CC BY
11
Резюме. Представлены результаты изучения ^1899663-полиморфизма гена HOTAIR у 101 пациента (42 женщины и 59 мужчин) со светлоклеточным почечно-клеточным раком (СКПКР) и 100 относительно здоровых лиц контрольной группы (34 женщины и 66 мужчин). Выяснено, что разница распределения генотипов GG, GT и TT между группой пациентов с СКПКР и контролем не была достоверной как в общей группе (P = 0,207), так и отдельно среди лиц женского (Р = 0,067) и мужского (Р = 0,248) пола. Методом логистической регрессии было установлено, что у женщин, которые являются гетерозиготами GT, риск возникновения рака почки в 2,7 раза (95% CI = 1,058-6,868; Р = 0,038) выше, чем у женщин с GG- и ТТ-генотипом.
Ключевые слова: длинная некодирующая РНК, HOTAIR, генетический полиморфизм, рак почки.
GENDER DIFFERENCES IN THE ASSOCIATION BETWEEN rs1899663 LONG NON-CODING RNA HOTAIR GENE POLYMORPHISM AND KIDNEY CANCER DEVELOPMENT
Volkogon A. D., Obukhova O. A., Harbuzova V. Yu., Ataman A. V.
Abstract. HOX antisense intergenic RNA (HOTAIR), the well-studied long noncoding RNA (InRNA), realizes the regulation of cell cycle genes expression at the epigenetic and transcriptional levels. The results of experiments showed that HOTAIR promotes epithelial-mesenchymal transition (EMT) during the renal-cell carcinoma (RCC) development. Moreover, HOTAIR knockdown inhibits proliferation and invasion of RCC cells. At the same time the role of HOTAIR gene polymorphisms in kidney cancer development is unknown.
The aim of the study was to perform a case-control study on representatives of both genders in order to assess the possible link between HOTAIR rs1899663 gene polymorphism and kidney cancer development in Ukrainian population.
Object and methods. 141 unrelated Ukrainian patients (42 female, 59 male) with clear cell renal cell carcinoma (CCRCC) and 100 healthy subjects (34 female, 56 male) were enrolled to case-control study. HOTAIR rs1899663 polymorphism genotyping was performed using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis (PCR-RFLP). The mathematical processing of obtained results was done using Statistical Package for Social Science software (SPSS, version 17.0, Chicago, IL, USA). All statistical tests were two-sided, P <0.05 was considered significant.
Results. It was shown that ratio of HOTAIR rs1899663 GG-, GT- and TT-genotypes between CCRCC patients and control subjects did not differ (P = 0.207). Comparison of rs1899663 genotype frequencies in groups of different sex demonstrated no significant difference between CCRCC patients and control group in women (P = 0.067) and men (P = 0.248). The results of logistic regression analysis showed the association between HOTAIR rs1899663 polymorphic locus and CCRCC occurrence in female subjects under superdominant model of inheritance. Women with GT-genotype had 2.7 times increased risk of kidney cancer development compared to women with GG- and TT-genotypes (95% С1 = 1.058-6.868; Р = 0.038). The link between HOTAIR rs1899663 gene polymorphism and CCRCC development in male subjects was not found in any inheritance model (P > 0.05).
Conclusion. Obtained results revealed that long non-coding RNA HOTAIR rs1899663 polymorphic site was associated with kidney cancer development only in female Ukrainian patients. The risk of CCRCC occurrence in women with GT-genotype was higher than in women with GG- and TT-genotypes.
Key words: long non-coding RNA, HOTAIR, gene polymorphism, kidney cancer.
Рецензент - проф. Старченко 1.1.
Стаття надшшла 27.03.2019 року
DOI 10.29254/2077-4214-2019-1-2-149-224-229 УДК 575.224.2:616.36.361-07
1Гайбонюк I. е.,1 Макух Г. В., 1Тиркус М. Я., 1Третяк Б. I., 2Яджин Л. М.
МУТАЦП H1069Q ГЕНА ATP7B ТА C282Y ТА H63D ГЕНА HFE В ОС1Б З ГЕПАТОБ1Л1АРНИМИ ЗАХВОРЮВАННЯМИ НЕЗ'ЯСОВАНОГО ГЕНЕЗУ 1ДУ «1нститут спадковоТ патологи НАМН УкраТни» (м. Льв1в) 2Льв1вська обласна клЫчна л1карня (м. Льв1в)
Зв'язок публшацм з плановими науково-дослщ-ними роботами. У статт подаються результати досли джень, отримаш в ходi виконання науково-дослщноТ роботи, яка запланована на базi ДУ «1СП НАМН УкраТни». Тема НДР: «Дослщження генетичних чиннимв обтяженого ключного переб^у моногенних i муль-тифакторних захворювань», № державноТ реестрацп 0117и000685.
Вступ. ГепатобЫарна система - надзвичайно важлива складова травноТ системи, яка включае в себе печшку, пщшлункову залозу, жовчш протоки та жовчний мiхур, що дозволяе здшснювати там важ-ливi процеси, як травлення та виведення з оргашзму продуклв метаболiзму [1]. Результатом ТТ ураження
стае порушення обмшних процеав, процеав деток-сикаци, а також iмунноТ вщпов^д i антимтробного захисту. Причини гепатобшарних порушень можуть бути рiзнi, серед них споаб життя, мкце прац та про-живання, вiруси, стреси та iншi середовищш чинни-ки, а також спадково зумовлеш порушення обмшу речовин, зокрема залiза при спадковому гемохрома-тозi та м^ при хворобi Вшьсона-Коновалова [2,3,4].
Спадковий гемохроматоз (СГХ) зумовлений мута-щями в ген HFE, успадковуеться за аутосомно-реце-сивним типом та мае частоту поширення 1:500. Най-поширешшими мутащями гена HFE е C282Y та H63D. Мутантний бток спричиняе накопичення юшв Fe2+ в печшщ, що провокуе розвиток цирозу, гепатиту та
мае летальш наслщки при вщсутносп лiкування [5]. Симптоми захворювання проявляються переважно у чоловiкiв (стввщношення чоловiкiв i жiнок 20:1) [6].
Хвороба Втьсона-Коновалова (або хвороба В1ль-сона, Wilson disease) мае аутосомно-рецесивний тип успадкування i зумовлена мутациями в генi ATP7B, як1 спричиняють порушення екскрецй iонiв Cu2+ з клп"и-ни та викликають порушення з боку рiзних систем ор-ганiв, в основному гепатобiлiарноí. Частота хвороби Втьсона-Коновалова 1:10 000, що в 20 раз рiдше шж СГХ [7]. Хворобою Вiльсона однаково часто хворать чоловiки i жшки. Найпоширенiшою мутацiею гена ATP7B в бвропейськш популяцií е c.3207 (H1069Q) [8], яка спричиняе порушення транскрипцп АТФ-зв'язуючого домену бiлка ATP7B i втрату його осно-вно'1 функцп - екскрецй' iонiв мiдi з клiтин. На вiдмiну в^ц гена HFE для гена ATP7B характерне велике число (понад 500) шших мутацш, якi спричинюють хворобу Втьсона.
На сьогоднi розробленi ефективш терапевтичн1 протоколи для виведення токсичних надлишкових металiв з органiзму [9], проте значною проблемою е вчасна дiагностика цих захворювань. Причому, для СГХ дуже ефективною е перюдична флеботомiя. Дуже важливо правильно та своечасно встановити вiрний дiагноз таким патентам, оскiльки без спе-цифiчного лiкування виникають важкi порушення серед яких найбтьш частими е цироз печшки, гостра печiнкова недостатнiсть, гепатоцелюлярна карцинома. Вчасно встановивши дiагноз та застосувавши правильне специфiчне лтування можна запобiгти таким важким настдкам i уникнути необхiдностi трансплантаци печшки.
Метою роботи е визначення поширеност мутацш H1069Q гена ATP7B, C282Y та H63D гена HFE та встановлення внеску спадкового гемохроматозу та хвороби Втьсона-Коновалова в етюлогп гепатобтн арних порушень нез'ясованого Генезу.
Об'ект i методи дослiджень. Об'ектом дослн дження е алельнi варiанти генiв. Матерiалом для дослiдження слугувала ДНК 120 оаб, якi обстежува-лись в лабораторп генетичних достджень ДУ «1СП НАМН Укра'ни» у перюд з 2011 до 2018 рр. Вт пацн ентiв коливався в^д 20 до 60 рошв i середньому ста-новив 41,2+3,2 роки. Пацiенти зверталися до лтаря з приводу гепатобiлiарних порушень. Критерiем ви-ключення була наявнiсть анатомiчних порушень, вн русних гепатитiв, онколопчних захворювань, верифн кованого автоiмунного процесу. Таким чином, групу достдження склали випадки гепатобЫарних порушень нез'ясованого Генезу в осiб молодого та серед-нього вiку. Серед обстежуваних було 47 оаб жшочо'1 стат та 73 чоловiчоí, усi були мешканцями Зах^дного регiону Укра'ни.
Видтення та очищення геномно' ДНК з лейкоци-тiв периферiйноí кровi було виконано методом висо-лювання [10]. Проводили двох направлену амплiфi-кацш методом ПЛР (PCR BI-PASA) iз використанням двох пар олiгонуклеотидних праймерiв як описано [11]. Використовували сумш dDNTP, термостiйку DreamTaq Green ДНК полiмеразу та ендонуклеази рестрикцiй (ThermoFisher scientific, USA). Аналiз амп-лiфiкованих продуктiв та фрагментiв рестрикцп проводили у 3% агарозному гел^ який мктив бромистий етидiй. Отримаш сигнали порiвнювали з маркерами
довжин, i на ochobí цього детектували розмiри отри-маних фрагментiв. Результати сканування агароз-них гелiв зшмали цифровою камерою «Gel Imager» (HELICON, Роая) та опрацьовували за допомогою програми Gel Explorer 2.0.
Результати дослщження та Тх обговорення. Оскiльки, одними Í3 чинникiв гепатобiлiарних порушень е спадково зумовленi порушення обмшу речо-вин, зокрема залiза при спадковому гемохроматоз1 та мд при хворобi Вiльсона-Коновалова, проведено достдження мажорних мутацш вiдповiдних генiв.
Проведено молекулярно-генетичний аналiз мутацш C282Y (p.Cys282Tyr, c.845G>A) та H63D (p. His63Asp, c.187C>G, SNP: rs1799945) гена HFE проведено у 120 оаб з гепатобЫарними порушеннями нез'ясованого генезу. Мутацш C282Y гена HFE дост-джували методом амплiфiкацií in vitro постдовносп ДНК гена з подальшим рестрикцшним аналiзом ПЛР продукту ендонуклеазою рестрикцп Rsa I. Електро-фореграму рестрикцшного аналiзу мутацп C282Y гена HFE наведено на рисунку 1.
Мутацш H63D гена HFE достджували методом амплiфiкацií in vitro постдовносп ДНК гена з подаль-
Рис. 1. Електрофореграма рестрикцiйних Rsa I фрагменлв продукту амплiфiкацiV послдовносп гена HFE (2% агарозний гель): 1, 2 - вдеутшсть мутацГГ C282Y ; 3 - наявшсть мутаци C282Y в гомозиготному станi; 4 -маркер молекулярноГ ваги (50 bp Ladder).
шим рестрикцiйним аналiзом ПЛР продукту ендонуклеазою рестрикцп Bcl I. Електрофореграму рестрикцшного аналiзу мутацп H63D гена HFE наведено на рисунку 2.
Частоти та спектр встановлених генотитв щодо мутацш C282Y i H63D гена HFE у достднш групi пащ-енпв наведено в таблиц! 1.
Мутацш C282Y гена HFE, яка е найчаспшою причиною СГХ, i виявлено у 16 осiб в гетерозиготному стан, причому в одному випадку в поеднанш i3 му-тацiею H63D (табл. 1). В одному випадку мутацш C282Y виявлено в гомозиготному стаж. У цьому випадку у чоловта тдтверджено дiагноз спадкового гемохроматозу на основi проведених додаткових достджень рiвня насичення трансферину 75% (при нормi 20-55%) i феритину 845,7 нг/мл (при нормi 22 -322 нг/мл). Таким чином, серед пащешпв з гепатобi-лiарною патологiею частота мутаци C282Y (с.845G/A) становить 13,44%. Цей показник е значно вищий, шж ТТ популяцiйна частота, що вказуе на внесок мутаци C282Y як фактора ризику гепатобЫарних порушень. Ще одне поясненням високоТ частоти може бути на-ступним: у частини пащешпв гетерозигот C282Y / N в
другому алелi е наявна шша вiдмiнна вiд досл^жу-ваних мутаи^я гена HFE. В такому випадку патоло-гiчнi гепатобiлiарнi змши е зумовленi порушенням роботи транспортера залiза. Для пiдтвердження цього припущення усiх паuiентам - гетерозиготам за мажорною мутащею слiд проводити перюдичний монiторинг насичення трасферину для вчасного ви-явлення накопичення залiза та призначення профн лактичноТ флеботомií.
Таблиця 1.
Частоти та спектр встановлених генотишв щодо мутацiй С282У i H63D гена HFE серед пащентчв з гепатобiлiарними порушеннями нез'ясованого ^енезу
Мутаuiю H63D гена HFE виявлено у 34 осiб i частота щеТ мутаuií у достджежй вибiриi становить 28,57%. Мутаuiя H63D гена HFE е широко розповсю-дженою в слов'янських популяuiях, i кожен четвер-тий е гетерозиготним ноаем uiеí мутаиií, що дозво-ляе окремим авторам трактувати ТТ як нейтральний полiморфiзм [12,13]. Тому, виявлення такоТ' частоти мутаuií св^цчить про ТТ широку розповсюдження та вщсутжсть ТТ внеску в етюлогп гепатобiлiарних по-рушень. Щодо гомозигот H63D/H63D та компаунд гетерозигот C282Y/H63D (табл. 1), то у невеликого числа пащетчв такий генотип може вести до роз-витку клЫчних проявiв СГХ, оскiльки мутаuiя Н63й викликае незначне зниження iнгiбуючого впливу на трансфериновий рецептор, тому гомозиготи за Н63й та компаунд-гетерозиготи C282Y/H63D мають низь-кий рiвень фенотиповоТ експресií. При таким генотипах теж рекомендовано проводити перюдичний можторинг насичення трансферину для вчасного виявлення накопичення залiза та призначення про-фтактичноТ флеботомií. Наявнiсть мутаuií C282Y мае бiльш серйознi клiнiчнi наслщки нiж H63D. Незважа-ючи на опублтоваж данi про високу частоту спадко-вого гемохроматозу [14,15], проведене опитування серед фахiвцiв терапевтичного профшю м. Львова та генетикiв Обласних медико-генетичних консультацш Захiдноí Украíни виявило, що дiагноз спадковий ге-мохроматоз практично не виставляеться, а саме накопичення залiза в органах, зазвичай, дiагностують тсля автопсiй. Це можна пояснити гетерогенжстю клiнiчних ознак захворювання (болi в животi, астежя, анемiя, гепатопатií, панкреопатií, ураження щитопо-дiбноí залози та/чи наднирникiв, артралпя, iмпотен-Uiя та iншi [16]) Ь як наслiдок, утрудненою верифта-Uiею дiагнозу СГХ.
Ще одним моногенним захворюванням, яке по-рушуе обмiннi процеси в гепатобiлiарнiй системi та спричиняе í"í важкi ураження е Хвороба Втьсона-Коновалова. Ií викликають мутаuií в генi ATP7B, як1
Рис. 2. Електрофореграма рестрикцшних Bcl I фрагменлв продукту амплiфiкацм° послiдовностi гена HFE (2% агарозний гель): 1 - маркер молекулярной' ваги 50 bp Ladder. 3 - наявнiсть мутацм' H63D у гетерозиготному стаж, 2, 4 - вщсутшсть мутацм' H63D.
спричиняють порушення екскрецп ïohïb Cu2+. Най-поширежшою мутащею у eвропейськiй популяцп е H1069Q (c.3207 С>А). Молекулярно-генетичний ана-лiз мажорно!' мутацм H1069Q проведено у 100 ос'б з гепатоб'л'юрними порушеннями нез'ясованого Генезу. Проводили двонаправлену амплiфiкаu1iю дн лянки екзона 14 гена ATP7B з праймерами компле-ментарними для нормального та мутантного алелю. Електрофореграму аналiзу ПЛР фрагменпв наведено на рисунку 3.
356 п.н.
212 п.н 181 п.н.
Рис. 3. Електрофореграма детекцм мутацм Н1069<3 (с.3207
С>А) гена АТР7В. 1-Маркер молекулярной' ваги 100 Ьр, 2, 6 - в1дсутн1сть мутацм H1069Q (генотип с.3207 СС), генотип 3, 5 - наявшсть мутацм H1069Q в гетерозиготному стан1 (генотип с.3207 СА), 4 - наявшсть мутац1'| Н1069<3 в гомозиготному стан1 (генотип с.3207 АА).
У результат проведеного генетичного тестування мажорну у европейськш популяuií мутаиiю Н1069Ц гена ATP7B виявлено у чотирьох оаб, що становить 4%. Причому дана мутащя виявлена у трьох оаб в гетерозиготному стаж та в оджеТ особи в гомозиготному стаж. Частоти виявлених генотитв гена ATP7B наведено в таблиц! 2.
Мутащю Н1069Ц (а3207 С>А) гена ATP7B вияви-ли у чотирьох оаб чоловiчоТ стaтi, вiк яких знаходив-ся в межах 25-35 рошв. Виявлення мутauií Н1069Ц в гомозиготному стаж е тдтвердженням дiaгнозу хвороби Вiльсонa. Таким чином, у пащентки з генотипом Н1069Ц/Н1069Ц встановлено етiологiчну причину гепатобЫарних змiн. Один iз пauiентiв з генотипом Н1069Ц^ страждае гепатитом, портальною гiпертензiею, мае когнiтивнi порушення, агресивний. Також вш е гетерозиготним ноаем полiморфного ва-рiaнту H63D гена HFE. У цьому випадку е наявна характерна клЫчна картина хвороби Втьсона. Двом шшим гетерозиготним носiям мутauií Н1069Ц, як1 мали змiненi бiохiмiчнi показники, зокрема рiвень
Генотип гена HFE Поширешсть
n %
C282Y / C282Y 1 0,83
C282Y/N 15 12,61
C282Y / H63D 1 0,84
H63D / H63D 3 2,52
H63D/N 30 25,21
N/N 70 57,99
Усього 120 100
Примiтка. N - вщсутысть мутацм C282Y та H63D.
АЛТ i АСТ сироватки KpoBi, що вказуе на ураження печшки, проведено секвенування гена ATP7B. В оби-двох випадках виявили iншi рiдкiснiшi мутацп гена ATP7B у компаунд гетерозиготному стаж, що дозволяв пщтвердити дiагноз хвороба Втьсона. Дiагноз хвороби Вiльсона може бути тдтверджений i без виявлення двох мутацш, якщо вГдповГдно до мГж-народноТ бальноТ системи 6юхГмГчних та генетичних тестiв (8th International Meeting on Wilson's disease, Leipzig, 2001) патент набере принаймнi 4 бали [17]. Тому для коректноТ дiагностики та застосування правильного лтування рекомендуеться особам з ураженнями гепатобшарноТ системи нез'ясованого Генезу вимГряти рiвень мГдГ в до6овГй сечi, рiвень це-рулоплазмiну в сироватцi кровГ та пройти огляд оку-л^а на присутнГсть кГльця Кайзера на десцеметовш мембранi рогГвки. Також дiагностичну чутливГсть та специфiчнiсть виявляе стввщношення показникiв лужноТ фосфатази (МО/л) до загального бЫрубжу (мг/л) менше 4 (шдекс лужна фосфатаза/загальний 6глгру6гн >4) та АСТ до АЛТ бтьше 2,2 (iндекс АСТ/ АЛТ < 2,2) [17]. Уам пaцiентaм призначено в^повщ-не лiкувaння халатами, а Тх родичам запропоновано проведення генетичного тестування виявленоТ мутацп.
Таким чином, серед дослщженоТ групи па^ен^в з гепaтобiлiaрними порушеннями нез'ясованого Ге-незу виявлення мутаци H1069Q гена ATP7B у подаль-шому супроводжувалося шдтвердженням дiaгнозу хвороби Вiльсонa-Коновaловa. Не виключаемо, що особи дослщженоТ групи можуть бути ноаями гнших мутацш гена ATP7B, так як немае шформацп про спектр мутацш, характерних для нашоТ популяцп. Описано бтьше 500 алельних вaрiaнтiв гена ATP7B, i для 380 встановлено роль у розвитку захворювання [17]. Результати aнaлiзу мутaцiй в пaцiентiв з хворобою Втьсона-Коновалова з УкраТни показали, що у 70% випадшв виявлено мутaцiю H1069Q [18].
Таблиця 2.
Частоти встановлених генотипiв щодо
мутаци H1069Q гена ATP7B серед пащенлв з гепатобiлiарними порушеннями нез'ясованого Генезу
Генотип гена ATP7B Поширешсть
n %
H1069Q/H1069Q 1 1,0
H1069Q/N 3 3,0
N/N 96 96,0
Усього 100 100
Приметка. N - вщсутшсть мутаци H1069Q
Незважаючи на значно нижчу частоту хвороби Втьсона (1 на 10000) у порiвняннi iз спадковим ге-махроматозом (1 на 500), у груш пащенлв з щюпа-тичними гепатобiлiарними порушеннями чотирьом особам встановлено дiагноз хвороби Втьсона i лише один випадок верифтаци спадкового гемохромато-зу. Проте, виявлення носшства мутацiй гена HFE було бтьш частим нiж мутаци гена ATP7B. Так, 28,57% оаб були ноаями мутаци H63D гена HFE, 13,44% - С282Y гена HFE. Так результати пояснюються значною вищою популяцшно'| частотою мутацiй гена HFE по-рiвняно з ATP7B. Виявлення в чотири рази часлше випадшв хвороби Вiльсона у порiвняннi iз спадковим гемохроматозом свiдчить про вагомший внесок хвороби Вiльсона в етюлопю iдiопатичних гепатоб^ар-них порушень, у порiвняннi iз СГХ. Припускаемо, що бтьш^ь випадкiв СГХ, зважаючи на його високу очи кувану частоту мало б виявлятися в шших когортах пащенлв.
Молекулярно-генетичне дослщження е високо-iнформативним та точним методом, а використаш у робот методи дослiдження мажорних мутацiй е еко-номiчно ефективними, оскiльки дослщження проводиться один раз i дозволяе виявляти генетично де-термiнованi порушення навiть на до кл^чнш стади.
Висновки
1) Встановлено висок показники носiйства му-тацiй гена HFE серед пащенлв з гепатобшарними порушеннями: частота виявлення мутаци C282Y (с.845G/A) становить 13,44%, H63D (с.187С^) -28,57%.
2) У результатi проведеного генетичного досли дження мажорну у европейськш популяцп мутацiю Н1069Ц гена ATP7B виявлено у чотирьох оаб (4%), яким у подальшому пщтверджено дiагноз хвороби Вiльсона-Коновалова.
3) Виявлення в чотири рази часлше випадмв хвороби Вiльсона у порiвняннi iз спадковим гемохроматозом свiдчить про вагомший внесок хвороби Втьсона в етюлопю гепатобЫарних порушень нез'ясованого Генезу, у порiвняннi iз гемохромато-зом.
Перспективи подальших дослiджень. Визначен-ня внеску мутацiй гена HFE та гена ATP7B в етюлоги гепатоб^арних порушень дозволить покращити дiа-гностику та вчасно призначити специфiчну терашю, щоб запобiгти серйозних уражень оргашв гепатоби лiарноí системи. Цього можна досягти тсля визна-чення спектру мутацш в цих генах, специфiчних для нашо'| популяцп, та формування алгоритму медико-генетичного консультування таких пащенлв.
Л1тература
Kilambi R, Singh AN, Madhusudhan KS, Das P, Pal S. Choledochal cyst of the proximal cystic duct: a taxonomical and therapeutic conundrum. Ann R Coll Surg Engl. 2018;100(2):34-7. DOI: 10.1308/rcsann.2017.0201
El-Serag HB, Inadomi JM, Kowdley KV. Screening for hereditary hemochromatosis in siblings and children of affected patients. A cost-effectiveness analysis. Ann. Intern. Med. 2009;152:261-9. DOI: 10.7326/0003-4819-132-4-200002150-00003
Cater MA, La Fontaine S, Shield K, Deal Y, Mercer JF. ATP7B mediates vesicular sequestration of copper: insight into biliary copper excretion. Gastroenterology. 2006;130:493-506. DOI: 10.1053/j.gastro.2005.10.054
European Association For The Study Of The Liver EASL clinical practice guidelines: Wilson's disease. J Hepatol. 2012;56(3):671-85. DOI: 10.1016/j.jhep.2011.11.007
Hanson E, Imperatore G, Burke W. HFE gene and hereditary hemochromatosis: a HuGE review. Am. J. Epidemiol. 2009;158:293-6. DOI: org/10.1093/aje/154.3.193
Beutler E, Felitti VJ, Koziol JA, Ho NJ, Gelbart T. Penetrance of 845GA (C282Y) HFE hereditary haemochromatosis mutation in the USA. Lancet. 2008;359:211-8. DOI: 10.1182/blood-2005-05-1857
Forbes JR, Cox DW. Copper-dependent trafficking of Wilson disease mutant ATP7B proteins. Hum Mol Genet. 2000;9:1927-35. DOI: 10.1093/ hmg/9.13.1927
8. Shah AB, Chernov I, Zhang HT, Ross BM, Das K, Lutsenko S, et al. Identification and Analysis of Mutations in the Wilson's Disease Gene (ATP7B): Population Frequencies, Genotype-Phenotype Correlation, and Functional Analyses. Am. J. Hum.Genet. 1997;61:317-28. DOI: 10.1086/514864
9. Lydia K Nyasae, Michael J Schell, Ann L Hubbard. Copper Directs ATP7B to the Apical Domain of Hepatic Cells via Basolateral Endosomes. Traffic. 2014;15(12):1344-65. DOI: 10.1111/tra.12229
10. Makukh HV, Zastavna DV, Tyrkus MYa. Pat. 32044 UA, MPKG01N33/49 (2006.01) Sposib vydilannia DNK z lejkocytiv peryferijnoi krovi, zaiavnyk DU «Instytut spadkovoi patologii NAMNU». № u200801896; zaiavl. 14.02.2008; opubl. 25.04.2008, Biul. № 8. [in Ukrainian].
11. Krumina A, Keiss J, Sondore V, Chernushenko A, Cernevska G, Zarina A, et al. From Clinical and Biochemical to Molecular Genetic Diagnosis of Wilson Disease in Latvia. Rus J of Genet. 2008;44:1195-200. DOI: 10.1134/S1022795408100086
12. Ferenci P. Regional Distribution of Mutations of the ATP7B Gene in Patients with Wilson Disease: Impact on Genetic Testing. Hum. Genet. 2006;120:159. DOI: 10.1007/s00439-006-0202-5
13. Thomas GR, Forbes JR, Roberts EA, Walshe JM, Cox DW. The Wilson disease gene: spectrum of mutations and their consequences. Nature Genet. 1995;9:210-7. DOI: 10.1038/ng0295-210
14. Kucinskas L, Juzenas S, Sventoraityte J. Prevalence of C282Y, H63D, and S65C mutations in hereditary HFE-hemochromatosis gene in Lithuanian population. Ann Hematol. 2012;91(4):491-5. DOI: 10.1007/s00277-011-1338-5
15. Adler G, Clark JS, toniewska B, Ciechanowicz A. Prevalence of 845G>A HFE mutation in Slavic populations: an east-west linear gradient in South Slavs. Croat Med J. 2011;52(3):351-7.
16. Pietrangelo A. Hereditary hemochromatosis: pathogenesis, diagnosis, and treatment. Gastroenterology. 2010;139(2):393-408.
17. Ferenci P. Wilson's Disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 2005;3(8):726-33.
18. Myshchenko MS, Voloshyn-Gaponov IK. Sovremennye aspekty bolezni Vilsona. Mizhnarodnyj nevrologichnyj zhurnal. 2015;2(72):20-1. [in Russian].
МУТАЦП H1069Q ГЕНА ATP7B ТА C282Y ТА H63D ГЕНА HFE В ОС1Б З ГЕПАТОБ1Л1АРНИМИ ЗАХВОРЮВАННЯ-МИ НЕЗ'ЯСОВАНОГО ГЕНЕЗУ
Гайбонюк I. €., Макух Г. В., Тиркус М. Я., Третяк Б. I., Яджин Л. М.
Резюме. Мета. Визначити поширешсть мутацш H1069Q гена ATP7B, C282Y та H63D гена HFEта встанови-ти внесок спадкового гемохроматозу та хвороби Вшьсона-Коновалова в етюлоги гепатобшарних порушень нез'ясованого генезу. Методи. Видтення ДНК виконано методом висолювання. Амплiфiкaцiю специфiчних послщовностей проведено методом ПЛР. Анaлiз aмплiфiковaних фрагменлв проводили у 3% агарозному гелг Результати. Мутащю c.3207 гена ATP7B виявлено у 4,0% пащенлв, 28,57% оаб були ноаями мутацп H63D гена HFE, 13,44% - C282Y гена HFE. Пщтверджено один випадок спадкового гемохроматозу та чотири випад-ки хвороби Вшьсона. Цим особам призначено специфiчну терашю. Отримаш результати показали, що так1 дослщження можуть бути складовою алгоритму медико-генетичного консультування таких пащенлв. Виснов-ки. Виявлення в чотири рази часлше випадмв хвороби Вшьсона у порiвняннi iз спадковим гемохроматозом свщчить про вагомший внесок хвороби Втьсона в етюлопю гепатобшарних порушень нез'ясованого Генезу, у порiвняннi iз гемохроматозом.
Ключовi слова: ген ATP7B, ген HFE, хвороба Втьсона-Коновалова, спадковий гемохроматоз, гепатоб^арна система.
МУТАЦИИ H1069Q ГЕНА ATP7B И C282Y И H63D гена HFEУ ЛИЦ С ГЕПАТОБИЛИАРНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ НЕЯСНОГО ГЕНЕЗА
Гайбонюк И. Е., Макух Г. В., Тиркус М. Я., Третяк Б. И., Яджин Л. М.
Резюме. Цель. Определить распространенность мутаций H1069Q гена ATP7B, C282Y и H63D гена HFE и установить вклад наследственного гемохроматоза и болезни Вильсона-Коновалова в этиологии гепатобили-арных нарушений неясного генеза. Методы. Выделение ДНК выполнено методом высаливания. Амплификации специфических последовательностей проведено методом ПЦР. Анализ амплифицированных фрагментов проводили в 3% агарозном геле. Результаты. Мутацию c.3207 гена ATP7B обнаружено у 4,0% пациентов, 28,57% человек были носителями мутации H63D гена HFE, 13,44% - C282Y гена HFE. Подтвержден один случай наследственного гемохроматоза и четыре случая болезни Вильсона. Этим лицам назначена специфическая терапия. Полученные результаты показали, что такие исследования могут быть составной алгоритма медико-генетического консультирования таких пациентов. Выводы. Обнаружение в четыре раза чаще случаев болезни Вильсона по сравнению с наследственным гемохроматозом свидетельствует о весомом вкладе болезни Вильсона в этиологии гепатобилиарных нарушений неясного генеза, по сравнению с гемохроматозом.
Ключевые слова: ген ATP7B, ген HFE, болезнь Вильсона-Коновалова, наследственный гемохроматоз, ге-патобилиарная система.
MUTATIONS H1069Q OF ATP7B GENE AND C282Y AND H63D OF HFE GENE IN PERSONS WITH HEPATOBILARY DISEASES OF UNDEFINED GENESIS
Haiboniuk I., Makukh H., Tyrkus M., Tretiak B., Jadzhyn L.
Abstract. Wilson disease (WD) is an autosomal-recessive disorder of hepatocellular copper deposition caused by pathogenic variants ATP7B gene. Genetic testing of ATP7B gene is not usually used for Wilson's disease (WD) diagnostics in Ukraine and due to the marked heterogeneity in clinical presentation the diagnosis of WD remains challenging.
Hereditary hemochromatosis is an autosomal-recesive pathology coused by mutations in HFE gene. The most common mutations in this gene are H63D and C282Y. Effective therapy is developed for hemochromatosis and Wilson's Diseases, but these pathologies still appear to be in the late stages, which is associated with nonspecific manifestations.
Aim. To establish the prevalence of H1069Q mutations of the ATP7B, C282Y and H63D of the HFE gene and the contribution of hereditary hemochromatosis (HH) and Wilson's disease (WD) into the etiology of idiopathic hepatobiliary disorders.
Methods. DNA was isolated from blood samples using a modified salting out method. Detection of H63D and C282Y mutations of HFE gene was carried out using PCR and restriction fragment length polymorphism analysis, H1069Q by BI PASA analysis and detected by agarose electrophoresis.
Results. 28.57% of the subjects were carriers of H63D mutation of HFE gene, 13.44% - carriers of C282Y mutation of the HFE gene but only one case of HH was confirmed. H1069Q mutation of ATP7B gene was detected in 4.0% cases which were confirmed as WD diagnosis. Such results are due to a significant higher population frequency of mutations in the HFE gene compared to ATP7B.
Conclusions. The detection four times more cases of WD compared with the HH indicates a greater contribution of WD to the etiology of idiopathic hepatobiliary disorders, compared to HH.
Key words: ATP7B gene, HFE gene, Wilson's disease, hereditary hemochromatosis, idiopathic hepatitis.
Рецензент - проф. Старченко 1.1. Стаття надшшла 06.03.2019 року
DOI 10.29254/2077-4214-2019-1-2-149-229-234 УДК 575.116.4:616.155.392-002.2-037-085
Дмитренко I. В., Мнченко Ж. М., Федоренко В. Г., Дяг'ль I. С.
ПРОГНОСТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ ДОДАТКОВИХ ХРОМОСОМНИХ АБЕРАЦ1Й У ПАЦ16НТ1В З ХРОН1ЧНОЮ М16ЛО1ДНОЮ ЛЕЙКЕМ16Ю, ЯК1 ОТРИМУЮТЬ ТЕРАП1Ю
1НГ1Б1ТОРАМИ ТИРОЗИНК1НАЗ Державна установа «Нацюнальний науковий центр рад1ацшноТ медицини НАМН УкраТни»
(м. КиТв)
Зв'язок публшацй' з плановими науково-до-слщними роботами. Робота виконувалася в рамках науково-дослщних робп" вщдму гематологи та трансплантологи ДержавноУ установи «Нацюнальний науковий центр радiацiйноï медицини НАМН Украши» за темами «Вивчення молекулярно-генетичних ме-ханiзмiв формування резистентносп до терапи шпби торами тирозинкшаз у хворих на хрошчну мiелоïдну лейкем^ для обгрунтування шляхiв ïï подолання», № державноУ реестраци 0113U002315, та «Роль му-тацш гену BCR/ABL, хромосомних, молекулярно-ге-нетичних порушень та iмуногенетичних показнимв у формуванш пiдходiв до оптимiзацiï таргетноУ терапи хворих на хрошчну мiелоïдну лейкемiю у вiддалений перюд пiсля аварГГ на ЧАЕС», № державно'! реестраци 0116U003574.
Вступ. Хронiчна мiелоïдна лейкемiя (ХМЛ) - одне з небагатьох онкогематолопчних захворювань, яке характеризуеться наявшстю специфiчного дiагнос-тично значущого генетичного порушення, а саме присутшстю в лейкемiчних клiтинах транслокаци t(9;22). Така хромосомна перебудова призводить до формування химерного гена BCR/ABL1 [1,2].
На сьогодшшнш день у 10-15% пащетчв з хрошч-ною фазою ХМЛ визначають наявнiсть додаткових хромосомних аномалш (ДХА), вiдмiнних вщ класич-но'| транслокаци t(9;22). Показано, що ïx частота вище у пащенпв у фазi акселераци i бластного кризу. Появу ДХА вщносять до BCR/ABLl-незалежних шляхiв роз-витку резистентносп до терапи iнгiбiторами тирозинкшаз (1ТК), яка спрямована на елiмiнацiю BCR/ABL1-позитивних клiтин [3].
Значення ДХА для прогнозу вщпов^д на тератю 1ТК вивчено недостатньо. Дiючi рекомендаци ELNet 2013 вважають наявшсть додаткових хромосомних аберацiй на етат дiагностики несприятливим про-гностичним фактором [4]. Wang W. з ствавторами [3] пщкреслюють, що ттьки деякi ДХА асоцiюються
з поганим прогнозом перебГгу ХМЛ. Проте Всесвпн оргaнiзaцiя охорони здоров'я розглядае ДХА як озна-ку прогреси ильки у випадку, коли вони з'являються в процесi лiкувaння, тодГ вони визначаються як озна-ка клональноТ еволюци [5].
Багато в чому така невизначешсть обумовлена низькою частотою додаткових хромосомних абера-цГй у па^енив з хронГчною фазою ХМЛ, а також ва-рiaбельнiстю виявлених ДХА. Тому дослГдження значення ДХА у формуванш вщповщГ на тератю 1ТК у хворих на ХМЛ е актуальним.
Мета дослщження. Вивчити частоту хромосомних аберацш в Ph+ клiтинaх кГсткового мозку та Тх вплив на розвиток резистентносп до ГнгГ6ГторГв тирозинкшаз у пaцiентiв з хронГчною мГелоТдною лейке-мiею.
Об'ект i методи дослiдження. Цитогенетичне до-слГдження проводили у 547 пацГенив з хронГчною фазою ХМЛ перед призначенням терапи 1ТК. Вс па-цГенти надали шформовану згоду на використання Тх бюматерГалу для дослГдження. ДГагноз ХМЛ було встановлено або пщтверджено ствробГтниками вГд-дГлення радГацшноТ онкогематологи i транспланта-ци стовбурових клГтин 1нституту клшГчноТ радюлоги НацГонального наукового центру радГацшноТ медицини. Серед обстежених па^енив 514 отримували терапГю иматишбом, а 33 - нилотинГбом. БшьшГсть пацГентГв отримували попередне лГкування рГзними препаратами (гГдроксисечовина, бусульфан, штер-ферон) до призначення шпбГгорГв тирозинкГназ. ТривалГсть передлГкованостГ становила вГд 1 до 268 мкяцГв (медГана 9,8 мГс).
Стандартне цитогенетичне дослГдження перед-бачало аналГз метафазних пластинок з 24-годинних нестимульованих культур клГтин кГсткового мозку. Культивування клГтин протягом 24 годин здшсню-вали у поживному середовищГ RPMI-1640 («Sigma», США) з додаванням 20 % телячоТ ембрюнальноТ
