CC BY
40
Мультицентровое исследование распространённости назофарингеального носительства Streptococcus pneumoniae на отдельных территориях Республики Казахстан до и после начала противопневмококковой вакцинации
Б. А. РАМАЗАНОВА', Л. Т. ЕРАЛИЕВА2, К. К. МУСТАФИНА', Е. А. КОЛОСКОВА'*
1 Казахский национальный медицинский университет им. С. Д. Асфендиярова, Алматы, Республика Казахстан
2 НИИ фундаментальной и прикладной медицины им. Б. Атчабарова, Алматы, Республика Казахстан
A Multicenter Study of the Prevalence of Nasopharyngeal Carriage of Streptococcus pneumoniae in Selected Areas of the Republic of Kazakhstan Before and After the Onset of Antipneumococcal Vaccination
B. A. RAMAZANOVA1, L. T. ERALIEVA2, K. K. MUSTAFINA1, E. A. KOLOSKOVA1
1 B. Atchabarov Institute of Fundamental and Applied Medicine, Almaty, Republic of Kazakhstan
2 Asfendiyarov Kazakh National Medical University, Almaty, Republic of Kazakhstan
Введение. Колонизация S.pneumoniae рассматривается как фактор распространения пневмококка в популяции и является предиктором развития пневмококковой инфекции. Вакцинация против пневмококковой инфекции способна существенно снизить распространение S.pneumoniae и уровень носительства инвазивных штаммов. В Республике Казахстан в рамках национальной программы «Саламатты Казахстан» в 2011 г. проводится вакцинация против пневмококковой инфекции с поэтапным охватом по всей стране. Цель: Охарактеризовать назофарингеальное носительство S.pneumoniae у детей до 2 лет в двух разных регионах страны с разной историей иммунизации против пневмококковой инфекции. Методы. Проспективное многоцентровое кросс-секционное исследование проводилось в двух городах: в г. Алматы и в г. Караганда в течение двухлетнего периода. Носоглоточные образцы идентифицировали микробиологическим и молекулярно-генетическими методами с учетом вакцинального статуса детей. Результаты. За время исследования было обследовано 500 детей из Алматы и 1000 детей из Караганды в возрасте до 2 лет. Распространенность пневмококкового носительства на первом этапе исследования составила 15,6% в Алматы и 4,7% в Караганде. Во второй год исследования распространенность пневмококкового носительства была определена в Алматы — 14,1%, в Караганде — 17,6%. Наиболее распространенные серотипы в Алматы до вакцинации: 13 — 12%, 6АВС — 8%, 15В/С — 8% и 17F — 8%, в Караганде, где вакцинация проводилась в течение 2 лет: 15В — 19%, 31 — 14,3%, 38 — 14,3% и нетипируемые штаммы — 23,8%. На втором этапе исследования распространённые серотипы в Алматы: 15А — 11,1%, 39F — 11,1%, 22F — 8,3%, 31 — 8,3% и нетипируемые штаммы — 27,8%. В Караганде в 2016 году наиболее часто определяемыми серотипами были 8 — 14,3%, 10F/10C/33C — 10,4%, 15B/C — 9,1% и нетипируемые штаммы — 23,4%. Обсуждение. Полученные данные показывают необходимость мониторинга на фоне проводимой противопневмококковой вакцинации.
Ключевые слова: пневмококковое бактерионосительство, серотипы, пневмококковая инфекция, Streptococcus pneumoniae.
Introduction. Colonization of S.pneumoniae is considered as a factor in the spreading of pneumococcus in the population, and is a predictor of the development of pneumococcal infection. Vaccination against pneumococcal infection can significantly reduce the spread of S.pneumoniae and the number of carriers of invasive strains. The vaccination against pneumococcal infection in the Republic of Kazakhstan was carried out with a phased coverage throughout the country in the framework of the national program «Salamatty Kazakhstan» in 2011. Purpose. To characterize the nasopharyngeal carriage of S.pneumoniae in children under 2 years in two different regions of the country with different histories of immunization against pneumococcal infection. Methods. A prospective multicenter cross-sectional study was conducted in two cities — Almaty and Karaganda — for a two-year period. Nasopharyngeal samples were identified by microbiological and molecular/genetic methods, taking into account the vaccinal status of children. Results: During the study, 500 children from Almaty and 1000 children from Karaganda at the age of 2 years were examined. The prevalence of pneumococcal carriage in the first stage of the study was 15.6% in Almaty and 4.7% in Karaganda. In the second year of the study, the prevalence of pneumococcal carriage was 14.1% in Almaty and 17.6% in Karaganda. The most common serotypes in Almaty before the vaccination were: 13 — 12%, 6ABC — 8%, 15B/C — 8% and 17F — 8%, in Karaganda, where the vaccination was carried out for 2 years: 15V — 19%, 31 — 14, 3%, 38 — 14.3% and non-typed strains — 23.8%. At the second stage of the study, common serotypes in Almaty were: 15A — 11.1%, 39F — 11.1%, 22F — 8.3%, 31 — 8.3% and non-typed strains — 27.8%. The most frequently detected serotypes in Karaganda in 2016 were: 8 — 14.3%, 10F/10C/33C — 10.4%, 15B/C — 9.1% and non-typed strains — 23.4%. Discussion. The received data confirms the necessity of the monitoring measures within the framework of the current anti-pneumococcal vaccination.
Keywords: pneumococcal bacteriocarrier, serotypes, pneumococcal infection, Streptococcus pneumoniae.
© Коллектив авторов, 2017
*Адрес для корреспонденции: E-mail: [email protected]
Введение
Streptococcus pneumoniae (пневмококк) продолжает занимать лидирующие позиции в структуре заболеваемости и смертности во всем мире среди взрослых и детей.
Пневмококк — представитель нормальной микрофлоры, экологической нишей которого является носоглотка человека [1]. Носоглотка играет роль своеобразного перекрёстка, который соединяет нос, уши и нижележащие отделы респираторного тракта. Колонизация пневмококка на слизистых верхних отделов респираторного тракта обуславливает формирование бессимптомного на-зофарингеального носительства. Носительство же важно рассматривать с позиций эпидемиологического процесса: способствует горизонтальному распространению пневмококка в популяции и рассматривается как начальное звено патогенеза пневмококковой инфекции, которое необходимо для развития инвазивных инфекций [2]. По данным ВОЗ, ежегодно от пневмококковой инфекции погибают 1,6 млн людей, из которых 700 тыс — 1 млн — это дети до 5 лет [3].
В настоящее время выделяют более 90 сероти-пов S.pneumoniae, из которых способностью вызывать инвазивные инфекции обладают около 30 серотипов. Их состав может существенно различаться в разных регионах мира [4, 5]. Контингент, наиболее подверженный формированию пневмококкового бактерионосительства — дети в возрасте до 5 лет. Первая встреча с пневмококком может произойти как в первую неделю жизни, так и в первые 6 мес жизни с последующим формированием назофарингеального носительства [6]. Распространённость назофарингеального носительства у детей до 2 лет достигает 90%, причём уровень носительства выше в странах со средним и низким уровнями дохода [7].
Среди стран СНГ наиболее изучена проблема бактерионосительства в Российской федерации, где по данным отдельных авторов уровень носи-тельства составляет от 44—46,7% и достигает 92,5% с повышением возраста и началом посещения детских учреждений [8, 9]. Данных о пневмококковом носительстве в других странах СНГ нет.
Впервые изучение циркуляции штаммов S.pneumoniae на территории Республики Казахстан, в г. Алматы, проводились в 1985 г. Результаты исследования показали распространённость серогрупп 3, 6, 8, 9 среди людей больных пневмонией [10]. В настоящее время в Казахстане нет официальной регистрации пневмококковой инфекции, за 25-летнюю историю страны не проводились исследования по установлению частоты пневмококкового носительства среди различных групп населения, нет данных о циркулирующих серотипах и не известна роль S.pneumoniae в этио-
логии пневмоний, менингитов, бактериемий и острых средних отитов.
С 2011 г. в Республике Казахстан, в соответствии с рекомендациями ВОЗ, в рамках национальной программы «Саламатты Казахстан» стартовала вакцинация против пневмококковой инфекции с использованием конъюгированной 13-валентной вакцины, с поэтапным введением по всей стране к 2015 г. [11].
Цель исследования — охарактеризовать назо-фарингеальное носительство S.pneumoniae у детей до 2 лет в двух разных регионах страны с разной историей иммунизации против пневмококковой инфекции.
Материал и методы
Дизайн исследования. Проспективное многоцентровое кросс-секционное исследование проводилось в двух городах в течение 2 лет: в Алматы (октябрь 2014 — май 2015 гг. до начала иммунизации и в марте 2016 по май 2016 гг. — спустя год после начала иммунизации) и в Караганде (с января по апрель 2015 г. и в марте по май 2016 г.). Данные регионы были включены в исследование в связи с имеющимся разным вакцинальным статусом против пневмококковой инфекции. На момент первого этапа исследования в г. Алматы вакцинация против пневмококковой инфекции не началась, в г. Караганда вакцинация проводилась в течение 2 лет. Во время второго этапа исследования в г. Алматы с момента начала вакцинации прошло 11 мес, а в г. Караганда — 3 года.
В исследование приняли участие Городская поликлиника №12, Детская поликлиника №3, Городская поликлиника №31 г. Алматы и Городские поликлиники №1—5 г. Караганда.
Этическое одобрение. Исследование было одобрено Локальной этической комиссией КазНМУ им. С. Д. Асфендия-рова, протокол №7 от 30 мая 2014 г.
Критерии включения в исследование:
1. Здоровые дети в возрасте до 2 лет, посетившие поликлиники для плановой иммунизации.
2. Письменное согласие родителей или опекунов.
3. Отсутствие в анамнезе приёма антибактериальных препаратов в течение предшествующих 2 мес.
4. Отсутствие вакцинации против пневмококковой инфекции.
5. Отсутствие признаков острого воспалительного заболевания на момент исследования: нет повышения температуры тела и воспалительных изменений в носоглотке.
Критерии исключения из исследования:
1. Здоровые дети старше 2 лет.
2. Отказ родителей или законных представителей детей от участия в исследовании.
3. Приём антибактериальных препаратов менее чем за 2 мес до участия исследования.
4. Положительная история вакцинации против пневмококковой инфекции.
5. Повышенная температура тела и катаральные проявления в носоглотке на момент исследования.
После получения письменного согласия проводили анкетирование и сбор материала для исследования.
Микробиологические исследования. Сбор материала осуществляли в соответствии с рекомендациями ВОЗ по изучению пневмококкового бактерионосительства [12]. Материалом для исследования явились мазки из носоглотки, которую собирали нейлоновыми тампонами фирмы «Copan», Италия, и помещали в транспортную среду и доставляли в течение 6 ч в бактериологическую лабораторию кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии КазНМУ им. С. Д. Асфендиярова
г. Алматы. В г. Караганда образцы доставлялись в РГКП Карагандинский областной центр Санитарно-эпидемиологической экспертизы в течение 48 ч. Все образцы для проведения ПЦР доставлялись в научно-образовательную лабораторию коллективного пользования КазНМУ им. С. Д. Асфендиярова.
В лаборатории производили посев материала на Columbia agar, «Biomeriux», Франция с добавлением 5% бараньей крови, на один сектор накладывали диск с гентамицином. Инкубацию производили в вакуумных контейнерах с использованием газогенераторных пакетов GenBox «Biomeriux», Франция при температуре 37°С в течение 24 ч. Спустя сутки инкубации изучали морфологию колоний, выросших вокруг диска, пропитанного гентамицином на наличие а-гемолиза и образование блюдцеобразных колоний и/или колоний с вдавленным центром. Фенотипическую идентификацию производили тестами на чувствительность к оптохину (Biomeriux, Франция) и лизису в присутствии желчных кислот (диски с желчью НИЦФ, Россия).
Чувствительность к оптохину оценивали по задержке роста вокруг диска. При наличии зоны задержки роста более 14 мм, культура считалась оптохиночувствительной. Если зона задержки роста была менее 14 мм, культура интерпретировалась как оптохинорезистентная.
Для определения лизиса солями желчных кислот использовали смоченный дистилированной водой диск с желчью. Посев инкубировали в термостате 2 ч. Положительным тест расценивался при наличии прозрачной зоны вокруг диска (или зоны лизиса культуры) в размере 1—2 мм.
При положительных тестах фенотипической идентификации сохраняли штаммы в криопробирках при температуре -70°С для дальнейшего изучения молекулярно-генетическим методом ПЦР и проведения молекулярного типирования.
Идентификация других микроорганизмов проводилась на основе морфологии, культуральных и биохимических свойств, характерных для этих видов.
Молекулярно-генетические методы исследования. Выделение ДНК.. Для выделения ДНК S.pneumoniae использовали исходный материал и чистые культуры в криопробирках. В качестве гена-мишени при проведении ПЦР использовали ген cpsA.
Перед проведением экстракции лизирующий раствор и раствор для отмывки 1 прогревали при температуре 65°С до полного растворения кристаллов. Следующим этапом в пробирках, содержащих физиологический раствор, готовили взвесь бактериальных клеток. Отрицательным контролем считали пустую пробирку. В чистые пробирки добавляли 300 мкл лизирующего раствора и вносили 100 мкл бактериальной взвеси. Пробирки тщательно перемешивали в вортексе и прогревали в термостате при температуре 65°С в течение 5 мин.
После центрифугирования 10000 об/мин в течение 30 с, универсальный сорбент ресуспендировали и добавляли в каждую пробирку с последующим перемешиванием на вортексе с паузой в 5 мин. Универсальный сорбент осаждали центрифугированием и аккуратно надосадочную жидкость в количестве 420 мкл удаляли, не затрагивая сорбент. В пробы добавляли 300 мкл раствора 1 для отмывки с перемешиванием на вортек-се до полного ресуспендирования универсального сорбента. Снова ресуспендировали универсальный сорбент и отсасывали надосадочную жидкость в количестве 320 мкл. Затем добавляли раствор для отмывки 2 в количестве 1000 мкл с учётом повышенной текучести и перемешивали на вортексе до полного ресуспендирования. Снова осаждали универсальный сорбент центрифугированием в течение 1 мин и удаляли надосадочную жидкость в объёме 1000 мкл. Далее инкубировали пробирки с открытыми крышками в термостате в течение 10 мин при температуре 65°С для подсушивания сорбента. После инкубации пробирки перемещали в штатив и добавляли 90 мкл ДНК буфера с последующим перемешиванием на вортексе. Потом помещали в термостат на 5 мин при температуре 65°С, периодически встряхивая на вортексе. Следующим этапом проводили центрифугирование проб на максимальных оборотах в течение
1—2 мин, с отсасыванием надосадочной жидкости, содержащей очищенную ДНК, и переносом в отдельную пробирку. Пробы хранили при -70°С перед проведением исследования.
Проведение ПЦР-исследования. ПЦР проводили с использованием набора «АмплиСенс PCR» (ИнтерЛабСервис, Россия) по методике. Pai, R. et al.(2006) (13). Заранее готовили 40 реакционных смесей, соответствующих используемым прай-мерам. Приготовленные реакционные смеси использовали в течение месяца, а смеси мультиплексов готовили непосредственно перед постановкой ПЦР. ПЦР-смесь 1 или приготовленные мультиплексы в количестве 5 мкл раскапывали на дно пробирки, затем добавляли расплавленный воск (12—17 мкл). На поверхность застывшего воска добавляли 10 мкл ПЦР-смеси 2 — red, с красителем крезоловым красным, не допуская смешивание ПЦР-смеси 1 и ПЦР-смеси 2, потом добавляли каплю минерального масла (10—15 мкл) и 10 мкл выделенной ДНК. Если на стенках пробирок оставались капли реакционных смесей, минерального масла, ДНК, их слегка прокручивали в центрифуге 1 с. После описанных процедур пробы были готовы к проведению амплификации.
Протокол термоциклирования. Т=94°С — 2 мин, Т=94°С — 10 с, Т=52°С — 15 с, Т=72°С — 10 с, Т=72°С — 2 мин, Т=4°С — хранение образцов ДНК.
Количество циклов амплификации зависело от вида биоматериала, откуда была выделена ДНК. Для чистых культур составляла 32 цикла, для исходного материала — 45.
ПЦР-типирование S.pneumoniae. ПЦР — серотипирова-ние проводилось поочередно, пока не выявлялся положительный результат. На первом этапе обязательным являлось постановка отрицательного контроля с cpsA — праймерами, который служил и «внутренним контролем». Сначала проводили реакции с наиболее часто встречающимися серотипами, с последующим группированием по степени убывания частоты встречаемости серотипов/серогрупп.
Электрофорез. Электрофорез проводили в 2% агарозном геле, погружая в фосфатно-буферный раствор в течение 30 мин под напряжением 30 Вт. Гель промывали в растворе с бромидистым этидием в течение 20 мин. В ультрафиолетовой камере проводили учёт результатов.
Статистический анализ. Подсчёт статистических показателей произведён в программе IBM SPSS 20.0 (отношения шансов по Мантелю—Хенцелю). Доверительный интервал составил 95%.
Результаты исследования
Работы по исследованию пневмококкового назофарингеального носительства проводилось в период с 2014 по 2016 гг. В городе Алматы первый этап исследования начался в октябре 2014 г. и закончился в мае 2015 г. В Караганде исследование началось в январе 2015 г. и завершилось в апреле
2015 г. За указанный период в Алматы было обследовано 250 детей, в Караганде 500 детей. В Караганде 74 ребенка были исключены из исследования как несоответствующие по возрастному критерию.
Второй этап исследования в городах прошел в одинаковый временной период: с марта по июнь
2016 г. В этот период было исследованы 251 ребенок в Алматы и 500 детей в Караганде. В последствие 10 детей из г. Алматы и 67 детей из Караганды, которым было >2 лет, были исключены из исследования как несоответствующие критериям включения (возраст старше 2 лет).
Возраст и тендерные особенности обследуемых детей. Средний возраст обследуемых детей в го-
Таблица 1. Распределение обследованных детей по возрастным группам в зависимости от года исследования и региона исследования
Возрастные группы Алматы Караганда
2014-2015 гг. 2016 г. 2015 г. 2016 г. ~
п % п % п % п %
До 2 мес 27 61,4 17 38,6 181 59,7 122 40,3
От 2 до 12 мес 158 58,7 111 41,3 73 39,0 114 61,0
От 12 мес до 24 мес 65 36,5 113 63,5 172 46,6 197 53,4
Таблица 2. Микроорганизмы, выделенные бактериологическим методом из носоглотки здоровых детей до 2 лет (г. Алматы)
Микроорганизм 2014—2015 гг. 2016 г.
п % п %
Staphylococcus aureus 43 17,2 41 17,0
Staphylococcus epidermidis 31 12,4 64 26,6
Streptococcus pneumoniae 27 10,8 4 1,7
Streptococcus viridans 18 7,2 14 5,8
Klebsiella oxytoca 0 0 1 0,4
Corynebacterium spp. 0 0 14 5,8
Отсутствие роста 130 52,0 101 41,9
Комбинация S.viridans+S.epidermidis 0 0 1 0,4
Комбинация S.aureus+S.pneumoniae 1 0,4 1 0,4
роде Алматы (2014—2015 гг.) составил 8,48; 95% ДИ — 7,712—9,24 мес, в городе Караганда (2015 г.) — 9,03; 95% ДИ — 8,25—9,81. В 2016 г. возраст обследуемых детей в городе Алматы равен 12,17; 95% ДИ — 11,27—13,07 мес и в городе Караганда — 10,38; 95% ДИ — 9,64—11,13.
Распределение по возрастным группам представлено в табл. 1.
В первый год исследования распределение по полу составило: мальчики — 49,2% («=123), девочки 50,8% («=127) в городе Алматы, и в Караганде мальчиков — 47,4% («=202), девочек — 52,6% («=224).
Во второй год исследования распределение по полу в Алматы: мальчики — 49,8% («=120) и девочки — 50,2% («=121), в Караганде: мальчики — 48,0% («=208) и девочки — 52,0% («=225).
История вакцинации против пневмококковой инфекции. В 2015 г. в Караганде из 426 исследуемых 168 (39,44%) детей имели положительную вакцинальную историю против пневмококковой инфекции. Полный курс вакцинации получили 92,9% («=156), неполный курс одной дозой — 4,2% («=7), двумя дозами — 2,9% («=5).
В 2016 г. в Караганде из 433 исследуемых детей, у 198 (45,7%) отмечен положительный статус вакцинации. Из них 97,0% («=192) завершили вакцинацию полным курсом, 1,5% («=3) — иммунизированы только одной дозой, 1,5% («=3) получили 2 дозы вакцины.
В Алматы, во второй этап исследования вошли дети с отрицательной историей вакцинации против пневмококковой инфекции.
Микробный пейзаж носоглотки. Для описания микробного пейзажа носоглотки использовали результаты посевов, полученных от детей, про-
живающих в г. Алматы и изначально не вакцинированных (табл. 2).
Во время первого этапа исследования в г. Алматы бактериологически были выделены четыре микроорганизма: S.aureus, S.epidermidis, S.pneumoniae, S.viridans, но большую часть составили культуронегативные образцы. Комбинация S.aureus и S.pneumoniae, выделенная микробиологическим путём, отмечена в одном случае.
Идентификация микроорганизмов методом ПЦР, с прицельным поиском S.pneumoniae выявила 100% подтверждение верификации выделенных культур как S.pneumoniae, и в двух случаях сочетание бактериологически выделенного S.aureus и ПЦР-идентифицированного S.pneumoniae.
Во второй этапе исследования микробиота носоглотки была представлена разнообразными группами микроорганизмов. Были обнаружены и идентифицированы: S.epidermidis — в 26,6% (n=64), S.aureus — в 17,0% (n=41), S.viridans — 5,0% (n=14), S.pneumoniae — 1,7% (n=4), Klebsiella oxytoca — 0,4% (n=1) и комбинация S.aureus и S.pneumoniae — 0,4% (n=1).
Культуронегативные образцы материала составили 41,9% (n=101) всех образцов.
Последующее изучение исходного материала методом ПЦР идентифицировало 13 образцов культура-отрицательного материала как S.pneumoniae — положительные образцы.
Сочетание культурально выделенного S.aureus и S.pneumoniae, определенного методом ПЦР, составило 1,7% (n=4). Из образцов, содержащих S.epidermidis, в 7 был обнаружен S.pneumoniae. В образцах с неспецифической микрофлорой 1,7% (n=4) идентифицирован S.pneumoniae методом ПЦР.
Рис. 1. Дендрограмма генетических профилей E.colio продукцией БЛРС, выделенных из гемокультуры (п=11).
Штаммы Б.ртытотае, выделенные бактериологическим методом, подтверждены методом ПЦР.
На первом этапе исследования в Караганде было выделено бактериологическим методом 6 штаммов З.ртытотае, тогда как методом ПЦР было идентифицировано 20 образцов, в том числе 6 культур З.ртытотае.
В течение второго этапа исследования в Караганде было выделено культуральным методом 3 штамма Б.ртытотае, а методом ПЦР было идентифицировано 73 культуро-негативных образцов клинического материала и 3 штамма, выделенных бактериологическим методом.
Распространённость назофарингеального носи-тельства Б.рпеишопгае у детей до 2 лет. В городе Алматы до введения вакцинации частота носи-тельства составила 15,6% (39/250), тогда как в Караганде, где на момент проведения исследования вакцинация проводилась уже в течение 2 лет, частота носительства равнялась 4,7% (20/426).
Частота носительства в 2016 г. в городе Алма-ты, как в городе с проводимой вакцинацией в течение 10 мес, составила 14,1% (34/241), тогда как в Караганде — 17,6% (76/433).
Соотношение шансов и рисков приобретения назофарингеального носительства Б.рпеишопгае для региона с проводимой вакцинацией против пневмококковой инфекции. Был проведён анализ общего отношения шансов (ОЯ) по Мантелю—Хенцелю назофарингеального носительства Б.ртытотае у вакцинированных и невакцинированных детей. Для расчёта взяли общее число детей в Караганде, обследованных в течение 2 лет в — 859 детей, из которых вакцинированы 366 детей. Результат составил 1,859; 95% ДИ — 1,221—2,852, указываю-
щий на значительный, статистически достоверный шанс приобретения носительства среди невак-цинированных детей.
Оценка риска приобретения пневмококкового назофарингеального но-сительства в группе невак-цинированных детей составила 1,351; 95% ДИ -1,069-1,708.
В группе вакцинированных детей оценка рисков отсутствия носительст-ва равен 1,073; 95% ДИ -1,020-1,129.
Серотиповой пейзаж циркулирующих штаммов S.pneumoniae на территории регионов с разным статусом вакцинации против пневмококковой инфекции в 2014—2015 гг. Принимая во внимание отсутствие данных в Республике Казахстан по оценке циркулирующих серотипов S.pneumoniae до введения вакцинации, особый интерес вызывает изучение се-ротипового пейзажа в г. Алматы до введения вакцинации.
Результаты определения серотипов S.pneumo-niae представлены на рис. 1.
Благодаря использованию метода мульти-плекс-ПЦР для серотипирования штаммов S.pneumoniae, удалось установить мультиноси-тельство штаммов у 8 (20,5%) детей, из которых у 5 (12,8%) была выделена комбинация двух серотипов. Возраст детей с мультиносительством серотипов 3 и 13, 4 и 12F составил 3 и 6 мес. Сочетания серотипов 8 и 15А, 15B/C и 31 были идентифицированы у детей в возрасте 23 и 24 мес. У ребенка 10 мес определены серотипы 13 и 19F.
У трёх детей (7,7%) была выделена комбинация трёх серотипов: 13, 15B и 17F, 10F/10C/33C, 12F/12A/44/46 и 17F, 15В/С, 19F и 23F. Возраст детей с носительством трёх серотипов составил 3, 8 и 21 мес.
В Караганде мультиносительство было установлено только у одного ребёнка 19 мес и представлено серотипами 15В и 38.
Серотиповой пейзаж циркулирующих штаммов Streptococcus pneumoniae на территории регионов с разным статусом вакцинации против пневмококковой инфекции в 2016 г. Исследование циркулирующих серотипов в Алматы спустя 10 мес после начала вакцинации против пневмококковой инфекции показывает изменение композиции циркулирующих штаммов всех серотипов за счёт увеличения количества невакцинных серотипов
и нетипируемых штаммов. Количество идентифицированных серотипов S.pneumoniae — 12.
Результаты определения серотипов S.pneumoniae представлены на рис. 2.
Мультиносительство установлено у четырёх детей (11,8%), с сочетанием серотипов 15A и 39F, 15А и 31, 15А и 15В, 6В и 19F у детей в возрасте до 1 года (дети 7, 8, 10 и 11 мес жизни).
Картина циркулирующих штаммов в Караганде представлена преимущественно серотипами, не входящими в состав ПКВ (70,1%) и нетипируемыми штаммами (23,4%). Одновременное носительство двух серотипов 6В и 19F
было определено в 1,3% случае (n=1). Возраст ребенка составил 4 мес.
Обсуждение результатов
Нами было проведено первое исследование по установлению частоты пневмококкового но-сительства среди невакцинированных и вакцинированных детей в возрасте до 2 лет в Казахстане. В данном исследовании мы хотели показать уровень носительства пневмококка и различия в серотиповом пейзаже в регионах до начала вакцинации и разной длительностью проводимой вакцинации против пневмококковой инфекции. К сожалению, в Караганде не проводилось исследование распространённости пневмококкового носительства до начала противопневмококковой вакцинации.
Первый этап нашего исследования, проводимый в 2014—2015 гг., показал разный уровень носительства S.pneumoniae в Алматы до вакцинации и в Караганде с двухлетней историей вакцинации против пневмококковой инфекции. Распространённость пневмококкового носительства в Алма-ты и Караганде составила 15,6 и 4,7%.
Мы предполагаем, что на уровень носительст-ва повлияло введение поэтапной вакцинации против пневмококковой инфекции с 2010 г. По данным агентства исследований SANGE, на 2011 год г. Алматы и Карагандинская область стали регионами с наиболее высоким и высоким уровнями миграционной подвижности населения, и перемещение внутренних мигрантов из регионов, где вакцинация уже проводится, по нашему мнению, способствовало стиранию картины истинной распространённости пневмококкового носи-
Рис. 2. Дендрограмма генетических профилей S.pneumoniae с продукцией БЛРС, выделенных из гемокультуры (n=8).
тельства и циркуляции вакцинных серотипов [14]. Показатель назофарингеального носительства в данныгх регионах значительно ниже французских и голландских данных, полученных после широкого применения ПКВ7 и замены ПКВ7 на ПКВ13 [15, 16]. Уровень пневмококкового носительства в РФ, которая территориально граничит с Казахстаном значительно выше, и был определен на уровне 44—46,7% среди детей в возрасте до 5 лет открытых и закрытых коллективов [8]. Совместные данные о частоте носительства в Украине и Белоруссии получены от детей до 5 лет из детских домов, и частота пневмококкового носительства составила 75,2% [17]. Данные по частоте носительства и серотипового пейзажа в других странах СНГ отсутствуют.
Казахстан географически расположен в Средней Азии и территориально граничит с Китаем, поэтому мы посчитали целесообразным провести сравнение пневмококкового носительства со странами Юго-Восточной Азии до и после введения вакцинации против пневмококковой инфекции. По данным мультинационального исследования А^ОЯР уровень носительства среди стран Юго-Восточной Азии существенно различается между собой, достигая максимума в Индии — 43,2% и минимального уровня в Сингапуре — 9,0%. В Китае уровень носительства составил 37,5% [18]. Эти данные получены у детей младше 5 лет и они ниже показателей европейских стран и США.
Данные второго этапа исследования показали, что в Алматы, где вакцинация проводилась в течение 10 мес, частота пневмококкового носи-тельства составила 14,1%, и в Караганде — 17,6%. Учитывая, что это исследование — кросс-секци-
онное, то изменения в частоте носительства за 2 года мы на данном этапе оценить не можем.
Стоит отметить, что во время первого этапа исследования в Казахстане была приостановлена вакцинация от пневмококковой инфекции в течение 6 мес. Мы предполагаем, что сформировавшийся популяционный эффект проводимой вакцинации в Караганде повлиял на уровень но-сительства и серотиповой пейзаж циркулирующих в этом регионе серотипов, следовательно, прекращение вакцинации в течение длительного срока привело к увеличению числа детей-носителей S.pneumoniae в Караганде во втором этапе исследования.
Серотиповой пейзаж в Казахстане отличается от данных других стран, полученных до введения вакцинации. Мы выявили разнообразие циркулирующих штаммов, с распространённостью 6ABC, 13, 15В/С, 17F и 19F в Алматы до введения вакцинации и 15В, 31, 38 в Караганде спустя 2 года проводимой вакцинации, тогда как в зарубежных публикациях имеются данные о превалирующей циркуляции серотипов 6A, 6B, 19А, 19F, 23F в странах с разным уровнем дохода [19].
Мы отмечаем, что в 2014—2015 гг. штаммы S.pneumoniae удалось серотипировать в 94% и 76,2% случаев в Алматы и Караганде, соответственно, тогда как в 2016 г. процент типируемых штаммов стал ниже — 72,2% в Алматы и 76,2% в Караганде. Эти данные совпадают с данными южнокорейских исследователей, которые обнаружили распространённость нетипируемых серо-типов до 30,6% среди вакцинированных и 22,2% невакцинированных детей [20].
Увеличение частоты нетипируемых штаммов S.pneumoniae мы связываем с применением метода мультиплекс-ПЦР, который обладает высокой чувствительностью и специфичностью, но способен идентифицировать всего 22 серотипа и 17 «серогрупп», тогда как в настоящее время известно 97 серотипов [13, 21]. Применение противо-пневмококковой вакцинации ассоциировано с развитием феномена «замены серотипов», чем
ЛИТЕРАТУРА
1. Tuomanen E.I., Mitchell T.J., Morrison D, Spratt B.G. The Pneumococcus: American Society of Microbiology; 2004.
2. Simell B, Auranen K., Kayhty H, Goldblatt D, Dagan R., O'Brien K.L. et al. The fundamental link between pneumococcal carriage and disease. Expert Review of Vaccines. 2012; 11 (7): 841—855.
3. WHO Pneumococcal disease [updated 2016/04/10/14:43:20]. Available from: http://www.who.int/immunization/topics/pneumococcal_disease/en/.
4. Hava D.L., LeMieux J., Andrew C. From nose to lung: the regulation behind Streptococcus pneumoniae virulence factors. Molecular Microbiology 50 (4): 1103—1110.
5. Hausdorff W.P., Feikin D.R., Klugman K.P. Epidemiological differences among pneumococcal serotypes. Lancet Infect Dis. 2005; 5 (2): 83—93.
6. Kayhty H, Auranen K, NohynekH, Dagan R, Makela H. Nasopharyngeal colonization: a target for pneumococcal vaccination. Expert Rev Vaccines. 2006; 5 (5): 651—667.
мы объясняем увеличение пропорции нетипируемых штаммов.
В нашем исследовании отмечается, что до введения вакцинации в Алматы 69,2% штаммов S.pneumoniae были выделены бактериологическим путем, в 2016 г. только 11,8% штаммов S.pneumoni-ae были выделены классическими микробиологическими методами, и отмечается 100% подтверждение бактериологического метода методом ПЦР. Мы объясняем низкий процент выделения наличием в циркуляции S.aureus, который является антагонистом S.pneumoniae, что подтверждает идентификация S.pneumoniae методом ПЦР, а также наличие культуральных свойств, относящих S.pneumoniae к «прихотливым» микроорганизмам.
Изменение пропорций циркулирующих штаммов возможно связано с тем, что была введена вакцинация против пневмококковой инфекции, но не исключается воздействие других факторов: вирусные инфекции, приём антибактериальных препаратов, что в нашем исследовании не фиксировалось, и, следовательно, не учитывалось при анализе результатов.
Таким образом, исходя из полученных результатов и опираясь на данные литературы, считаем, что микробиологический мониторинг необходим для оценки динамики изменения назофарингеального носительства и серотипово-го пейзажа в регионе с проводимой вакцинацией для последующей разработки мер профилактики пневмококковой инфекции.
Источник финансирования: грант ООО «Вак-цинология»
Благодарности. Мы благодарим сотрудников поликлиник №12 и №3 г. Алматы Позднову Светлану Юрьевну и Нурсаитову Рабиям Амардинов-ну, Сейсенбаеву Айгуль Наухановну за отбор детей и сбор образцов для исследования.
Особую благодарность выражаем лаборанту кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии КазНМУ им. С. Д. Асфендиярова Тисло-вой Ольге Егоровне за проведение микробиологической идентификации S.pneumoniae.
7. Hill P.C., Cheung Y.B., Akisanya A., Sankareh K, Lahai G., Greenwood B.M. et al. Nasopharyngeal Carriage of Streptococcus pneumoniae in Gambian Infants: A Longitudinal Study. Clin Infect Dis 2008; 46 (6): 807-814.
8. Холодок Т.Н., Морозова HB., Алексеева И.Н., Стукун Е.А., Краковская A.B., Морозова О.И. et al. Частота выявления и характеристика штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных от носителей и больных у детей в Хабаровском крае. Журн микробиол эпидемиол иммунобиол 2010; 4: 92—97. / Holodok G.N., Morozova N.V., Alekseeva I.N., Stukun E.A., Krakovskaja A.V., Morozova O.I. et al. Chastota vyjavlenija i harakteristika shtammov Streptococcus pneumoniae, vydelennyh ot nositelej i bol'nyh u detej v Habarovskom krae. Zhurn mikrobiol jepidemiol immunobiol 2010; 4: 92—97. [in Russian]
9. Козлов P.C., Чагарян A.H., Козлова Ë.B., Муравьев A.A. Серологическая характеристика и чувствительность к антибиотикам пневмококков, выделенных у детей до 5 лет от отдельных регионах Российской Федерации. Клин микробиол антимикроб тер 13 (2): 177—187. / Kozlov R.S., Chagarjan A.N., Kozlova L.V., Murav'ev A.A. Serologicheskaja harakteristika i chuvstvitel'nost' k antibiotikam pnevmokokkov, vydelennyh u detej do 5 let ot otdel'nyh regionah
Rossijskoj Federacii. Klin mikrobiol antimikrob ter 13 (2): 177—187. [in Russian]
10. Костюкова H.H, Сахарова A.E., Баймуратова M.A., Гукасян Л.А. Ти-пирование пневмококков в реакции коагглютинации. Лаб дело 1988; 9: 60—62. / Kostjukova N.N, Saharova A.E., Bajmuratova M.A., Gukasjan L.A. Tipirovanie pnevmokokkov v reakcii koaggljutinacii. Lab delo 1988; 9: 60-62. [in Russian]
11. Национальная программа «Саламатты Казахстан» на 2011-2015 гг. Available from: https://strategy2050.kz/ru/page/gosprog1/. / Nacional'naja programma «Salamatty Kazahstan» na 2011-2015 gg. Available from: https://strategy2050.kz/ru/page/gosprog1/. [in Russian]
12. Satzke C, Turner P., Virolainen-Julkunen A, Adrian P.V., Antonio M, Hare K.M. et al. Standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae: Updated recommendations from the World Health Organization Pneumococcal Carriage Working Group. Vaccine 2013; 32 (1): 165-179.
13. Pai R, Gertz R.E., Beall B. Sequential multiplex PCR approach for determining capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae isolates. J Clin Microbiol 2006; 44 (1): 124-131.
14. Агенство исследований SANGE. Анализ миграционной подвижности населения Республики Казахстан по итогам национальной переписи населения 2009 года. Агенство республики Казахстан по статистике, editor. stat.gov.kz 2011. / Agenstvo issledovanij SANGE. Analiz migracionnoj podvizhnosti naselenija Respubliki Kazahstan po itogam nacional'noj perepisi naselenija 2009 goda. Agenstvo respubliki Kazahstan po statistike, editor. stat.gov.kz 2011. [in Russian]
15. Bosch A.A., van Houten M.A., Bruin J.P., Wijmenga-Monsuur A.J., Trzcinski K, Bogaert D. et al. Nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae and other bacteria in the 7th year after implementation of the pneumococcal conjugate vaccine in the Netherlands. Vaccine 2016; 34 (4): 531-539.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Рамазанова Бахыт Аманулловна - д. м. н., профессор, проректор по научной работе и инновациям КазНМУ им. С. Д. Асфендиярова, Алматы, Республика Казахстан Ералиева Ляззат Тасбулатовна - д. м. н., директор НИИ ФПМ им. Б. Атчабарова, Алматы, Республика Казахстан
16. Cohen R., Levy C., Bingen E., Bechet S., Derkx V., Werner A. et al. Nasopharyngeal carriage of children 6 to 60 months during the implementation of the 13-valent pneumococcal conjugate vaccine. Arch Pediatr 2012; 19 (10): 1132-1139.
17. Муравьев A.A., Чагарян A.H., Братусъ E.B., Перцева Т.А., Карпов И.А., Качанко Е.Ф. Серологическая характеристика и чувствительность к антибиотикам серотипов Streptococcus pneumoniae, циркулирующих в различных регионах Беларуси и Украины, выделенных. Клин микробиол антимикроб тер 2013; 15 (2): 147-158. / Murav'ev A.A., Chagarjan A.N., Bratus' E.V., Perceva T.A., Karpov I.A., Kachanko E.F. Serologicheskaja harakteristika i chuvstvitel'nost' k antibiotikam serotipov Streptococcus pneumoniae, cirkulirujushhih v razlichnyh regionah Belarusi i Ukrainy, vydelennyh. Klin mikrobiol antimikrob ter 2013; 15 (2): 147-158. [in Russian]
18. Lee N.Y., Song J.H, Kim S, Peck K.R., Ahn K.M., Lee S.I. et al. Carriage of antibiotic-resistant pneumococci among Asian children: a multinational surveillance by the Asian Network for Surveillance of Resistant Pathogens (ANSORP). Clin Infect Dis 2001; 32 (10): 1463-1469.
19. Adegbola R.A., DeAntonio R, Hill P.C., Roca A., Usuf E, Hoet B. et al. Carriage of Streptococcus pneumoniae and Other Respiratory Bacterial Pathogens in Low and Lower-Middle Income Countries: A Systematic Review and Meta-Analysis. PLoS ONE 2014; 9 (8): e103293.
20. Kim K.H., Hong J J, Lee H., Kwak G.Y., Nam C.H., Lee S.Y. et al. Nasopharyngeal pneumococcal carriage of children attending day care centers in Korea: comparison between children immunized with 7-valent pneumococcal conjugate vaccine and non-immunized. J Korean Med Sci 2011; 26 (2): 184-190.
21. Geno K.A., Gilbert G.L., Song J.Y., SkovstedI.C., Klugman K.P., Jones C. et al. Pneumococcal Capsules and Their Types: Past, Present, and Future. Clin Microbiol Rev 2015; 28 (3): 871-899.
Мустафина Камиля Камаловна - к. м. н., профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии, Ал-маты, Республика Казахстан
Колоскова Екатерина Aлександровна - PhD докторант 3-го года обучения кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Алматы, Республика Казахстан
