CC BY
500
ГИГИЕНА ПИТАНИЯ
Для корреспонденции
Тышко Надежда Валерьевна - кандидат медицинских
наук, заведующая лабораторией оценки безопасности
биотехнологий и новых источников пищи
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»
Адрес: 109240, Россия, г. Москва, Устьинский проезд, д. 2/14
Телефон: (495) 698-53-64
E-mail: tnv@ion.ru
https://orcid.org/0000-0002-8532-5327
Тышко Н.В.1, Садыкова Э.О.1, Груздев Д.С.2, Сухачева М.В.2
Мультиплексная полимеразная цепная реакция для количественного определения генно-инженерно-модифицированного картофеля линии EH92-527-1 в пищевой продукции
Multiplex PCR for detection 1 ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», Москва, Россия and quantification of GM potato 2 Институт Биоинженерии, ФИЦ «Фундаментальные основы
биотехнологии» РАН, Москва, Россия
1 Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, Moscow, Russia
2 Institute of Bioengineering, Federal Research Centre of Fundamentals of Biotechnology of the Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia
Цель исследования - разработка протокола количественного определения генно-инженерно-модифицированного (ГМ) картофеля линии EH92-527-1 в формате дуплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) по технологии TaqMan® PCR.
Материал и методы. Дуплексная система включала 2 вида специфических ДНК-праймеров и флуоресцентно-меченных зондов: первый - для выявления специфичной трансформационному событию EH92-527-1 последовательности ДНК, второй - для выявления таксон-специфичного гена картофеля Stp23. Параметры ПЦР выбирали путем эмпирического подбора концентраций прай-меров и зондов, ионов Mg2+, дезоксирибонуклеотидов, стабилизирующего агента для полимеразы, температуры отжига праймеров и продолжительности инкубации для каждой стадии цикла.
Результатом этих исследований являлся оптимизированный состав реакционной смеси для идентификации EH92-527-1 и фрагмента гена Stp23 в дуплексной системе: 2,5-кратный реакционный буфер для проведения ПЦР-РВ в присутствии флуоресцентного красителя ROX (carboxy-X-rhodamine), праймеры, специфичные для ГМ-компонента (EH92-f/EH92-r) и целевого таксона (GPF3/GPR3) в количестве 250/250 и 100/100 нМ, зонды - 200 и 200 нМ соответственно; бычий
Для цитирования: Тышко Н.В., Садыкова Э.О., Груздев Д.С., Сухачева М.В. Мультиплексная полимеразная цепная реакция для количественного определения генно-инженерно-модифицированного картофеля линии EH92-527-1 в пищевой продукции // Вопр. питания. 2019. Т. 88, № 1. С. 57-61. doi: 10.24411/0042-8833-2019-10006.
Статья поступила в редакцию 16.11.2018. Принята в печать 27.12.2018.
For citation: Tyshko N.V., Sadykova E.O., Grouzdev D.S., Sukhacheva M.V. Multiplex PCR for detection and quantification of GM potato event EH92-527-1 in food. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2019; 88 (1): 57-61. doi: 10.24411/0042-8833-2019-10006. (in Russian) Received 16.11.2018. Accepted for publication 27.12.2018.
event EH92-527-1 in food
Tyshko N.V.1, Sadykova E.O.1, Grouzdev D.S.2, Sukhacheva M.V.2
сывороточный альбумин - 0,04%; MgCl2 - 3,5 мМ, дезоксинуклеозидтрифосфа-ты - 0,3 мМ, а также температурно-временной профиль реакции (начальная денатурация 95 °С - 5 мин, последующие 45 циклов: 95 °С - 20 с, 58 °С - 20 с, 62 °С - 40 с).
Заключение. Разработан метод количественного определения ДНК ГМ-кар-тофеля линии ЕН92-527-1 в формате дуплексного ПЦР-анализа. Линейность, прецизионность, правильность и предел определения метода подтверждены в исследованиях in vitro и свидетельствуют о его надежности. Ключевые слова: ГМ-картофель, методы контроля, ПЦР-РВ, дуплексная ПЦР, трансформационное событие EH92-527-1
Aim - the elaboration of the protocol for the quantitative detection of genetically modified (GM) potato event EH92-527-1 in the format of duplex real-time polimerase chain reaction (RT-PCR) with TaqMan® PCR technology.
Material and methods. The duplex system included two types of specific DNA primers and fluorescent probes: the 1st was for identifying of the event-specific EH92-527-1 DNA, the 2nd was for identifying of the taxon-specific potato gene Stp23. The selection of PCR parameters was carried out by empirical assortment of primers and probes, Mg2+-ions, deoxyribonucleotides and polymerase stabilizing agent, primers annealing temperature and incubation time for the each cycle stage.
The results of this research was the optimization of the reaction mixture composition for EH92-527-1 event and Stp23 gene fragment identification in the duplex system: 2.5x RT-PCR buffer in the presence of ROX, primers specific for the GM potato (EH92-f/EH92-r) and target taxon (GPF3/GPR3) in the amount of 250/250 and 100/100 nM, probes - 200 and200 nM, respectively; bovine serum albumin - 0.04%; MgCl2 - 3.5 mM, deoxynucleoside triphosphates - 0.3 mM, as well as the temperature-time reaction profile (initial denaturation at 95°C - 5 minutes, the next 45 cycles: 95 °C - 20 seconds, 58 °C -20 seconds, 62 °C - 40 seconds).
Conclusion. The method for the quantitative detection of genetically modified (GM) potato event EH92-527-1 in the format of duplex RT-PCR has been elaborated. The linearity, precision, accuracy and limit of the method definition are confirmed with in vitro studies, that results testify to the method's reliability.
Keywords: GM-potato, methods of control, RT-PCR, duplex PCR, transformation event EH92-527-1
Система контроля за оборотом генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения (ГМО) на продовольственном рынке, действующая в настоящее время в Российской Федерации, предусматривает использование метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Особенности законодательного регулирования ГМО (порог маркировки и порог отнесения к случайной или технически неустранимой примеси составляет 0,9%) определяют необходимость применения количественных методов анализа, к которым относится ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Существующий перечень протоколов ПЦР-РВ, аттестованных (валидированных) и утвержденных в соответствии с международными стандартами в области методов контроля за ГМО, позволяет идентифицировать и проводить количественный анализ содержания кукурузы (27 линий), сои (17), риса (2), сахарной свеклы (1), а также картофеля (1) и прочих культур [1-3]. База данных Объединенного исследовательского центра Европейской комиссии (Joint Research Centre of the European Commission, JRC EC) [3] содержит 125 протоколов ПЦР, из них 68 - для событие-специфичного анализа, 22 - для конструкт-специфичного анализа, а также 35 - для элемент-специфичного анализа (по ситуации на декабрь 2018 г.).
Принимая во внимание, что все вышеупомянутые протоколы предусматривают применение реакционных смесей европейских производителей, их использование в рутинной практике российских испытательных лабораторий имеет целый ряд ограничений экономического и логистического характера. Методическое обеспечение контроля за ГМО в Российской Федерации предусматривает в том числе адаптацию существующих ПЦР-протоколов к отечественным реагентам и приборам, валидацию новых методов в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 [4] и МУК 4.2.3389-16 [5] и разработку методических указаний или государственных стандартов, утверждаемых в установленном порядке. К настоящему времени в Российской Федерации перечень методов идентификации и количественного определения событие-специфичной рекомбинантной ДНК включает 27 линий (трансформационных событий), а также методы скринингового анализа, основанные на определении конструкт-специфичной и элемент-специфичной ДНК. Все эти методы в различных комбинациях представлены более чем в 150 коммерческих тест-системах отечественного производства, позволяющих выявить присутствие более 80% от всех зарегистрированных в мире ГМО.
Следует отметить, что совершенствование методологии лабораторного контроля за ГМО на современном
Таблица 1. Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов [11, 12]
Олигонуклеотид Название Последовательность (5'-3')
EH92-527-1
Прямой праймер EH92-f GTG TCA AAA CAC AAT TTA CAG CA
Обратный праймер EH92-r TCC CTT AAT TCT CCG CTC ATG A
TaqMan-зонд EH92-p FAM-AGA TTG TCG TTT CCC GCC TTC AGT T-BHQ-1
Stp23
Прямой праймер GPF3 TTA TTA ATT GGA ATG CTA CGT ATG ATA
Обратный праймер GPR3 CTC TCA TGT GTA ACA GTA AAT ATA CA
TaqMan-зонд GP-p R6G-AGA TTG TCG TTT CCC GCC TTC AGT T-BHQ-2
этапе развития подразумевает использование мультиплексирования ПЦР-РВ. В основе концепции мультиплексной ПЦР лежит возможность регистрации накопления специфичных продуктов амплификации по нескольким каналам детекции, так как ПЦР-РВ позволяет одновременно использовать несколько комплементарных пар красителей/гасителей с неперекрывающими спектрами излучения. Применение мультиплексной ПЦР-РВ, предполагающей протекание двух и более реакций в одной пробирке, позволяет существенно сократить время проведения анализа, снизить расход реагентов и риск возникновения ошибок при пипетировании и т.п. [6, 7].
Цель данной работы - разработка протокола количественного определения ГМ-картофеля линии EH92-527-1 в формате двухкомпонентной (дуплексной) ПЦР-РВ по технологии TaqMan® PCR.
Материал и методы
BF421b произведен из лиофилизированных клубней картофеля, концентрация ГМО составляет 100%; ERM-BF421a - из традиционного картофеля сорта Kuras.
Для выделения ДНК применяли модифицированный метод щелочной экстракции по Бирнбойму-Доли и Wizard-технологии фирмы «Promega» (США) [8, 9]. Количество и качество ДНК определяли общепринятыми методами [10].
Для идентификации трансформационного события EH92-527-1 и фрагмента гена Stp23 применяли флуоресцентно-меченные зонды и пары праймеров (табл. 1). Праймеры и зонды синтезированы НПК «Синтол» (РФ).
Для проведения ПЦР использовали амплифика-тор CFX96TM Real-Time PCR System (Bio-Rad, США). Продукты ПЦР анализировали путем их детекции в режиме реального времени. Полученные данные обрабатывали с помощью пакета CFX Manager™ Software, версия 1.6.
В работе были использованы стандартные сертифицированные образцы ГМ-картофеля линии EH92-527-1 (кат. № ERM-BF421b) и образцы не ГМ-аналога (кат. № ERM-BF421a) производства JRC-IRMM (Institute for Reference Materials and Measurements), Бельгия. ERM-
Результаты и обсуждение
Выбор оптимальных параметров ПЦР проводили на основании эмпирического подбора концентраций праймеров и зондов, ионов Мд2+, дезоксирибонуклеотидов,
Таблица 2. Состав амплификационной смеси
Компонент Конечная концентрация мм3/ реакция
2,5-кратная реакционная смесь для проведения ПЦР-РВ в присутствии ИОХ* 1х 10
ЕН924 (10 мкМ) 250 нМ 0,75
ЕН92-Г (10 мкМ) 250 нМ 0,75
ЕН92-р (10 мкМ) 200 нМ 0,5
вРРЗ (10 мкМ) 100 нМ 0,25
вРВЗ (10 мкМ) 100 нМ 0,25
вР-р (10 мкМ) 200 нМ 0,5
МдС12 (25 мМ)* 3,5 мМ 0,5
Дезоксинуклеозидтрифосфаты ((ШТР) (2,5 мМ каждого)* 0,3 мМ 0,5
Бычий сывороточный альбумин (20 нг/см3) 0,04% 0,5
Деионизированная вода - 0,5
ДНК - 10
Конечный объем 25 мм3
П р и м е ч а н и е. * - 2,5-кратная реакционная смесь (НПК «Синтол», Россия) для проведения ПЦР-РВ в присутствии флуоресцентного красителя ЯОХ (оагЬоху-Х-гЬобат'ше) содержит 2,5 мМ М£С!2 и 2,5 мМ каждого бЫТР.
Таблица 3. Температурно-временной профиль реакции
Стадия Процесс t, °С Время, с Количество циклов
I Начальная денатурация 95 300 1
денатурация 95 20
II Амплификация отжиг 58 20 45
элонгация 62 40
стабилизирующего агента для полимеразы, температуры отжига праймеров и продолжительности инкубации для каждой стадии цикла.
Результаты исследований, включающие состав реакционной смеси и режим амплификации, представлены в табл. 2 и 3.
В соответствии с требованиями к валидации методов контроля за ГМО [5] экспериментально определены аналитические характеристики метода.
Наличие прямо пропорциональной зависимости аналитического сигнала от количества определяемого вещества в образце подтвердило линейность разработанной методики. В диапазоне рабочих концентраций от 0,1 до 5% угол наклона стандартной кривой лежал в интервале от -3,2 до -4,1, а коэффициент корреляции линейной регрессии ^) превышал 0,98. Значения систематической ошибки и относительного стандартного отклонения (RSDr) находились в допустимом интервале (±25%) для каждого стандартного образца внутри диапазона применения данного метода, что свидетельствует о правильности и прецизионности разработанного протокола.
Предел обнаружения составил 0,1%, или 56 копий геномной ДНК картофеля линии ЕН92-527-1 из расчета
на 100 нг суммарной ДНК, RSDr<25%. Предел количественного обнаружения - 0,3%, или 168 копий геномной ДНК картофеля линии ЕН92-527-1 из расчета на 100 нг суммарной ДНК, RSDr <25%.
Заключение
Таким образом, разработан метод количественного определения ДНК ГМ-картофеля линии ЕН92-527-1 в формате дуплексного ПЦР-анализа. Линейность, прецизионность, правильность и предел определения метода подтверждены в исследованиях in vitro и свидетельствуют о его надежности, что позволяет рекомендовать данный метод для использования в рамках надзора за обращением ГМ-картофеля в Российской Федерации.
Финансирование Научно-исследовательская работа по подготовке рукописи проведена за счет гранта Российского научного фонда (проект № 16-16-04123).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Сведения об авторах
Тышко Надежда Валерьевна (Tyshko Nadezhda V.) - кандидат медицинских наук, заведующая лабораторией оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Россия) E-mail: tnv@ion.ru
https://orcid.org/0000-0002-8532-5327
Садыкова Эльвира Олеговна (Sadykova Elvira O.) - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Россия) E-mail: seo@ion.ru
https://orcid.org/0000-0001-5446-5653
Груздев Денис Сергеевич (Grouzdev Denis S.) - кандидат биологических наук, заведующий лабораторией молекулярной диагностики Институт Биоинженерии, ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН (Москва, Россия)
E-mail: denisgrouzdev@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-1358-5146
Сухачева Марина Владимировна (Sukhacheva Marina V.) - кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории молекулярной диагностики Института Биоинженерии ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН (Москва, Россия) E-mail: msukhacheva@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-4406-6581
Литература
1. Angers-Loustau A., Petrillo M., Bonfini L. et al. JRC GMO-Matrix: detection strategies // BMC Bioinformatics. 2014. Vol. 15, N 1.
a web application to support Genetically Modified Organisms P. 417.
2. Bonflni L., van den Bulcke M.H., Mazzara M., Ben E. et al. 8. GMOMETHODS: The European Union database of reference methods for GMO analysis // J. AOAC Int. 2012. Vol. 95, N 6.
P. 1713-1719.
3. GMOmethods Online Database. URL: http://gmo-crl.jrc. 9. ec.europa.eu/gmomethods/ (date of access October 27, 2018).
4. ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения М. : Стандартинформ, 10. 2009. 24 с.
5. Валидация методов, предназначенных для выявления и идентификации генно-инженерно-модифицированных организмов в пищевых продуктах и продовольственном сырье : методические указания (МУК 4.2.3389-16). М. : Федеральный центр 11. гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2016. 19 с.
6. Аляпкина Ю.С., Моисеева М.В., Ксенофонтова О.В., Алексеев Я.И. Разработка и валидация набора для мультиплексного ПЦР-РВ анализа регуляторных элементов (промотора SsuAra
и терминатора Е9) для обнаружения генетически модифици- 12. рованных (ГМ) линий рапса, сои, картофеля и других растений // Изв. Тимирязевской с.-х. акад. 2018. № 3. С. 5-16.
7. Тышко Н.В., Садыкова Э.О., Сухачева М.В., Батурин А.К. Молекулярно-генетические исследования генно-инженерно-модифицированного картофеля: трансформационное событие PH05-026-0048 // Вопр. питания. 2018. Т. 87, № 4. С. 25-31.
Булыгина Е.С., Колганова Т.В., Сухачева М.В. и др. Выделение ДНК из различных пищевых продуктов с помощью модифицированного щелочного метода // Биотехнология. 2009. № 2. С. 83-90.
ГОСТ Р ИСО 21571-2014. Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот. М. : Стандартинформ, 2016. 41 с. ГОСТ Р 53244-2008 (ИСО 21570:2005). Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Методы, основанные на количественном определении нуклеиновых кислот. М. : Стандартинформ, 2009. 60 с. Event- Specific Method for the Quantification ofAmylopectin Potato Event EH92-527-1 Using Real-time PCR. Community Reference Laboratory for GM Food and Feed. URL: http://gmo-crl.jrc. ec.europa.eu/summaries/EH92-527-1-%20Validation%20Report. pdf (дата обращения: 27.10.2018).
Кочиева Е.З., Сухачева М.В., Слугина М.А. и др. Способ количественного определения геномной ДНК картофеля в растительном сырье и в продуктах, получаемых на его основе, в том числе при количественной идентификации ГМО, с использованием высокоспецифичного ДНК-маркера. Пат. РФ № 2658352 от 20.06.2018.
References
Angers-Loustau A., Petrillo M., Bonfini L., et al. JRC GMO-Matrix: a web application to support Genetically Modified Organisms detection strategies. BMC Bioinformatics. 2014; 15 (1): 417. Bonfini L., van den Bulcke, M. H., Mazzara M., Ben E., et al. GMOMETHODS: The European Union database of reference methods for GMO analysis. J AOAC Int. 2012; 95 (6): 1713-9. GMOmethods Online Database. URL: http://gmo-crl.jrc. ec.europa.eu/gmomethods/ (date of access October 27, 2018). GOST R ISO 5725-1-2002 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results. Part 1. General principles and definitions. Moscow: Standartinform, 2009: 24 p. (in Russian) Methodical Guidelines 4.2.3389-16. Validation of methods for detection and identification of genetically modified organisms in food products and food raw materials'. Moscow: Federal Center of Hygiene and Epidemiology of Federal Office for Inspectorate in Field of Consumers and Human Well-Being Protection, 2016: 19 p. (in Russian)
Alyapkina Yu.S., Moiseyeva M.V., Ksenofontova O.V., Alekse-yev Ya.I. Development and validation of multiplex real-time PCR test system for analyzing regulator elements (SsuAra promoter and E9 terminator) to detect genetically-modified strains of rape, soybeans, potatoes and other plants. Izvestiya Timiryazevskoy sel'skokhozyaystvennoy akademii [Bulletin of the Timiryazev Agricultural Academy]. 2018; (3): 5-16. (in Russian)
7. Tyshko N.V., Sadykova E.O., Sukhacheva M.V., Baturin A.K. Molecular and genetic studies of genetically engineered potato: transformation event PH05-026-0048. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2018; 87 (4): 25-31. (in Russian)
8. Bulygina E.S., Kolganova T.V., Sukhacheva M.V., et al. DNA extraction from different food products using the modified alkaline method. Biotekhnologiya [Biotechnology]. 2009; (2) 83-90. (in Russian)
9. GOST R ISO 21571-2014. Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products. Nucleic acid extraction. Moscow: Standartinform, 2016: 41 p. (in Russian)
10. GOST R 53244-2008 [ISO 21570:2005]. Foodstuffs. Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products. Quantitative nucleic acid based methods. Moscow: Standartinform, 2009: 60 c. (in Russian)
11. Event-specific Method for the Quantification of Amylopectin Potato Event EH92-527-1 Using Real-time PCR. Community Reference Laboratory for GM Food and Feed. URL: http://gmo-crl.jrc. ec.europa.eu/summaries/EH92-527-1-%20Validation%20Report. pdf (date of access October 27, 2018).
12. Kochieva E.Z., Sukhacheva M.V., Slugina M.A., et al. Method for quantitative determination of potato genomic DNA in plant raw materials and products derived from it, including the quantitative identification of GMO, using a highly specific DNA marker. RU Patent No. 2658352 of 06/20/2018. (in Russian)
1.
3
4
6.
