CC BY
30
ISSN 2221-7711 Национальные приоритеты России. 2014. № 3 (13)
3. Subbotina E.L., Loktev V.B. Molecular Evolution of the Tick-Borne Encephalitis and Powassan Viruses. Mol Biol. 2012; 46(1):75-84.
4. Heinze D.M., Gould E.A., Forrester N.L. Revisiting the clinal concept of evolution and dispersal for the tickborne flaviviruses by using phylogenetic and biogeographic analyses. J Virol. 2012; 86(16):8663-8671.
5. Ecker M., Allison S.L., Meixner T, Heinz F.X. Sequence analysis and genetic classification of tick-borne encephalitis viruses from Europe and Asia. J Gen Virol. 1999; 80 ( Pt 1):179-185.
6. Kovalev S.Y., Mukhacheva T.A. Clusteron structure
of tick-borne encephalitis virus populations. Infect Genet Evol. 2013; 14:22-28.
7. Kovalev S.Y., Mukhacheva T.A. Clusterons as a Tool for Monitoring Populations of Tick-Borne Encephalitis Virus. J Med Virol. 2014; 86(2):283-289.
8. Kovalev S.Y., Chernykh D.N., Kokorev KS., Snitkovskaya T.E., Romanenko V.V. Origin and distribution of tick-borne encephalitis virus strains of the Siberian subtype in the Middle Urals, the north-west of Russia and the Baltic countries. J Gen Virol. 2009; 90(Pt 12):2884-2892.
9. Simpson G.G. Tempo and mode in evolution: Columbia University Press.1944.
Ковалев Сергей Юрьевич - доцент кафедры физиологии и биохимии растений департамента «Биологический факультет» Уральского федерального университета им. первого Президента РФ Б.Н. Ельцина,
Мухачева татьяна Александровна - м.н.с. кафедры физиологии и биохимии растений департамента «Биологический факультет» Уральского федерального университета им. первого Президента РФ Б.Н. Ельцина
© С.Ю. Ковалев, Т.А. Мухачева, 2014 Статья поступила в редакцию 1 октября 2014 г.
УДК 577.21:579.834.114
МУЛЬТИЛОКУСНОЕ СИКВЕНС-ТИПИРОВАНИЕ БОРРЕЛИЙ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИИ: ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ ИТОГИ И ПЕРСПЕКТИВЫ
Т.А. Мухачева, С.Ю. Ковалев Уральский федеральный университет им. Первого президента России Б.Н. Ельцина Россия, 620002, Екатеринбург, ул. Мира, 19. Тел.: +7 (343) 375-45-07; 375-46-09
В изучении разнообразия, эволюции и распространения боррелий Borrelia burgdorferi sensu lato - возбудителей иксодового клещевого боррелиоза - всё большее значение приобретает метод мульти-локусного сиквенс-типирования (MLST). За трехлетний период (2011-2014 гг.) нами были определены сиквенс-типы 96 штаммов и изолятов B. afzelii, B. bavariensis и B. garinii, выделенных из клещей на территории России. В работе обсуждаются особенности филогеографической структуры каждого вида, некоторые сложности в проведении анализа и возможные направления дальнейших исследований.
Ключевые слова: Borrelia burgdorferi sensu lato, мультилокусное сиквенс-типирование.
MULTILOCUS SEQUENCE TYPING OF BORRELIA SPECIES IN RUSSIA: INTERIM RESULTS AND PERSPECTIVES
T.A. Mukhacheva, S. Y. Kovalev Ural Federal University named after the first President of Russia B.N.Yeltsin
Multilocus sequence typing (MLST) is becoming a powerful tool in research of the genetic diversity, evolutionary processes and spread of Borrelia burgdorferi sensu lato, the causative agent of Lyme borreliosis. During the 3-years period (2011-2014) we were able to determine sequence-types for 96 Borrelia strains and isolates of B.afzelii, B.bavariensis and B.garinii from Russia. Phylogeographic patterns for each species as well as some difficulties in analysis and future perspectives are discussed.
Keywords: Borrelia burgdorferi sensu lato, multilocus sequence typing.
Молекулярно-генетические исследования
Боррелии комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato являются возбудителями иксодового клещевого боррелиоза (ИКБ) - мультисистемного природно-очагового заболевания, регистрируемого на территории 72 субъектов Российской Федерации. В настоящее время известно 20 видов комплекса Borrelia burgdorferi s. l. [11], в том числе несколько видов (B. bavariensis, B. chilensis, B. kurtenbachii), выделенных на основе мульти-локусного сиквенс-типирования (MLST). Данный метод заключается в анализе нуклеотидных последовательностей фрагментов восьми генов «домашнего хозяйства» общей длиной 4785 п.н. (сик-венс-тип, ST) и хорошо зарекомендовал себя как инструмент изучения генетической структуры популяций многих возбудителей бактериальной природы. Кроме того, была создана и поддерживается международная база данных (http://borrelia. mlst.net/), содержащая в себе последовательности сиквенс-типов, а также эпидемиологические данные и программное обеспечение для анализа. В условиях трудоемкости и дороговизны полногеномного секвенирования MLST представляется нам наиболее перспективным и объективным методом изучения популяций боррелий. Кроме того, иностранные ученые подчеркивали, что изучение штаммов с территории России - ключевой пункт в понимании эволюции и распространения боррелий по территории Евразии [6]. Однако, на момент начала наших исследований (2011 год), из 1286 представленных в базе штаммов Borrelia burgdorferi s.l. только три были выделены на территории России и депонированы японскими исследователями. В 2011 году нами были определены сиквенс-типы 24 штаммов и изолятов, а также проведена оценка информативности MLST по сравнению с ранее широко применяемым методом типирования боррелий - ПЦР-ПДРФ rrf-rrl межгенного спейсера [7]. Продолжение исследований в 2012-2014 годах позволило нам получить последовательности еще 72 штаммов и изолятов. В данной работе проводится сравнительный анализ сиквенс-типов боррелий, циркулирующих в природных очагах разных регионов страны, между собой и с сиквенс-типами, представленными в международной базе данных.
Материалы и методы. В качестве материала использовались штаммы боррелий, полученные из клещей путем культивирования на среде BSK-H (33 штамма), а также клещевые изоляты (63). Далее по тексту штаммы и изоляты будут для краткости обозначаться штаммами. Место изоляции и количество штаммов из разных регионов России представлено в таблице. Следует отметить, что данная таблица не отражает реального соотношения видов боррелий в естественных
популяциях, а лишь дает информацию о выбранных исследователями образцах.
Таблица
Географическая и видовая представленность проанализированных штаммов
Место B.afzelii B.bavariensis B.garinii Всего
Алтай 1 2 0 3
Архангельская обл. 3 3 0 6
Кировская обл. 1 3 0 4
Курганская обл. 0 1 0 1
Новосибирская обл. 0 2 2 4
Пермский край 12 4 0 16
Приморский край 4 0 0 4
Республика Коми 0 2 0 2
Санкт-Петербург 1 0 0 1
Свердловская обл. 4 6 22 32
Томская обл. 1 5 13 19
Тюменская обл. 0 4 0 4
Всего 27 32 37 96
Выделение нуклеиновых кислот, детекцию боррелий и видовую дифференцировку проводили согласно ранее предложенной схеме [8]. Штаммы боррелий и клещевые изоляты интересующего вида с достаточной концентрацией ДНК отбирались для проведения MLST.
Мультилокусное типирование проводилось согласно общепринятой методике [5] с незначительными изменениями. Определение нуклео-тидных последовательностей фрагментов (общей длиной 4785 н.п.) осуществлялось в два этапа [11]. Филогенетический анализ проводился с помощью программы MEGA5 (в анализ было включено 370 последовательностей сиквенс-типов из базы данных Borrelia MLST).
результаты и обсуждение. За период 2011-2014 гг. нами было получено и проанализировано 96 объединенных последовательностей восьми генов в соответствии с методикой MLST. Общее число штаммов из России, включая три опубликованные ранее японскими учеными последовательности (ST86, ST373 и ST374), составило 99, что позволяет составить предварительное представление о генетической структуре популяций боррелий на территории страны. Типи-рованные штаммы принадлежали трем видам боррелий - B.afzelii (27 штаммов), B.garinii (39) и недавно предложенному виду B.bavariensis (33). При этом было выявлено 53 сиквенс-типа (ST), встречающихся только в России. Последовательности 27 штаммов относились к сиквенс-типам, встречающимся и в других странах: ST86 (Западная Европа), ST128 (Китай), ST154 (Китай), ST328 (Китай, Монголия), ST364 (Япония), ST366 (Япония) и ST372 (Япония).
Для того, чтобы выявит филогеографичес-кие особенности популяций боррелий на территории России, для каждого вида были построены филогенетические деревья и проанализировано
ISSN 2221-7711 Национальные приоритеты России. 2014. № 3 (13)
географическое распределение сиквенс-типов. Наиболее выраженной оказалась генетическая структура B.afzeШ. Все последовательности штаммов этого вида из России были получены впервые и не совпадали ни с одним ранее известным сик-венс-типом. Мы выявили три филогенетические линии B.afzetii, встречающиеся только в Западной Европе (за исключением двух сиквенс-типов из Китая, вероятно, попавших туда в результате заноса), и одну линию, в которую вошли сиквенс-типы, выделенные в России и азиатских странах. В свою очередь, данная линия делится еще на две - одна объединяет сиквенс-типы из Приморского края, Китая и Японии, вторая - из Европейской части страны, Урала и Сибири. В целом, все штаммы, выделенные на территории России, оказались филогенетически ближе к азиатским популяциям боррелий, чем к европейским. Выраженная генетическая структура В. afzeШ в какой-то степени может объясняться преимущественной ассоциацией этого вида с мелкими млекопитающими, обладающими относительно небольшой подвижностью. Так, ранее было показано, что для В. afzetii характерна клональная структура и практически полное отсутствие перемешивания сиквенс-типов между разными территориями [2, 10].
Хотя ассоциация с мелкими млекопитающими была продемонстрирована и для В. bavariensis, географической приуроченности сиквенс-типов и четкой структуры для этого вида установить не удалось. В европейских странах В. bavariensis (ранее серотип 4 или группа ЫТ29) встречается в клещах крайне редко [1, 3] и представлена всего двумя сиквенс-типами ^Т84 и ST85), место изоляции одного из которых и дало название виду. Однако, на европейской части России В. bavariensis встречается с высокой частотой и превалирует над В. garinii [8]. Анализ сиквенс-типов В. bavariensis, выделенных на территории европейской и азиатской части страны, а также в Китае, Японии и Монголии, показал значительное генетическое разнообразие и высокий уровень перемешивания штаммов, т.к. один и тот же сиквенс-тип встречался на отдаленных территориях. Таким образом, можно предположить, что хотя В. bavariensis и В. afzelii обладают сходным кругом хозяев, в основе их распространения лежат разные механизмы.
Аналогичная ситуация с отсутствием четкой филогеографической структуры наблюдается и для штаммов В. garinii. Однако, для этого вида можно выявить филогенетические линии: 1 - группа ChY13p (выделенная ранее по характерному профилю при проведении ПЦР-ПДРФ гг^гг1 межгенного спейсера); 2 - азиатская линия (Китай, Япония, один ST с Урала); 3 - пре-
имущественно азиатская линия (Китай, Япония, Сибирь, Урал) с небольшим количеством штаммов из европейских стран; 4 - преимущественно европейская линия, включающая в себя, однако, штаммы из Японии, Сибири и Урала. Таким образом, популяции B. garinii также продемонстрировали наличие перемешивания сиквенс-типов между разными территориями, что может отражать экологическую ассоциацию вида с птицами, обладающими высокой подвижностью. Это предположение было подтверждено и другими исследованиями [6, 10].
Несмотря на высокую информативность метода MLST, мы должны обратить внимание на некоторые ограничения в его использовании. Во-первых, для типирования изолятов борре-лий из клещей необходимо отбирать образцы с максимально возможной концентрацией ДНК и проводить гнездную ПЦР вместо однораундо-вой (что не является проблемой при типировании культур боррелий). Во-вторых, данная методика неприменима для исследования смесей штаммов - как меж-, так и внутривидовых. Если выявление межвидовых штаммов возможно при предварительной видовой дифференцировке и исключении смешанных образцов, то смеси двух штаммов одного вида можно выявить только при секве-нировании. За время проведения исследований, даже при условии предварительной дифферен-цировки видов, нами было исключено из анализа 33 микст-штамма (25 % от общего числа отобранных штаммов), в том числе 8 (6 %) - межвидовых и 25 (19 %) - внутривидовых смесей.
В целом, в данной работе нам удалось установить некоторые особенности филогеографии боррелий на территории России, бывшей до этого terra incognita. Хочется отметить некоторые проблемы, представляющие особый интерес для понимания наблюдаемого распределения генетических вариантов боррелий на территории России. Так, нам представляется важным сбор и MLST-типирование штаммов B. garinii, выделенных на европейской части России. В настоящем исследовании на данной территории были найдены преимущественно B. bavariensis, а несколько штаммов B. garinii обладали недостаточной для типирования концентрацией ДНК. Кроме того, крайне интересным представляется исследование группы ChY13p, первоначально выделенной в Китае, а затем обнаруженной на территории России с низкой частотой встречаемости [9]. Нуклеотидная последовательность единственного найденного нами штамма этой группы (из Екатеринбурга) показала полную идентичность штамму, выделенному в Китае (ST154). Изучение группы ChY13p интересно, поскольку ранее она
Молекулярно-генетические исследования
рассматривалась в качестве переходного звена между B. garinii и B. afzelii [4].
Унифицированная схема мультилокусного сиквенс-типирования может послужить основой для глобального сотрудничества ученых в изучении эпидемиологии боррелиозов.
Работа была проведена при финансовой поддержке со стороны Минобрнауки РФ в рамках выполнения госзадания УрФУ № 2014/2485, а также в рамках реализации Программы развития УрФУ для победителей конкурса «Молодые ученые УрФУ».
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Glatz M. et al. Low prevalence of Borrelia bavariensis in Ixodes ricinus ticks in southeastern Austria // Ticks Tick Borne Dis. - 2014. - DOI 10.1016/ j.ttbdis.2014.04.014.
2. Glatz M. et al. Low prevalence of Borrelia bavariensis in Ixodes ricinus ticks in southeastern Austria // Ticks Tick Borne Dis. - 2014. - DOI 10.1016/ j.ttbdis.2014.04.014.
3. Glatz M. et al. Low prevalence of Borrelia bavariensis in Ixodes ricinus ticks in southeastern Austria // Ticks Tick Borne Dis. - 2014. - DOI 10.1016/ j.ttbdis.2014.04.014.
4. Hellgren O. et al. The genetic structure of Borrelia afzelii varies with geographic but not ecological sampling scale // J Evol Biol. - 2011. - V. 24. - № 1. - P. 159-167.
5. Huegli D. et al. Apodemus species mice are reservoir hosts of Borrelia garinii OspA serotype 4 in Switzerland // J Clin Microbiol. - 2002. - V. 40. - № 12. - P. 4735-4737.
6. Li M. et al. Lyme disease Borrelia species in northeastern China resemble those isolated from far eastern Russia and Japan // Appl Environ Microbiol. - 1998. - V. 64. - № 7. - P. 2705-2709.
7. Margos G. et al. MLST of housekeeping genes captures geographic population structure and suggests a
European origin of Borrelia burgdorferi // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2008. - V. 105. - № 25. - P. 8730-8735.
8. Margos G. et al. Population genetics, taxonomy, phylogeny and evolution of Borrelia burgdorferi sensu lato // Infect Genet Evol. - 2011. - V. 11. - № 7. - P. 1545-1563.
9. Mukhacheva T.A., Kovalev S.Y. Multilocus sequence analysis of Borrelia burgdorferi s.l. in Russia // Ticks Tick Borne Dis. - 2013. - V. 4. - № 4. - P. 275-279.
10. Mukhacheva T.A., Kovalev S.Y. Borrelia spirochetes in Russia: Genospecies differentiation by real-time PCR // Ticks Tick Borne Dis. - 2014. - DOI 10.1016/j.ttbdis.2014.05.016.
11. Nefedova V.V. et al. Genetic variants of Borrelia garinii, a widely spread Eurasian pathogen of ixodic tick borreliosis // Mol Gen Mikrobiol Virusol. - 2010. - № 3.
- P. 7-12.
12. Vollmer S.A. et al. Host migration impacts on the phylogeography of Lyme Borreliosis spirochaete species in Europe // Environ Microbiol. - 2011. - V. 13. - № 1.
- P. 184-192.
13. Wang G. et al. Molecular Typing of Borrelia burgdorferi // Current protocols in microbiology. - 2014.
- DOI 10.1002/9780471729259.mc12c05s34.
Ковалев Сергей Юрьевич - доцент кафедры физиологии и биохимии растений департамента «Биологический факультет» Уральского федерального университета им. первого Президента РФ Б.Н. Ельцина,
Мухачева татьяна Александровна - м.н.с. кафедры физиологии и биохимии растений департамента «Биологический факультет» Уральского федерального университета им. первого Президента РФ Б.Н. Ельцина
© С.Ю. Ковалев, Т.А. Мухачева, 2014 Статья поступила в редакцию 8 октября 2014 г.
