CC BY
330
Для корреспонденции
Тышко Надежда Валерьевна - кандидат медицинских
наук, заведующая лабораторией оценки безопасности
биотехнологий и новых источников пищи
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»
Адрес: 109240, Российская Федерация, г. Москва,
Устьинский проезд, д.2/14
Телефон: (495) 698-53-64
E-mail: tnv@ion.ru
https://orcid.org/0000-0002-8532-5327
Тышко Н.В.1, Садыкова Э.О.1, Сухачева М.В.2, Груздев Д.С.2
Мультиплексная полимеразная цепная реакция для количественного определения генно-инженерно-модифицированного картофеля линии AV43-6-G7. Доказательство эффективности
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи, 109240, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное государственное учреждение «Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук», 117312, г. Москва, Российская Федерация
1 Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, 109240, Moscow, Russian Federation
2 Federal Research Centre "Fundamentals of Biotechnology" of the Russian Academy of Sciences, 117312, Moscow, Russian Federation
Актуальность. Одним из путей совершенствования методологии лабораторного контроля за генно-инженерно-модифицированными организмами растительного происхождения (ГМО) является использование мультиплексирования -подхода, который позволяет увеличить число определяемых мишеней и повысить количество одномоментно обрабатываемых образцов, максимально реализуя потенциал полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). Цель исследования - разработка протокола количественного определения ген-но-инженерно-модифицированного (ГМ) картофеля линии AV43-6-G7 в формате дуплексной ПЦР-РВ по технологии TaqMan® PCR.
Материал и методы. Дуплексная система включала 2 вида специфических ДНК-праймеров и флуоресцентно-меченных зондов: первый - для выявления специфичной трансформационному событию AV43-6-G7 последовательности
Финансирование. Научно-исследовательская работа проведена при финансировании Российского научного фонда (проект № 16-16-04123). Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Для цитирования: Тышко Н.В., Садыкова Э.О., Сухачева М.В., Груздев Д.С. Мультиплексная полимеразная цепная реакция для количественного определения генно-инженерно-модифицированного картофеля линии AV43-6-G7. Доказательство эффективности // Вопросы питания. 2020. Т. 89, № 3. С. 62-70. DOI: 10.24411/0042-8833-2020-10030 Статья поступила в редакцию 14.09.2019. Принята в печать 18.05.2020.
Funding. This work was supported by the Russian Science Foundation (grant No. 16-16-04123). Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
For citation: Tyshko N.V., Sadykova E.O., Sukhacheva M.V., Grouzdev D.S. Multiplex polymerase chain reaction for genetically modified potato event AV43-6-G7 quantification. Proof of efficiency. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2020; 89 (3): 62-70. DOI: 10.24411/0042-8833-2020-10030 (in Russian)
Received 14.09.2019. Accepted 18.05.2020.
Multiplex polymerase chain reaction for genetically modified potato event AV43-6-G7 quantification. Proof of efficiency
Tyshko N.V.1, Sadykova E.O.i, Sukhacheva M.V.2, Grouzdev D.S.2
ДНК, второй - для выявления таксон-специфичного гена картофеля Stp23. Параметры ПЦР выбирали путем эмпирического подбора концентраций прай-меров и зондов, ионов Mg2+, дезоксирибонуклеотидов, стабилизирующего агента для полимеразы, температуры отжига праймеров и продолжительности инкубации для каждой стадии цикла.
Результаты. В результате исследований был оптимизирован состав реакционной смеси для обнаружения и количественного определения ГМ-картофеля линии AV43-6-G7 в продовольственном сырье и пищевых продуктах. Подобраны олигонуклеотидные праймеры, флуоресцентные зонды. Апробированы составы реакционных смесей и температурно-временные параметры ПЦР: 2,5-кратный реакционный буфер для проведения ПЦР-РВ в присутствии ROX (carboxy-X-rhodamine), праймеры, специфичные для ГМ-компонента (AV43-6-G7-f/AV43-6-G7-r) и целевого таксона (GPF3/GPR3) в количестве 300 нМ/300 нМ и 100 нМ/ 100 нМ, зонды - 200 нМ и 200 нМ соответственно; бычий сывороточный альбумин - 0,04%; MgCl2 - 3,5 мМ, дезоксинуклеозидтрифосфаты - 0,3 мМ, а также температурно-временной профиль реакции (начальная денатурация 95 °С -5 мин, последующие 45 циклов: 95 °С - 20 с, 58 °С - 20 с, 62 °С - 40 с). Заключение. Валидность разработанного метода подтверждена лабораторными исследованиями и свидетельствует о его надежности. Ключевые слова: ГМ-картофель, методы контроля, ПЦР-РВ, дуплексная ПЦР, трансформационное событие AV43-6-G7
One of the ways to improve the laboratory control methodology of genetically modified organisms of plant origin (GМО^) is to use multiplexing - an approach that allows you to increase the number of targets and enlarge the number of simultaneously processed samples, maximizing the potential of polymerase chain reaction in real time (PCR-RT). The aim of the study is to develop a quantitative identification protocol for genetically engineered (GE) potato event AV43-6-G7 in the format of duplex PCR-RT with the use of TaqMan® PCR technology.
Material and methods. The duplex system included 2 types of specific DNA-primers and fluorescence-labeled probes: the first one is for detection of transformation event AV43-6-G7 DNA sequence, the second is for detection of Stp23 taxon-specific potato gene. PCR parameters were chosen by empirical selection of concentrations of primers and probes, Mg2+ ions, deoxyribonucleotides, stabilizing agent for polymerase, as well as primer annealing temperature and incubation duration for each stage of the cycle. Results. As a result of these studies, the composition of the reaction mixture was optimized for the detection and quantification of GE potato event AV43-6-G7 in food. Oligonucleotide primers and fluorescent probes were selected. The compositions of reaction mixtures and temperature-time parameters of PCR were tested: 2.5-fold reaction buffer for PCR-RT in the presence of ROX (carboxy-X-rhodamine), specific to the GE component primers (AV43-6-G7-f/AV43-6-G7-r) and target taxon (GRF3/ GRR3) at 300 пМ/300 пМ and 100 пМ/100 пМ, probes at 200 пМ and 200 пМ, respectively; bovine serum albumin - 0.04%; MgCl2 - 3.5 mM, deoxynucleoside triphosphates - 0.3 mM, as well as the temperature-time profile of the reaction (initial denaturation of 95 °C - 5 min, followed by 45 cycles: 95 °С - 20 sec, 58 °С - 20 sec, 62 °С -40 sec).
Conclusion. The validity of the developed method is confirmed by laboratory studies and testifies to its reliability.
Keywords: GM-potato, methods of control, PCR-RT, duplex PCR, transformation event AV43-6-G7
Одним из путей совершенствования методологии лабораторного контроля за генно-инженерно-моди-фицированными организмами растительного происхождения (ГМО) является использование мультиплексирования - подхода, который позволяет увеличить число определяемых мишеней и повысить количество одномоментно обрабатываемых образцов, максимально реализуя потенциал полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ).
Мультиплексная ПЦР предполагает применение более одной пары праймеров и зондов в одной пробирке.
Принимая во внимание многообразие существующих в настоящее время генно-инженерно-модифицирован-ных (ГМ) линий, а также принцип количественного определения ГМО в образце, основанный на расчете соотношения ГМ-специфичной/таксон-специфичной ДНК, дизайн мультиплексных ПЦР-систем дифференцируется в зависимости от задач и стадии лабораторного исследования: на этапе скрининга целесообразно объединять различные ГМ-линии, а на этапе количественного определения - трансформационное событие с соответствующим таксон-специфичным геном.
Олигонуклеотид Oligonucleotide Название Title Последовательность (5'-3') Sequence (5'-3')
Трансформационное событие A V43-6-G7 Transformation eventAV43-6-G7
Прямой праймер Forward primer AV43-6-G7-f GGTATCAGGTTCTGGAATAAGACCAA
Обратный праймер Reverse primer AV43-6-G7-r TGTCGTGCCAGCTGCATTA
TaqMan-зонд TaqMan-probe AV43-6-G7-p FAM-CCCGCGCGTTGGCCGAT-BHQ-1
Таксон-специфичный ген картофеля Stp23 Stp23 taxon-specific potato gene
Прямой праймер Forward primer GPF3 TTATTAATTGGAATGCTACGTATGATA
Обратный праймер Reverse primer GPR3 CTCTCATGTGTAACAGTAAATATACA
TaqMan-зонд TaqMan-probe GP-p R6G-GTATGACTGTGCAGAGTGACCTTAAAT- BHQ-2
Таблица 1. Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов Table 1. Primers and probes nucleotide sequences
Целью данной работы была разработка метода количественного определения содержания ДНК ГМ-картофеля линии АУ43-6-07 в анализируемых образцах в формате двухкомпонентной (дуплексной) ПЦР-РВ.
Материал и методы
В качестве исходного материала для приготовления тестовых растворов ДНК использовали стандартные сертифицированные образцы ГМ-картофеля линии А743-6-07 (кат. № БРМ-БР431Ь) и образцы традиционного аналога (кат. № БРМ-БР431а) [производства
«JRC-IRMM» (Institute for Reference Materials and Measurements), Бельгия]. ERM-BF431b произведен из лиофи-лизированных клубней картофеля, концентрация ГМО составляет 100%; ERM-BF431a произведен из традиционного картофеля сорта Avebe Agro.
Тестовые растворы ДНК готовили путем разведения до уровня необходимой концентрации ДНК, выделенной из стандартного сертифицированного образца (100% ГМ-картофель), раствором ДНК, выделенной из образца традиционного аналога. Выделение ДНК осуществляли модифицированным методом щелочной экстракции по Бирнбойму-Доли и Wizard-технологии фирмы «Promega» (США) [1], количество и качество ДНК
ш о Н" ^
о сь <D С о- О
О 3
Я 5= с œ
-s-á
_û та
800 700 600 500 400 300 200 100
100 нМ 100 nM
10
20 30
Количество циклов Number of cycles
400 нМ 400 nM 300 нМ 300 nM
40
Рис. 1. Графики зависимости уровня флуоресценции от концентрации праймеров для идентификации трансформационного события AV43-6-G7: продукты амплификации ДНК с таксон-специфичными (А) и специфичными трансформационному событию AV43-6-G7 (В) праймерами
Fig. 1. Fluorescence level dependence on the primers concentration to identify the transformation event AV43-6-G7: DNA amplification products with taxon-specific (A) and event AV43-6-G7-specific (B) primers
0
П р и м е ч а н и е. * - 2,5-кратная реакционная смесь (НПК «Синтол», Россия) для проведения ПЦР-РВ в присутствии флуоресцентного красителя ROX (carboxy-X-rhodamine) содержит 25 мМ MgCl2 и 2,5 мМ каждого dNTP.
N o t e. * - 2.5-fold reaction buffer for PCR-RT in the presence of ROX (carboxy-X-rhodamine) contain 25 mM MgCl2 and 2.5 mM each deoxynucleoside triphosphates.
Таблица 2. Состав амплификационной смеси Table 2. Amplification mixture composition
Компонент Component Конечная концентрация Final concentration мм3/ реакция mm3/reaction
2,5-кратная реакционная смесь для проведения ПЦР-РВ в присутствии ROX* 2.5-fold RT-PCR mix with ROX * 1x 10
AV43-6-G7-f (10 мкМ) (10 рМ) 300 нМ 300 nM 0,75
AV43-6-G7-r (10 мкМ) (10 рМ) 300 нМ 300 nM 0,75
AV43-6-G7^ (10 мкМ) (10 рМ) 200 нМ 200 nM 0,5
GPF3 (10 мкМ) (10 рМ) 100 нМ 100 nM 0,25
GPR3 (10 мкМ) (10 рМ) 100 нM 100 nM 0,25
GP-p (10 мкМ) (10 рМ) 200 нM 200 nM 0,5
MgCl2 (25 мМ)* (25 тМ)* 3,5 мМ 3.5 mM 1
Дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP) (2,5 мМ каждого)* Deoxynucleoside triphosphates (dNTP) (2.5 mM each)* 0,3 мМ 0.3 mM 0,5
Бычий сывороточный альбумин (20 нг/см3) Bovine serum albumin (20 ng/ст3) 0,04% 0,5
ДНК DNA - 10
Конечный объем Final volume 25 мм3 25 mm3
определяли по ГОСТ Р ИСО 21571-2014 «Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот» и ГОСТ Р 53244-2008 (ИСО 21570:2005) «Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Методы, основанные на количественном определении нуклеиновых кислот».
Специфичные нуклеотидные последовательности праймеров и зондов для идентификации таксон-специфичного гена картофеля Э1р23 и трансформационного
события AV43-6-G7 (табл. 1), описанные ранее в работах Е.З. Кочиевой с соавт. [2], H. Gao и соавт. [3] соответственно, синтезированы Научно-производственной компанией «Синтол» (НПК «Синтол», Россия). Эффективность используемых праймеров и зондов подтверждена результатами анализа кривых плавления (диссоциации).
Эффективность, линейность, правильность, прецизионность, предел обнаружения и диапазон применения метода оценивали по результатам независимой 4-кратной амплификации.
Для постановки ПЦР использовали «Набор реагентов для проведения ПЦР-РВ» (НПК «Синтол», Рос-
Таблица 3. Температурно-временной профиль реакции
Table 3. Temperature and time reaction profile
Стадия Stage Процесс Process Температура, °C Время, с Time, sec Количество циклов Number of cycles
I Начальная денатурация Initial denaturation 95 300 1
денатурация denaturation 95 20
II Амплификация Amplification отжиг annealing 58 20 45
элонгация elongation 62 40
Таблица 4. Количество геномных копий в стандартах, используемых для построения калибровочной кривой Table 4. Number of DNA copies for the calibration curve drawing
Стандарты Standards 0,1% 0,5% 1,0% 2% 5% 10%
Содержание ГМ-картофеля линии AV43-6-G7, нг AV43-6-G7 GM potato content, ng 0,1 0,5 1 2 5 10
Содержание ДНК ГМ-картофеля линии AV43-6-G7, копии AV43-6-G7 GM potato DNA content, copies 56 278 556 1111 2778 5556
Содержание ДНК традиционного аналога, копии Traditional analogue DNA content, copies 556 2778 5556 11 111 27 778 55 556
сия). Амплификацию проводили на ДНК-амплификаторе CFX96TM Real-Time PCR System «Bio-Rad» (Bio-Rad, США). Данные обрабатывали с помощью пакета CFX Manager™ Software, версия 1.6.
Результаты и обсуждение
Для относительного количественного определения ГМ-картофеля линии AV43-6-G7 объединены две ПЦР-РВ-реакции в одной пробирке: первая, направленная на выявление специфичной трансформационному событию AV43-6-G7 последовательности ДНК (по каналу детекции флуоресценции FAM), вторая, направленная на выявление таксон-специфичного гена картофеля Stp23 [по каналу детекции флуоресценции R6G (HEX)].
При разработке протокола дуплексной ПЦР-РВ по технологии TaqMan® PCR эмпирическим путем были оптимизированы концентрации праймеров и зондов, ионов Mg2+, дезоксирибонуклеотидов, стабилизирующего агента для полимеразы (бычий сывороточный альбумин - БСА), подобраны оптимальные температуры
Количество циклов Number of cycles
отжига праймеров и продолжительности инкубации для каждой стадии цикла.
В качестве примера (рис. 1) приведены результаты подбора и оптимизации концентраций пары праймеров для идентификации трансформационного события AV43-6-G7. Оптимизацию проводили, варьируя соотношение концентраций праймеров в реакционной смеси в диапазоне от 100 до 400 нМ с шагом 100 нМ (для идентификации трансформационного события AV43-6-G7) и в диапазоне от 50 до 150 нМ с шагом 50 нМ (для идентификации таксон-специфичного гена картофеля Stp23). Для включения в состав реакционной смеси были выбраны следующие концентрации праймеров: 300 нМ (для идентификации трансформационного события AV43-6-G7) и 100 нМ (для идентификации таксон-специфичного гена картофеля Stp23).
Оптимизированный состав реакционной смеси и тем-пературно-временной профиль реакции представлены в табл. 2 и 3.
Относительное количество ГМ-картофеля AV43-6-G7 определяли на основании калибровочной кривой [график зависимости логарифма % концентрации от раз-
Стандартная кривая Standart curve
Значение логарифма исходной концентрации Log starting quantity
О Стандарт X Образец
(В) - Флуорофор - FAM. Эффективность ПЦР = 104,3%; R2 = 0,988; угол наклона стандартной кривой = 3,223; точка пересечения с осью Y = 38,552.
(A) - Флуорофор - HEX. Эффективность ПЦР = 79,3%; R2 = 0,982; угол наклона стандартной кривой = 3,942; точка пересечения с осью Y = 25,100.
О Standard X Sample
(B) - Fluorophore - FAM. Reaction efficiency = 104.3%; R2 = 0.988; slope of the standard curve = 3.223; point at which the curve intercepts the y-axis = 38.552. (А) - Fluorophor - HEX. Reaction efficiency = 79.3%; R2 = 0.982; slope of the standard curve = 3.942; point at which the curve intercepts the y-axis = 25.100.
Рис. 2. (Начало) Анализ продуктов амплификации ДНК с таксон-специфичными праймерами (A) и специфичными трансформационному событию AV43-6-G7 (B) в дуплексной системе. Результаты 4 независимых амплификаций
Fig. 2. (Part 1) DNA amplification products analysis for taxon-specific primers (A) and specific for transformation event AV43-6-G7 (B) in a duplex system. Results of 4 independent amplifications
Количество циклов Number of cycles
О Стандарт X Образец
(В) - Флуорофор - FAM. Эффективность ПЦР = 77,6%; R2 = 0,990; угол наклона стандартной кривой = 4,008; точка пересечения с осью Y= 38,437.
(A) - Флуорофор - HEX. Эффективность ПЦР = 100,5%; R2 = 0,990; угол наклона стандартной кривой = 3,311; точка пересечения с осью Y = 25,686.
О Standard X Sample
(B) - Fluorophore - FAM. Reaction efficiency = 77.6%; R2 = 0.990; slope of the standard curve = 4.008; point at which the curve intercepts the y-axis = 38.437. (А) - Fluorophor - HEX. Reaction efficiency = 100.5%; R2 = 0.990; slope of the standard curve = 3.311; point at which the curve intercepts the y-axis = 25.686.
CP О О S
Я
-e-È
.о .2
900 H 800-1 700-1 600 H 500-1 400-1 300-j
200-I 100-j 0-1
40-
35-
30-
25-
0- - _ _
В
Стандартная кривая Standart curve
----
•Q----
-9------
e-
50
-0,5 0,0 0,5
Значение логарифма исходной концентрации Log starting quantity
20 30
Количество циклов Number of cycles
О Стандарт X Образец
(В) - Флуорофор - FAM. Эффективность ПЦР = 97,4%; R2 = 0,990; угол наклона стандартной кривой = 3,387; точка пересечения с осью Y = 39,218.
(A) - Флуорофор - HEX. Эффективность ПЦР = 90,1%; R2 = 0,997; угол наклона стандартной кривой = 3,584; точка пересечения с осью Y = 26,030.
О Standard X Sample
(B) - Fluorophore - FAM. Reaction efficiency = 97.4%; R2 = 0.990; slope of the standard curve = 3.387; point at which the curve intercepts the y-axis = 39.218. (А) - Fluorophor - HEX. Reaction efficiency = 90.1%; R2 = 0.997; slope of the standard curve = 3.584; point at which the curve intercepts the y-axis = 26.030.
A
о ^
Q. О О S
Я
-e-È
.о .2
10008006004002000-
/
il в !ф
A
^rfiiS..i......- /J/i' / ' . _* y s
Стандартная кривая Standart curve
зЗЭ
m о о -с
10
20
30
40
50
Значение логарифма исходной концентрации Log starting quantity
Количество циклов Number of cycles
О Стандарт X Образец
(В) - Флуорофор - FAM. Эффективность ПЦР = 86,2%; R2 = 0,996; угол наклона стандартной кривой = 3,705; точка пересечения с осью Y = 41,983.
(A) - Флуорофор - HEX. Эффективность ПЦР = 94,7%; R2 = 0,983; угол наклона стандартной кривой = 3,456; точка пересечения с осью Y = 26,099.
О Standard X Sample
(B) - Fluorophore - FAM. Reaction efficiency = 86.2%; R2 = 0.996; slope of the standard curve = 3.705; point at which the curve intercepts the y-axis = 41.983. (А) - Fluorophor - HEX. Reaction efficiency = 94.7%; R2 = 0.983; slope of the standard curve = 3.456; point at which the curve intercepts the y-axis = 26.099.
Рис. 2. (Окончание) Анализ продуктов амплификации ДНК с таксон-специфичными праймерами (A) и специфичными трансформационному событию AV43-6-G7 (B) в дуплексной системе. Результаты 4 независимых амплификаций
Fig. 2. (Part 2) DNA amplification products analysis for taxon-specific primers (A) and specific for transformation event AV43-6-G7 (B) in a duplex system. Results of 4 independent amplifications
Таблица 5. Проверка правильности метода количественного определения генно-инженерно-модифицированного картофеля линии AV43-6-G7 Table 5. Accuracy (trueness) estimation of the genetically engineered AV43-6-G7potato quantitative determination method
Содержание ГМ-компо-нента, % GM-component content, % Среднее значение порогового цикла Mean cycle threshold Полученное данным методом содержание ГМ-компонента в образце, % GM-component content In the sample obtained by the method, % Систематическая ошибка, % Systematic error (bias), % Относительное стандартное отклонение, % Relative repeatability standard deviation, RSDr, %
амплификация amplification амплификация amplification амплификация amplification
№ 1 № 2 № 3 № 4 № 1 № 2 № 3 № 4 № 1 № 2 № 3 № 4
0,1 41,90 42,50 42,50 45,60 0,09 0,09 0,11 0,10 -10 -10 10 0 1,6
0,5 39,45 39,70 40,30 42,97 0,51 0,47 0,47 0,51 2 -6 -6 2 4
1 38,48 38,40 39,30 41,90 1,01 1,0 0,94 1,00 1 0 -6 0 5,6
2 37,48 37,20 38,20 40,70 2,01 1,99 1,97 2,08 0,5 -0,5 -1,5 4 8,3
5 36,29 35,70 36,50 39,30 4,90 4,80 5,01 5,01 -2 -4 0,2 0,2 18,4
Неизвестный образец (0,4%) Unknown sample (0.4%) 39,80 40,10 40,50 43,40 0,39 0,38 0,42 0,39 -2,5 -5 5 -2,5 -
ности значений пороговых циклов (ДСЦ для каждой калибровочной точки], для построения которой применяли стандарты - контрольные растворы с известным содержанием ДНК картофеля. При приготовлении стандартов использовали соответствующие разведения 10% стандарта (рабочего раствора, в котором общее содержание картофельной ДНК составляет 100 нг, а содержание ГМ-картофеля линии АУ43-6-07 - 10 нг). Первая точка калибровочной кривой соответствовала содержанию ГМ-компонента 5% (табл. 4, рис. 2).
Количество геномных копий рассчитывали исходя из того, что одна геномная копия соответствует одной копии гаплоидной геномной ДНК картофеля весом 1,8 пкг [4].
Количественное определение содержания ГМО проводили путем экстраполяции сигнала ПЦР на стандартной кривой. Графики амплификации таксон-специфичного гена картофеля Э1р23 и трансформационного события А743-6-07 в дуплексной системе представлены на рис. 2.
Валидность данного метода идентификации и количественного определения картофеля линии А743-6-07 подтверждена лабораторными исследованиями (табл. 5, 6, см. рис. 2) по [5]: были определены такие параметры,
как правильность и прецизионность, характеризующие точность метода, а также линейность, пределы обнаружения и количественного определения.
Правильность метода, демонстрирующая близость результатов испытаний к истинному значению, выражаемая величиной систематической погрешности, соответствовала установленным критериям; прецизионность метода, свидетельствующая о степени близости друг к другу независимых результатов, полученных в стандартизованных условиях, выражаемая через относительное стандартное отклонение (ЯвОг), была приемлемой. Значение систематической погрешности и относительного стандартного отклонения результатов независимых амплификаций анализируемого фрагмента ДНК в диапазоне рабочих концентраций от 0,1 до 5% находилось в допустимом интервале значений ±25% для каждого стандартного образца (см. табл. 5).
Линейность метода, характеризуемая способностью метода в пределах заданного диапазона давать результаты, величина которых изменяется в линейной зависимости от количества специфичного аналита в стандартном образце, выражаемая коэффициентом регрессии и углом наклона линии регрессии, на-
Таблица 6. Проверка линейности метода количественного определения генно-инженерно-модифицированного картофеля линии AV43-6-G7 Table 6. Linearity estimation of the genetically engineered AV43-6-G7 potato quantitative determination method
Амплификация Amplification Идентификация таксон-специфичного гена картофеля Stp23 Stp23 taxon-specific potato gene identification Идентификация трансформационного события AV43-6-G7 AV43-6-G7 transformation event identification
угол наклона slope эффективность ПЦР, % PCR efficiency, % R2 угол наклона slope эффективность ПЦР, % PCR efficiency, % R2
№ 1 -3,94 79,3 0,982 -3,23 104,3 0,988
№ 2 -4,0 77,6 0,99 -3,30 100,5 0,99
№ 3 -3,38 97,4 0,99 -3,5 90,1 0,997
№ 4 -3,45 94,7 0,983 -3,7 87 0,996
Linear Regression Y=A+BxX
Parameter Value
Error
A 39,74561 0,05696
B -3,69622 0,06829
R SD N P
-0,99966 0,07132 4 3,41175E—4
48-
46-
г? 44-
ÜS
са О о -С
42-
40-
38
-2,0 -1,5
-1,0 LogC
-0,5 0,0 0,5
Рис. 3. Предел обнаружения и предел количественного обнаружения генно-инженерно-модифицированного картофеля линии AV43-6-G7 в образце (Л и В - переменные формулы линейной регрессии; R - коэффициент корреляции линейной регрессии; N - число образцов; SD - стандартное отклонение; P - значение)
Fig. 3. Limit of detection and limit of quantitative detection of AV43-6-G7 genetically engineered potato in the sample (A and B are the linear regression formula variables; R is the linear regression correlation coefficient; N is the number of samples; SD is the standard deviation; P is the value)
ходилась в пределах допустимых значений: внутри диапазона применения разработанного метода регистрировалась прямо пропорциональная зависимость интенсивности аналитического сигнала от количества определяемого вещества в образце; угол наклона стандартной кривой лежал в интервале от -3,2 до -4,1, коэффициент корреляции линейной регрессии ^) превышал 0,98 (см. табл. 6).
Предел обнаружения - минимальная концентрация (количество) специфичного аналита, которая может быть обнаружена данным методом, составляла 0,053% или 30 копий геномной ДНК картофеля линии ДУ43-6-07 из расчета на 100 нг суммарной ДНК при РвОг<25%. Предел количественного определения - минимальная концентрация (количество) специфичного аналита, ко-
торая может быть количественно обнаружена с определенной точностью данным методом - 0,15% или 86 копий геномной ДНК картофеля линии ДУ43-6-07 из расчета на 100 нг суммарной ДНК, РвОг<25% (рис. 3).
Заключение
Разработан протокол дуплексной ПЦР для количественного определения ГМ-картофеля линии ДУ43-6-07 в продовольственном сырье и пищевых продуктах. Валидность метода подтверждена лабораторными исследованиями, что позволяет рекомендовать его для использования в рамках надзора за обращением ГМ-картофеля в Российской Федерации.
Сведения об авторах
Тышко Надежда Валерьевна (Nadezhda V. Tyshko) - кандидат медицинских наук, заведующая лабораторией оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-mail: tnv@ion.ru
https://orcid.org/0000-0002-8532-5327
Садыкова Эльвира Олеговна (Elvira O. Sadykova) - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-mail: seo@ion.ru
https://orcid.org/0000-0001-5446-5653
Сухачева Марина Владимировна (Marina V. Sukhacheva) - кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории молекулярной диагностики Института биоинженерии ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН (Москва, Российская Федерация) E-mail: msukhacheva@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-4406-6581
Груздев Денис Сергеевич (Denis S. Grouzdev) - кандидат биологических наук, заведующий лабораторией молекулярной диагностики Института биоинженерии ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН (Москва, Российская Федерация) E-mail: denisgrouzdev@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-1358-5146
Литература
Булыгина Е.С., Колганова Т.В., Сухачева М.В., Пантелеева А.Н., Патутина Е.О., Кузнецов Б.Б. Выделение ДНК из различных пищевых продуктов с помощью модифицированного щелочного метода // Биотехнология. 2009. № 2. С. 83-90.
Кочиева Е.З., Сухачева М.В., Слугина М.А., Кузнецов Б.Б., Скрябин К.Г. Способ количественного определения геномной ДНК картофеля в растительном сырье и в продуктах, получаемых на его основе, в том числе при количественной идентификации ГМО, с использованием высокоспецифичного ДНК-маркера. Пат. РФ № 2658352 от 20.06.2018.
Gao H., Yu X., Deng T., Sun M., Xiao X., Huang X. et al. Event-speciflc detection of transgenic potato AV43-6-G7 using real-time and digital PCR methods // BMC Biotechnol. 2016. Vol. 16, N 74. DOI: 10.1186/s12896-016-0303-8.
Arumuganathan K., Earle E.D. Nuclear content of some important plant species // Plant Mol. Biol. Rep. 1991. Vol. 9, N 3. P. 208-218. Валидация методов, предназначенных для выявления и идентификации генно-инженерно-модифицированных организмов в пищевых продуктах и продовольственном сырье: Методические указания (МУК 4.2.3389-16). Москва : Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2016. 19 с.
1.
4
2.
References
1. Bulygina E.S., Kolganova T.V., Sukhacheva M.V., Panteleeva A.N., 3. Patutina E.O., Kuznetsov B.B. DNA extraction from different food products using the modified alkaline method. Biotekhnologiya [Biotechnology]. 2009; (2): 83-90. (in Russian)
2. Kochieva E.Z., Sukhacheva M.V., Slugina M.A., Kuznetsov B.B., 4. Skryabin K.G. Method for quantitative determination of potato genomic DNA in plant raw materials and products derived from 5. it, including the quantitative identification of GMO, using a highly specific DNA marker. RU Patent No. 2658352 of 06/20/2018.
(in Russian)
Gao H., Yu X., Deng T., Sun M., Xiao X., Huang X., et al. Event-specific detection of transgenic potato AV43-6-G7 using realtime and digital PCR methods. BMC Biotechnol. 2016; 16 (74): DOI: 10.1186/s12896-016-0303-8.
Arumuganathan K., Earle E.D. Nuclear content of some important plant species. Plant Mol Biol Rep. 1991; 9 (3): 208-18. Methodical Guidelines 4.2.3389-16. Validation of methods for detection and identification of genetically modified organisms in food products and food raw materials. Moscow: Federal Hygienic and Epidemiological Center of Rospotrebnadzor, 2016: 19 p. (in Russian)
