CC BY
53
Смена серотипов Streptococcus pneumoniae у детей, вакцинированных 7-валентной конъюгированной вакциной
И.Н. Протасова1- 3 ([email protected]), Н.В. Бахарева2, О.В. Перьянова1 3 Т.А. Елистратова1, М.В. Коваль4
1ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России Министерство здравоохранения Красноярского края, г. Красноярск 3Российско-Японский центр микробиологии, эпидемиологии и инфекционных заболеваний, г. Красноярск
4КГБУЗ «Красноярский краевой специализированный дом ребенка № 3», г. Красноярск
Резюме
Представлены данные обследования группы детей (183 ребенка) в возрасте до пяти лет до вакцинации против пневмококковой инфекции и 171 ребенка той же группы через два года после вакцинации пневмококковой 7-валентной конъюгированной вакциной Превенар с целью выявления носительства Streptococcus pneumoniae и определения серотиповой принадлежности штаммов, циркулирующих на территории г. Красноярска. Такое исследование на территории региона проводится впервые и является обоснованием для выбора оптимальной стратегии вакцинопрофилактики пневмококковых заболеваний. Распространенность бактерионосительства среди детей до вакцинации составила 51,4%, после вакцинации - 31,6%. От невак-цинированных детей выявляли преимущественно серотипы 23F и 19F; через два года после вакцинации произошло значительное изменение серотипового пейзажа с преобладанием серотипа 19А.
Ввиду высокого уровеня носительства и с учетом спектра циркулирующих серотипов пневмококка детям в возрасте до пяти лет необходимо проведение специфической профилактики пневмококковых инфекций с применением 13-валентной пневмококковой конъюгированной вакцины.
Ключевые слова: Streptococcus pneumoniae, серотипы, дети, вакцинация
changing Streptococcus pneumoniae Serotypes in children Vaccinated with 7-Valent conjugate Vaccine
I.N. Protasova1,3([email protected]), N.V. Bahareva2, O.V. Peryanova1,3, T.A. Elistratova1, M.V. Koval'4 1State Budgetary Educational Institution of Higher Professional Training «The Krasnoyarsk State Medical University named by Prof. V.F. Woino-Yasenetsky» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation 2The Ministry of Healthcare of Krasnoyarsk Region, Krasnoyarsk
3Russian-Japan Center for Microbiology, Epidemiology and Infectious Diseases, Krasnoyarsk
4Budgetary Health Agency «Specialized Orphanage № 3», Krasnoyarsk
Abstract
Data from Streptococcus pneumoniae carriage and serotypes distribution in Krasnoyarsk region study of the group of children < 5 years old (183 children) before vaccination and 171 child of the same group in two years after vaccinationby 7-valent pneumococcal conjugate vaccine Prevenar is presented. This is the first study of that type in the region and the study results can be used for justification of the optimal strategy for pneumococcal diseases prevention by vaccination.
Prevalence of nasopharyngeal carriage of bacteria in children before vaccination was 51.4%, after vaccination - 31.6%. Serotypes 23F and 19F prevailed before pneumococcal vaccination; in two years after vaccination there was a considerable change in the serotype landscape to the prevalence of the serotype 19A.
High level of S.pneumoniae nasopharyngeal carriage and serotypes distribution in children under 5 years of age both support the need
for vaccination by 13-valent pneumococcal conjugate vaccine.
Key words: Streptococcus pneumoniae, serotypes, children, vaccination
Введение случаев тяжелых пневмококковых заболеваний Streptococcus pneumoniae - основной воз- (включая пневмонию, менингит и сепсис), приво-будитель внебольничной пневмонии, менингита, дящих к летальному исходу приблизительно в полусреднего отита и синусита у детей до пяти лет. По миллионе случаев [1, 2].
данным ВОЗ, среди детей этой возрастной группы В Красноярске и Красноярском крае о распро-
в мире ежегодно регистрируется около 14,5 млн страненности пневмококковой инфекции косвенно
можно судить по высокому уровню заболеваемости пневмониями, болезнями уха и сосцевидного отростка. Количество случаев пневмоний среди детей Красноярского края в возрасте 0 - 14 лет в 2010 году составило 620,2, в 2011 году- 597,3, в 2012 году - 558,4 на 100 тыс. детей, при этом в большинстве случаев заболевание развивалось у детей первых двух лет жизни [3, 4]. Показатель заболеваемости болезнями уха и сосцевидного отростка составил в 2010 году 5566, в 2011 году - 5837 и в 2012 году - 5985 на 100 тыс. детского населения Красноярского края, что превышает общероссийские показатели на 3,6, 6,7 и 9,8% соответственно [5].
Развитию вышеперечисленных заболеваний зачастую предшествует носительство пневмококка, широко распространенное среди детей в возрасте до пяти лет, особенно находящихся в организованных коллективах, где происходит быстрое распространение S. pneumoniae (в том числе антибиотико-резистентных штаммов) вследствие большого количества детей и тесных контактов между ними [6]. По данным некоторых авторов (D.F. Verstrheim et al., 2008), уровень носительства пневмококков у детей до пяти лет, посещающих детские сады, достигает 78,4%, в том числе у детей двух-трех лет -88,7% [7].
В настоящее время известно более 90 серотипов ^ S. pneumoniae. По литературным данным, спектр се-I ротипов, вызывающих неинвазивные пневмококко-°° вые заболевания (средний отит и синусит) у детей ^ до пяти лет, характеризуется значительным разного образием; инвазивные инфекции, как правило, об-| условлены типами 1, 5, 6А, 6В, 14, 19F и 23F [8]. | Некоторые серотипы (6B, 9V, 14, 19A, 19F и 23F) "о чаще других ассоциированы с лекарственной устой-§ чивостью [9]. По данным многих авторов, частота f встречаемости различных серотипов и уровень ре™ зистентности S. pneumoniae к антибактериальным g препаратам могут существенно различаться в зави-§ симости от региона [8, 9, 10, 11]. | В г. Красноярске и Красноярском крае пробле-
I ма пневмококковой инфекции до настоящего врет мени остается неизученной. В то же время финансовые затраты региона на лечение острых отитов, менингитов, сепсиса пневмококковой этиологии у детей раннего возраста весьма значительны: только прямые затраты на лечение пневмоний у детей 0 - 14 лет ежегодно составляют 10,5 - 11 млн рублей [4].
Вакцинопрофилактика пневмококковой инфекции у детей г. Красноярска была начата в 2009 году (в рамках городской целевой программы «Вакцинопрофилактика») с иммунизации детей из групп риска (часто болеющих, с хронической бронхолегочной патологией, врожденными пороками сердца, ВИЧ-инфицированных и рожденных ВИЧ-позитивными матерями и т.д.). В 2011 году иммунизация против пневмококковой инфекции была включена в Региональный календарь про-
филактических прививок. Ежегодный охват вакцинацией в Красноярске увеличивался в 2 -2,5 раза в возрастной когорте 0 - 5 лет и в 1,2 -2 раза - среди всего детского населения. К середине 2012 года охват вакцинацией против пневмококковой инфекции детей в возрасте до пяти лет составил 9,6%. Для иммунизации большинства детей использовалась 7-валентная пневмококковая конъюгированная вакцина (ПКВ7) Превенар.
Цель исследования - изучение распространенности и серотиповой принадлежности S. pneumoniae для оптимизации стратегии вакци-нопрофилактики пневмококковой инфекции у детей Красноярска и Красноярского края.
Материалы и методы
Исследование проводилось в два этапа. На первом этапе с целью выявления носительства и определения преобладающих серотипов S. pneumoniae было обследовано 183 невакцинированных против пневмококковой инфекции ребенка в возрасте до пяти лет (средний возраст 2 ± 1,2 года), из которых 113 детей находились в детских организованных коллективах (Красноярский краевой дом ребенка № 3, дошкольные образовательные учреждения № 44, 64 и 222 г. Красноярска). Исследование проводилось в мае - июне 2011 года. После обследования все дети были вакцинированы вакциной Превенар, схемы вакцинации соответствовали возрасту.
На втором этапе исследования (май - декабрь 2013 года, через два года после вакцинации) данная группа детей была обследована повторно. В исследование был включен 171 иммунизированный ребенок, из них 131 ребенок находился в детских организованных коллективах.
Материал для исследования забирался из носоглотки с помощью вискозных зонд-тампонов со средой Амиес (MEUS, Италия). Для выделения пневмококков использовали кровяной агар на основе Columbia Agar (Bio-Rad, Франция) с добавлением 5%-ной эритроцитарной массы [12], а также Chocolate Agar Base без селективной добавки (HiMedia, Индия). Инкубация осуществлялась в эксикаторе при температуре 35 0С в течение 24 часов. Идентификация пневмококков проводилась на основании морфотинкториальных, куль-туральных, антигенных свойств (Slidex pneumo-Kit, bioMe^ux, Франция) чувствительности к желчи и оптохину. Для хранения штаммов при температуре -80 0С использовали триптиказо-соевый бульон (CONDA Pronadisa, Испания) с добавлением 30%-ного глицерина.
ПЦР-серотипирование S. pneumoniae проводили методом мультиплексной ПЦР, используя 40 пар праймеров, рекомендованных CDC, США [13].
Фрагменты cps-генов, имеющихся у всех кап-сульных штаммов S. pneumoniae, амплифициро-вали по следующему температурному профилю: при 94 °С - 2 минуты; при 94 °С - 15 секунд,
при 56 0С - 10 секунд, при 72 0С - 15 секунд, 35 циклов при 72 0С - 10 минут; при 4 0С - хранение [14]. Данная реакция использовалась в качестве теста, подтверждающего принадлежность к пневмококкам.
39 пар праймеров, используемых для амплификации фрагментов cps-генов, кодирующих серо-группы/серотипы 1, 2, 3, 4, 5, 6A/6B/6C, 7F/7A, 7C/(7B/40), 8, 9L/9N, 9V/9A, 10A, 10F/(10C/33C), 11A/11D, 12F/(12A/44/46), 13, 14, 15A/15F, 15B/15C, 16F, 17F, 18A/18B/18C/18F, 19A, 19F, 20, 21, 22A/22F, 23A, 23B, 23F, 24A/24B/24F, 31, 33F/(33A/37), 34, 35A/(35C/42), 35B, 35F/47F, 38F/25F, 39F, были сгруппированы в 10 мультиплексных реакций, проводимых последовательно [14]. Амплификация осуществлялась на приборе Applied Biosystems (Life Technologies, Germany) по следующему температурному профилю: при 94 0С - 2 минуты, при 94 0С - 15 секунд, при 56 0С - 10 секунд, при 72 0С - 15 секунд; 35 циклов при 72 0С - 10 минут; при 4 0С - хранение.
Продукты амплификации детектировали в 1,5%-ном агарозном геле (Sigma, США) с последующей визуализацией бромистым этидием (ЦНИИ эпидемиологии, Москва) при УФ-излучении (к = 310 нм) в трансиллюминаторе Molecular Imager® Gel Doc XR System (Bio-Rad, США). Размеры ПЦР-продуктов определяли в сравнении с маркером молекулярного веса ДНК (100 bp DNA Ladder; «Ев-роген», Россия).
Статистическая обработка и анализ полученных результатов осуществлялись с использованием компьютерной программы Statistica 6.0. Для проведения анализа на нормальность распределения признака использовали критерий Колмогорова-Смирнова. Достоверность различий полученных результатов оценивалась с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Досто-
верными считали различия при достигнутом уровне статистической значимости P < 0,05. Средняя ошибка доли рассчитывалась по формуле Г. Шварца (1978) [15].
Результаты и обсуждение
В группе невакцинированных детей S. pneumoniae был выделен у 51,4 ± 3,7% из них. Уровень носи-тельства пневмококков среди организованных детей данной группы составил 49,6 ± 3,7%, при этом в доме ребенка и детских садах распространенность бактерионосительства практически не различалась (49,4 и 50% соответственно). Среди неорганизованных детей носительство пневмококков выявлено в 53,4 ± 5,9% случаев, при этом 56,9% из них были из семей с двумя и более детьми, в которых один ребенок или более посещали детский сад либо школу (именно они и составили 75,8% носителей).
62% штаммов принадлежали к серотипам 23F и 19F (рис. 1). Большинство выявленных серотипов описаны в литературе как типы, способные вызывать инвазивные заболевания (23F, 19F, 6, 14, 7AF, 18, 9VA).
Распространенность носительства S. pneumoniae через два года после вакцинации достоверно снизилась и составила 31,6 ± 3,5% (р < 0,001). При этом распределение серотипов существенно изменилось: преобладающим в данной группе детей стал серотип 19А, ранее не встречавшийся у невакцинированных. Также впервые были выявлены серотипы 15ВС, 11AD и 35AC/42. Пневмококки серогруппы 6 встречались достоверно чаще среди привитых детей (P < 0,05) (рис. 2), однако типирование по подгруппам выполнено не было, то есть оценить, какая из разновидностей сероти-па 6 (6А, 6В или 6С) получила преимущественное распространение, не представляется возможным.
Рисунок 1.
Распределение серотипов исследуемых штаммов S. pneumoniae у невакцинированных детей в возрасте до пяти лет (n = 94, доля ± ошибка доли - M ± m)
Рисунок 2.
Распределение серотипов исследуемых штаммов S. pneumoniae у детей в возрасте до пяти лет после вакцинации ПКВ7 (n = 54, доля ± ошибка доли - M ± m)
Клинически в течение первого года после вакцинации наблюдалось значительное снижение частоты острого среднего отита (на 27%); уровень заболеваемости болезнями дыхательных путей (острым назофарингитом, синуситом и бронхитом) снизился на 25%; отсутствовали случаи пневмонии и менингита (данные Красноярского городского управления здравоохранения, 2012 г.).
Среди детей Красноярска в возрасте до пяти лет отмечался высокий уровень носительства S. pneumoniae. У обследованных детей до вакцинации имелись некоторые отличия процентного соотношения серотипов пневмококка от такового в других регионах Российской Федерации: так, пневмококки серогруппы 23 (23F + 23A) составили 43,7% от всех выделенных штаммов, в то время как в других регионах данная серогруппа выявлялась лишь в 9% случаев [16]. Преобладание серотипа 19F было не столь выраженным: 22,4% (по нашим данным) против 47% в других регионах [16]. Обращает на себя внимание большой процент носительства серотипов, способных вызывать инвазивные заболевания: так, у детей в возрасте до пяти лет подавляющее большинство серотипов (91,7%) относилось к «инвазивным».
В настоящее время специфическая профилактика признана действенным методом борьбы с пневмококковой инфекцией у детей и населения в целом за счет популяционного иммунитета.
С 2014 года вакцинация против пневмококковой инфекции включена в Национальный календарь профилактических прививок РФ. Для иммунизации детей в России используются три вакцины, зарегистрированные и прошедшие клинические и эпидемиологические испытания: поли-сахаридная 23-валентная вакцина и две полиса-харидные конъюгированные вакцины: 10-валентная и 13-валентная (последняя является улучшен-
ной версией ранее использовавшейся 7-валентной пневмококковой конъюгированной вакцины Превенар). Данные препараты имеют различный антигенный состав, то есть различаются по количеству и спектру серотипов S. pneumoniae. Как известно, частота встречаемости и распределение серотипов пневмококка зачастую имеют региональные особенности. В связи с этим изучение молекулярно-эпидемиологических характеристик S. pneumoniae является крайне важным для выбора наиболее потенциально эффективной вакцины в том или ином регионе. В Красноярске и Красноярском крае серотипирование пневмококков и исследование их антибиотикорезистентности начато впервые.
Согласно нашим данным, большинство серотипов штаммов S. pneumoniae, полученных от не-вакцинированных детей, относилось к «вакцинно предотвратимым», значительных различий в «перекрытии» серотипов вакцинами, разрешенными к применению на территории РФ, не наблюдалось (91,7% - 10-валентная, 13-валентная и 23-валентная пневмококковые вакцины; 87,4% - Преве-нар). Однако обращает на себя внимание значительное изменение серотипового пейзажа у детей, привитых вакциной Превенар, - преобладание серотипа 19А и существенное увеличение доли пневмококков серогруппы 6 (вероятно, за счет се-ротипа 6А). Данные типы S. pneumoniae не включены в состав 7-валентной и 10-валентной вакцин, серотип 6А не входит и в состав 23-валентной вакцины. Кроме того, известно, что 23-валентная вакцина не рекомендуется к применению у детей младше двух лет ввиду их слабого иммунного ответа на полисахаридные T-независимые антигены, в то время как 13-валентная вакцина, содержащая капсульные полисахариды пневмококков, конъюгированные с белком-носителем CRM197,
рекомендуется к применению у детей уже со второго месяца жизни и обеспечивает стойкий продолжительный иммунитет против входящих в ее состав серотипов, [17].
Выводы
1. В результате проведенного исследования определены молекулярно-эпидемиологические особенности популяции S. pneumoniae, циркулиру-
ющей в Красноярском крае, и ее изменение в результате вакцинации.
2. Установлено, что для вакцинации детей может быть рекомендована 13-валентная пневмококковая конъюгированная вакцина.
3. Для дальнейшей оптимизации вакцинопрофи-лактики в крае необходим мониторинг сероти-повой структуры и антибиотикорезистентности S. pneumoniae. Ш
Литература
1. World Health Organization. Progress in introduction of pneumococcal conjugate vaccine worldwide, 2000 - 2012. Wkly Epidemiol. Rec. 2013; 88: 173 -180. Doi: 10.1371/journal.pone. 0081539.
2. O'Brien K.L., Wolfson L.J., Watt J.P, Henkle E., Deloria-Knoll M., McCall N. et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 2009; 374: 893 - 902. Doi: 10.1016/S0140-6736(09)61204-6.
3. Артюхов И.П., Галактионова М.Ю., Рахимова А.Л. Основные тенденции состояния здоровья подростков города Красноярска. Сиб. мед. обозр. 2012; 6: 47 - 52.
4. Статистические данные Министерства здравоохранения РФ. Доступно на: http://www.rosminzdrav.ru/documents (дата обращения - 15.05.2014).
5. Бахарева Н.В., Протасова И.Н., Перьянова О.В., Кукушкина И.П., Мемнонова С.В., Коваль М.В. Бактерионосительство Streptococcus pneumoniae среди детей города Красноярска. Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2012; 4 (65): 73 - 77.
6. Andrade A.L.S., Franco C.M., Lamaro-Cardoso J., Andre M.C., Oliveira L.L.G., Kipnis A. et al. Non-typeable Streptococcus pneumoniae carriage isolates genetically similar to invasive and carriage isolates expressing capsular type 14 in Brazilian infants. J. of Infect. 2010; 61: 314 - 322. Doi: 10.1016/ jinf.2010.07.003.
7. Verstrheim D.F., Huiby E.A., Aaberge I.S., Caugant D.A. Phenotypic and genotypic characterization of Streptococcus pneumoniae strains colonizing children attending day-care centers in Norway. J. Clin. Microbiol. 2008; 46: 2508 - 2518. Doi: 10.1128/CVI.00435-09.
8. Johnson H.L., Deloria-Knoll M., Levine O.S., Stoszek S.K. Systematic evaluation of serotypes causing invasive pneumococcal disease among children under five: the pneumococcal global serotype project. PLoS Medicine. 2010; 7 (10): e1000348. Doi: 10.1371/journal.pmed.1000348.
9. Reinert R.R. The antimicrobial resistance profile of Streptococcus pneumoniae. Clin. Microbiol. Infect. 2009; 15 (Suppl. 3): 7 - 11.
10. Савинова Т.А., Филимонова О.Ю., Грудинина С.А., Сидоренко С.В. Генетическое разнообразие пенициллиноустойчивых Streptococcus pneumoniae. Журн. инфект. 2009; 1 (4): 66 - 71.
11. Reinert R.R., Filimonova O.Y., Al-Lahham A., Grudinina S.A., Ilina E.N., Weigel L.M. et al. Mechanisms of macrolide resistance among Streptococcus pneumoniae isolates from Russia. Antimicrob. Agents Chemother. 2008; 52 (6): 2260 - 2262.
12. Кречикова О.И., Козлов Р.С., Богданович Т.М., Стецюк О.У, Суворов М.М., Катосова Л.К. Выделение, идентификация и определение чувствительности к антибиотикам Streptococcus pneumoniae: Методические рекомендации. Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. 2000; 2 (1): 88 - 98.
13. CDC Streptococcus Laboratory. Доступно на: http://www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/protocols.htm (дата обращения - 26.06.2014).
14. Савинова Т.А. Генетическое разнообразие и молекулярные основы резистентности Streptococcus pneumoniae к ß-лактамным антибиотикам: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Москва; 2011.
15. Шварц Г. Выборочный метод: Руководство по применению статистических методов оценивания. Пер. с нем. Я.Ш. Паппэ, И.Г. Венецкого, В.М. Ивановой. Москва; Статистика; 1978; 213.
16. Козлов Р.С., Чагарян А.Н., Козлова Л.В., Муравьев А.А. Серологическая характеристика и чувствительность к антибиотикам пневмококков, выделенных у детей в возрасте до пяти лет в отдельных регионах Российской Федерации. Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. 2011; 13 (2): 177 - 187.
17. Рудакова А.В., Баранов А.А., Лобзин Ю.В., Брико Н.И., Намазова-Баранова Л.С., Таточенко В.К. и др. Фармакоэкономические аспекты вакцинации детей 13-валентной пневмококковой конъюгированной вакциной в Российской Федерации. Вопросы современной педиатрии. 2014; 13 (1): 35 - 41.
References
1. World Health Organization. Progress in introduction of pneumococcal conjugate vaccine worldwide, 2000 - 2012. Wkly Epidemiol. Rec. 2013; 88: 173 -180. Doi: 10.1371/journal.pone. 0081539.
2. O'Brien K.L., Wolfson L.J., Watt J.P, Henkle E., Deloria-Knoll M., McCall N. et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 2009; 374: 893 - 902. Doi: 10.1016/S0140-6736(09)61204-6.
3. Artukhov I.P, Galaktionova M.Y., Rakhimov A.L. Major trends adolescent health status of the city of Krasnoyarsk. Sib. Med. Review. 2012; 6: 47 - 52 (in Russian).
4. Statistical data of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation. Avaible at: http://www.rosminzdrav.ru/documents (date accessed - 15.05.2014) (in Russian).
5. Bahareva N.V., Protasova I.N., Peryanova O.V., Kukushkin I.P, Memnonova S.V., Koval' M.V. Bacteriocarrier Streptococcus pneumoniae among children in the city of Krasnoyarsk. Epidemiology and Vaccinal Prevention. 2012; 4 (65): 73 - 77 (in Russian).
6. Andrade A.L.S., Franco C.M., Lamaro-Cardoso J., Andre M.C., Oliveira L.L.G., Kipnis A. et al. Non-typeable Streptococcus pneumoniae carriage isolates genetically similar to invasive and carriage isolates expressing capsular type 14 in Brazilian infants. J. of Infect. 2010; 61: 314 - 322. Doi: 10.1016/ jinf.2010.07.003.
7. Verstrheim D.F., Huiby E.A., Aaberge I.S., Caugant D.A. Phenotypic and genotypic characterization of Streptococcus pneumoniae strains colonizing children attending day-care centers in Norway. J. Clin. Microbiol. 2008; 46: 2508 - 2518. Doi: 10.1128/CVI.00435-09.
8. Johnson H.L., Deloria-Knoll M., Levine O.S., Stoszek S.K. Systematic evaluation of serotypes causing invasive pneumococcal disease among children under five: the pneumococcal global serotype project. PLoS Medicine. 2010; 7 (10): e1000348. Doi: 10.1371/journal.pmed.1000348.
9. Reinert R.R. The antimicrobial resistance profile of Streptococcus pneumoniae. Clin. Microbiol. Infect. 2009; 15 (Suppl. 3): 7 - 11.
10. Savinova T.A., Filimonov O.J., Grudinina S.A., Sidorenko S.V. Genetic diversity penitsillin resistance Streptococcus pneumoniae. J. infec. 2009; 1 (4): 66 - 71 (in Russian).
11. Reinert R.R., Filimonova O.Y., Al-Lahham A., Grudinina S.A., Ilina E.N., Weigel L.M. et al. Mechanisms of macrolide resistance among Streptococcus pneumoniae isolates from Russia. Antimicrob. Agents Chemother. 2008; 52 (6): 2260 - 2262.
12. Krechikova O.I., Kozlov R.S., Bogdanovich T.M., Stetsyuk O.U., Suvorov M.M., Katosova L.K. Isolation, identification and antimicrobial susceptibility testing Streptococcus pneumoniae: Guidelines. Clinical Microbiology. Antimicrobial. Himioter. 2000; 2 (1): 88 - 98 (in Russian).
13. CDC Streptococcus Laboratory. Avaible at: http://www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/protocols.htm
14. Savinova T.A. A genetic variety and molecular bases of resistance of Streptococcus pneumoniae to ß-лактамным to antibiotics: Doctorate of biol. sci. diss. Moscow; 2011 (in Russian).
15. Schwartz G. Selective method: Application guide of statistical methods of estimation. Translated from the German by Ya.Sh. Pappe., I.G. Venetsky, V.M. Ivanova. Moscow: Statistics; 1978: 213 (in Russian).
16. Kozlov R.S., Chagaryan A.N., Kozlova L.V., Muravjeva A.A. Serological characteristic and sensitivity to antibiotics of the pneumococci allocated at children under 5 years in certain regions of the Russian Federation. Clinical Microbiology. Antimicrobial. Himioter.2011; 13 (2): 177 - 187 (in Russian).
17. Rudakova A.V.. Rams A.A., Lobzin Yu.V., Briko N.I., Namazova-Baranova L.S., Tatochenko V.K. et al. Pharmacological economy aspects of vaccination of children the 13-valent pnevmokokkovy conjugated vaccine in the Russian Federation. Questions of Modern Pediatrics. 2014; 13 (1): 35 - 41 (in Russian).
