-кратной промывки добавляли HRP-конъюгированные anti-Myc-tag IgG-антитела в блокирующем буфере (1 : 5000) и выдерживали 1 ч при 37°C. После 5-кратной промывки добавляли субстрат ТМБ и оценивали результаты. Б - rVSV-GP (H. sapiens-wt/ SLE/2014/Makona-G3735.1) разводили в буфере (10 мМ Трис-HCl pH 7.5, 1 мМ EDTA, 10% сахарозы). Смесь равных объемов VHH и исходного вируса инкубировали в течение 1 ч при 37°C, затем переносили на культураль-ные планшеты с монослоем клеточной линии Vero E6. После адсорбции комплекса антитела+вирус (120 мин при 37°C) клетки покрывали слоем агара. Планшеты инкубировали при 37°C, 5% CO2 в течение 48 ч. Результаты оценивали путем подсчета количества бляшек под микроскопом. Для определения бляшкообразующих единиц (БОЕ) использовали следующую формулу: БОЕ/мл = (среднее число Б0Е/0.2 мл) х фактор разведения
Б
0
0
5
Кв имел клон aEv6 (1.87 х 10-10 М), далее клоны aEv3 и aEv7 со значениями Кв = 5.53 х 10-8 и 2.4 х 10-8 М соответственно. Клон aEv2 имел наиболее низкое значение Кв = 7.13 х 10-7 М. Как показано на рис. 3Б, клоны aEv2, aEv3, aEv7 не обладали значительной вируснейтрализующей активностью против rVSV-GP, в то время как клон aEv6 показал 50% вируснейтрализующую активность при концентрации не менее 400 нг/мл. Согласно полученным результатам для дальнейшего изучения был выбран клон aEv6, имевший наиболее высокую аффинность к EBOV ОР, а также наибольший вируснейтрализу-ющий потенциал против rVSV-GP
Получение клона aEv6, модифицированного Fс-фрагментом человека и изучение его
свойств
Отобранный клон aEv6 был модифицирован Fc-фрагментом человека для улучшения его им-
мунологических и фармакокинетических свойств. Полученное антитело aEv6-Fc показало специфичную активность к EBOV ОР штамма H. sаpiens-wt/ GIN/2014/Kissidougou-C15, сравнимую с активно-
стью антитела МАЬ114, взятого в качестве контроля (рис. 4А).
Далее в реакции вирусной нейтрализации с использованием rVSV-GP сравнили антитела aEv6-Fc и МАЬ114. Показано, что антитело aEv6-Fc обладает значительно большей вируснейтрализующей активностью, чем антитело МАЬ114 (рис. 4Б).
Изучение фармакокинетических свойств aEv6-Fc на макаках резусах показало, что среднее время циркуляции антител в крови после инъекции составляет не менее 7 дней (данные не представлены), что гораздо больше, чем у не модифицированных наноантител, имеющих низкую молекулярную массу [20, 21].
Оценка протективной активности антитела aEv6-Fc на модели летальной инфекции мышей rVSV-GP
На последнем этапе оценивали защитные свойства aEv6-Fc на модели летальной инфекции мышей rVSV-GP Несмотря на то что наиболее репрезентативной является модель нечеловеческих приматов, финансовые и этические соображения вынуждают
3.5
3
2.5
5
о 2
п
O 1.5
1
0.5
0
100
MAb114/EBOV GP aEv6-Fc/EBOV GP
у
i
ra m O m ra a
<u >
o
X
3
к С
ю
T г i
Т-I->-I-г-
16 000 4000 1000 250 62.5 15.6 3.9 1
Концентрация антител, нг/мл
80
60
40
20
0
80 000 16 000 8000 4000 1000 200 40 Концентрация антител, нг/мл
Рис. 4. Сравнение специфичной активности антител aEv6-Fc и MAb114 к EBOV GP штамма H. sapiens-wt/ GIN/2014/Kissidougou-C15 (Л) и вируснейтрализующей активности против rVSV-GP (Б). Л - на иммунологические планшеты сорбировали 100 мкл (1 мкг/мл) EBOV GP (H. sapiens-wt/GIN/2014/ Kissidougou-C15). На следующий день лунки промывали 5 раз 0.1% ФСБ-Т, затем блокировали 5% обезжиренным молоком, растворенным в ФСБ-Т. В лунки добавляли различные разведения антител aEv6-Fc и MAb114 и инкубировали при 37°C в блокирующем буфере в течение 1 ч. После 5-кратной промывки добавляли HRP-конъюгированные anti-human IgG-антитела (A8667, Sigma) в блокирующем буфере (1 : 5000) и выдерживали в течение 1 ч при 37°C. После 5-кратной промывки добавляли субстрат ТМБ и оценивали результаты. Б - разведения rVSV-GP делали в буфере (10 мМ Трис-HCl pH 7.5, 1 мМ EDTA, 10% сахарозы). Смесь равных объемов антител и вируса инкубировали в течение 1 ч при 37°C, а затем переносили на культуральные планшеты с монослоем клеточной линии Vero E6. После адсорбции комплекса антитело+вирус (120 мин при 37°C) клетки покрывали слоем агара. Планшеты инкубировали при 37°C, 5% CO2 в течение 48 ч. Результаты оценивали путем подсчета количества бляшек под микроскопом. Для определения бляшкообразующих единиц (БОЕ) использовали следующую формулу: БОЕ/мл = (среднее число Б0Е/0.2 мл) х фактор разведения
разрабатывать новые модели, основанные на более мелких животных [22]. Более того, все работы с филовирусами необходимо выполнять при четвертом уровне биобезопасности [22]. Все это делает обоснованной замену природного вируса лихорадки Эбола рекомбинантным аналогом, более безопасным для человека. Таким аналогом может служить рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, псевдотипированный белком EBOV GP (гУ^^-GP). Поскольку rVSV-GP не является патогенным для мышей, перед инъекцией вируса мышам вводили дексаметазон и циклофосфамид для иммуно-супрессии [17]. Эксперимент проводили следующим образом: отбирали пять групп мышей по шесть особей в каждой. Животных из всех групп подвергали иммуносупрессивной терапии в течение 10 дней, после чего мышам из первой группы проводили инъекцию вируса, а животным из других групп вводили смесь вирус+антитело.
На 11 день мышам внутривенно вводили 109 БОЕ rVSV-GP как в отсутствие, так и в присутствии антитела aEv6-Fc, предынкубированного с вирусом в течение 1 ч при 37°С; смешанного с вирусом непо-
средственно перед инъекцией; введенного внутривенно спустя 2 ч после инфицирования; введенного внутривенно спустя 5 ч после инфицирования. Схема эксперимента показана на рис. 5А.
За мышами наблюдали в течение 5 дней после заражения. Мыши контрольной группы, которым не вводили aEv6-Fc, погибли на второй день после заражения. Введение aEv6-Fc спустя 5 ч после заражения также не смогло предотвратить или отсрочить гибель животных. Введение антител спустя 2 ч после заражения обеспечило выживание двух из шести мышей. Предынкубация и смешивание aEv6-Fc с rVSV-GP полностью защитило животных. Результаты эксперимента представлены на рис. 5Б.
Для более детальной оценки защитных свойств антитела aEv6-Fc против rVSV-GP на модели инфекции у мышей определяли число БОЕ в крови и органах зараженных мышей. Мыши были поделены на три группы по четыре особи в каждой. Первая группа иммуносупрессированных мышей оставалась интактной. Мыши второй группы были заражены rVSV-GP. Третья группа была заражена rVSV-GP, предварительно нейтрализованным
Б
Л
30 мышей
Введение циклофосфамида
rVSV-GP+
rVSV-GP+ aEv6-Fc aEV6-FC смешанный
предынкубированный
rVSV-GP
aEv6-Fc
aEv6-Fc 5 ч после 2 ч после rVSV-GP
rVSV-GP
Дни до инъекции rVSV-GP
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1
% ь,
т
с
о
м
е
а
в
и
ж
ы
В
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
30 мышей разбили на 5 групп (по 6 мышей в группе) =*=
rVSV-GP
rVSV-GP+aEv6-Fc (предынкубация) а rVSV-GP+aEv6-Fc (смешанный) - - rVSV-GP+aEv6-Fc (2 ч после инфекции) rVSV-GP+aEv6-Fc (5 ч после инфекции)
0 12 3 4 5
Дни после инфекции
Рис. 5. Оценка протективной активности антитела aEv6-Fc. А - схема эксперимента; Б - результаты эксперимента. А - rVSV-GP - рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, псевдотипированный гликопротеином вируса Эбола (Н. sapiens-wf/SLE/2014/Makona-G3735.1); aEv6-Fc - антитело aEv6-Fc.
Б - rVSV-GP - мыши, инфицированные rVSV-GP (109 БОЕ/мышь); rVSV+aEv6 (предынкубация) - мыши, получившие rVSV-GP (109 БОЕ/мышь), ранее смешанный и инкубированный с 300 мкл антитела aEv6-Fc (3 мг/мл); rVSV-GP+aEv6-Fc (смешанный) - мыши, получившие rVSV-GP (109 БОЕ/мышь), предварительно смешанный с 300 мкл aEv6-Fc (3 мг/мл); rVSV-GP+aEv6-Fc (2 ч после заражения) - мыши, получившие rVSV-GP (109 БОЕ/мышь), а затем, спустя 2 ч, 300 мкл aEv6-Fc (3 мг/мл); rVSV-GP+aEv6-Fc (5 ч после заражения) -мыши, получившие rVSV-GP (109 БОЕ/мышь), а затем, спустя 5 ч, 300 мкл aEv6-Fc (3 мг/мл)
Б
aEv6-Fc (900 мкг). Затем, спустя 1 и 2 дня, определяли присутствие rVSV-GP в мозгу, печени, почках, селезенке, кишечнике и крови зараженных мышей, используя культуру клеток Vero E6. Результаты эксперимента показаны в табл. 2. В тканях и органах иммуносупрессированных мышей, не зараженных rVSV-GP (отрицательный контроль), признаки присутствия вируса не обнаружены. У животных второй группы (иммуносупрессированные мыши,
инфицированные rVSV-GP) вирус обнаружен в крови, печени, почках, селезенке в первый день после его введения. На второй день титр гУ^У-ОР стал значительно больше в крови и печени, в то время как в органах и тканях мышей, которым rVSV-GP вводили вместе с антителами aEv6-Fc (группа 3), вирус не был обнаружен.
Таким образом, экспериментальные данные подтверждают, что антитело aEv6-Fc обладает ви-
Таблица 2. Титры rVSV-GP в некоторых органах инфицированных мышей
Группа День после введения Средние титры rVSV-GP (две мыши), БОЕ/20 мкг органа
кровь мозг печень почка селезенка кишечник
Интактные иммуносупрессированные мыши 1 - - - - - -
2 - - - - - -
Иммуносупрессированные мыши, инфицированные rVSV-GP 1 4.44 х 105 - 6.67 х 104 4.14 х 104 3.65 х 104 -
2 1.7 х 107 - 1.27 х 105 2.44 х 104 3.44 х 104 -
Иммуносупрессированные мыши, получившие rVSV-GP+aEv6-Fc 1 - - - - - -
2 - - - - - -
Таблица 3. Иммуногенные свойства клонов aEv2, aEv3, aEv6 и aEv7
Клон Титры к EBOV GP, нг/мл Константа аффинности (KD) к EBOV GP, М Вируснейтрализующая активность в отношении rVSV-GP (PRNT50)
aEv2 Не менее 1000 7.13 х 10-7 Не вируснейтрализующий
aEv3 Не менее 500 5.53 х 10-8 Не менее 400 нг/мл
aEv6 Не менее 50 1.87 х 10-10 Не вируснейтрализующий
aEv7 Не менее 500 2.4 х 10-8 Не вируснейтрализующий
руснейтрализующей и протективной активностью в отношении летальной инфекции rVSV-GP у им-муносупрессированных мышей.
ОБСУЖДЕНИЕ
В нашей работе впервые показана возможность получения наноантитела, слитого с Fc-фрагментом IgG1 человека, которое обладает вируснейтрализу-ющей и защитной активностью против вируса везикулярного стоматита, псевдотипированного белком GP вируса лихорадки Эбола. Кроме того, при помощи иммунизации альпака рекомбинантным аденовирусом Ad5-GP впервые получена панель нано-антител, специфичных к EBOV GP. Эту стратегию иммунизации успешно использовали ранее для получения моноклональных антител с защитной активностью против вируса лихорадки Эбола [9]. Таким образом получены четыре клона наноантител (aEv2, aEv3, aEv6 и aEv7), обладающих характеристиками, приведенными в табл. 3.
Анализируя данные, представленные в табл. 3, можно заключить, что результаты трех независимых экспериментов полностью коррелируют друг с другом. Согласно полученным данным, клон aEv6 показал наибольшую аффинность к EBOV GP и ви-руснейтрализующую активность в отношении rVSV-GP, поэтому этот клон был выбран для дальнейшего изучения.
Далее клон aEv6 модифицировали Fc-фрагментом IgG1 человека, увеличивающим массу наноан-
титела до 40-45 кДа, димеризующим молекулу, а также позволяющим взаимодействовать с Fc-рецепторами на поверхности клеток [21]. Эта модификация увеличила циркуляцию антитела aEv6-Fc в крови нечеловеческих приматов до 7 дней, тогда как циркуляция первичных наноантител составляет, как правило, несколько часов [20, 23, 24]. Мы использовали нечеловеческих приматов, исходя из наибольшей гомологии их иммунной системы и Fc-рецепторов с человеческими. Улучшение фар-макокинетики антител является важным аспектом, позволяющим значительно уменьшить дозу и количество инъекций препарата при терапии вирусных заболеваний. Кроме того, модифицированное антитело aEv6-Fc имело сопоставимый уровень специфической активности в ИФА с антителом МАЬ114 (рис. 4А), обладающим протективной активностью в отношении вируса лихорадки Эбола [25], и более выраженную вируснейтрализующую активность по сравнению с МАЬ114 (рис. 4Б), а также по сравнению с немодифицированной Fc-фрагментом формой антитела.
Последним этапом исследования стало изучение протективной активности aEv6-Fc на модели летальной инфекции мышей вирусом везикулярного стоматита, псевдотипированного ЕВОУ ОР. Эта модель разработана нами во избежание необходимости работы с природным вирусом лихорадки Эбола и использования нечеловеческих приматов (дорогостоящего и нежелательного по этическим со-
ображениям [22]). Доза препарата (50 мг/кг) была выбрана, исходя из опубликованных данных [25]. Экспериментально показано, что антитело aEv6-Fc полностью защищало мышей при предынкуба-ции с вирусом и при смешивании с вирусом перед инъекцией, а также обладало 30% защитой, если его вводили не позже 2 ч после заражения вирусом. Таким образом, антитело aEv6-Fc может проявлять протективную активность в режиме профилактики и экстренной терапии непосредственно после предполагаемого контакта с возбудителем. Детальный анализ накопления rVSV-GP в органах и тканях инфицированных мышей выявил наибольшее количество вируса в крови, печени, почках и селезенке, тогда как в мозге и кишечнике rVSV-GP не обнаружен. Полученные данные могут быть связаны с псевдотипированием вируса везикулярного стоматита гликопротеином EBOV GP, который, по-видимому, изменяет тропизм вируса. Изменения в тропизме rVSV, в свою очередь, могут объяснять накопление вируса в почках, селезенке, особенно
в печени и крови, что, по-видимому, вызывает полиорганную недостаточность и гибель животных на второй день после инфицирования. Важно отметить, что в органах и тканях мышей, инфицированных rVSV-GP, инкубированным с aEv6-Fc, вирус не обнаружили, что еще раз подтверждает вирус-нейтрализующую и протективную активность антитела.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В данном исследовании впервые показана принципиальная возможность получения наноантител и их модификаций, специфичных к поверхностному гли-копротеину вируса лихорадки Эбола и обладающих выраженной противовирусной активностью в летальной модели мышей, инфицированных псевдо-типированным вирусом везикулярного стоматита.
Мы благодарим А.И. Смирнова (владелец фермы
«Русские Альпаки») за предоставление альпака для нашего исследования.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Siragam V., Wong G., Qiu X. // Zool. Res. 2018. V. 39. № 1. P. 15-24.
2. Zhu W., Banadyga L., Emeterio K., Wong G., Qiu X. // Viruses. 2019. V. 11. № 11. e999.
3. Qiu X., Fernando L., Melito P.L., Audet J., Feldmann H., Kobinger G., Alimonti J.B., Jones S.M. // PLoS Neglected Tropical Diseases. 2012. V. 6. № 3. e1575
4. Qiu X., Audet J., Wong G., Pillet S., Bello A., Cabral T., Strong J.E., Plummer F., Corbett C.R., Alimonti J.B., et al. // Sci. Transl. Med. 2012. V. 4. № 138. P. 138ra81.
5. ECDC. Ebola outbreak in the Democratic Republic of the Congo - ongoing. URL: https://ecdc.europa.eu/en/ebola-virus-disease-outbreak-democratic-republic-congo-ongoing (accessed August 9, 2019).
6. Moekotte A.L., Huson M.A., van der Ende A.J., Agnandji S.T., Huizenga E., Goorhuis A., Grobusch M.P. // Expert Opin. Investigat. Drugs. 2016. V. 25. № 11. P 1325-1335.
7. Corti D., Misasi J., Mulangu S., Stanley D.A., Kanekiyo M., Wollen S., Ploquin A., Doria-Rose N.A., Staupe R.P., Bailey M., et al. // Science. 2016. V. 351. P. 1339-1342. Suppl. Materials.
8. Hoenen T., Groseth A., Feldmann H. // Nat. Rev. Microbiol. 2019. V. 17. № 10. P. 593-606.
9. Shcheblyakov D., Esmagambetov I., Simakin P., Kostina L., Kozlov A., Tsibezov V., Grebennikova T., Chifanov D., Rumyantseva I., Boyarskaya N., et al. // Antiviral Res. 2019. V. 172. e104617.
10. Dolzhikova I.V., Zubkova O.V., Tukhvatulin A.I., Dzharullaeva A.S., Tukhvatulina N.M., Shcheblyakov D.V., Shmarov M., Tokarskaya E., Simakova Y., Egorova D., et al. // Human Vaccines Immunotherapeutics. 2017. V. 13. № 3. P. 613-620.
11. Wu Y., Jiang S., Ying T. // Front. Immunol. 2017. V. 8. P. e1802.
12. De Vlieger D., Ballegeer M., Rossey I., Schepens B., Saelens X. // Antibodies (Basel). 2018. V. 8. № 1. e1.
13. Liu J.L., Shriver-Lake L.C, Anderson G.P., Zabetakis D.,
Goldman E.R. // Microbial Cell Factories. 2017. V. 16. № 1. e223.
14. Darling T.L., Sherwood L.J., Hayhurst A. // Front. Immunol. 2017. V. 8. e1197.
15. Sherwood L.J., Hayhurst A. // PLoS One. 2013. V. 8. № 4. e61232.
16. Brunton B., Rogers K., Phillips E.K., Brouillette R.B., Bouls R., Butler N.S., Maury W. // PLoS Neglected Tropical Diseases. 2019. V. 13. № 6. e0006983.
17. Marathe B.M., Mostafa H.H., Vogel P., Pascua P.N.Q., Jones J.C., Russell C.J., Webby R.J., Govorkova E.A. // Antiviral Res. 2017. V. 148. P. 20-31.
18. Shcherbinin D.N., Esmagambetov I.B., Noskov A.N., Selyaninov Y.O., Tutykhina I.L., Shmarov M.M., Logunov D.Yu., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L., et al. // Acta Naturae. 2014. V. 6. № 1. P. 76-84.
19. Godakova S.A., Noskov A.N., Vinogradova I.D., Ugriumova G.A., Solovyev A.I., Esmagambetov I.B., Tukhvatulin A.I., Logunov D.Y., Naroditsky B.S., Shcheblyakov D.V. // Toxins (Basel). 2019. V. 11. № 8. e464.
20. Cortez-Retamozo V., Lauwereys M., Hassanzadeh Gh.G., Gobert M., Conrath K., Muyldermans S., De Baetselier P., Revets H. // Internat. J. Cancer. 2002. V. 98. № 3. P. 456-462.
21. Harmsen M.M., van Solt C.B., Fijten H.P., van Setten M.C. // Vaccine. 2005. V. 23. № 41. P. 4926-4934.
22. St Claire M., Ragland D., Bollinger L., Jahrling P. // Comp. Med. 2017. V. 67. № 3. P. 253-262.
23. Huston J.S., George A.J., Adams G.P., Stafford W.F., Jamar F., Tai M.S., McCartney J.E., Oppermann H., Heelan B.T., Peters A.M., et. al. // Quarterly J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 1996. V. 40. P. 320-333.
24. Batra S.K., Jain M., Wittel U.A., Chauhan S.C., Colcher D. // Curr. Opin. Biotechnol. 2002. V. 13. P. 603-608.
25. WHO. WHO R&D Blueprint - Ad-hoc Expert Consultation on clinical trials for Ebola Therapeutics. Appendix 4. URL: https://www.who.int/ebola/drc-2018/treatments-approved-for-compassionate-use-update/en/ (accessed January, 2020).
