CC BY
85
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 579.854.114:577.21.08
Нефедова В.В., Коренберг Э.И., Горелова Н.Б.
МУЛьТИЛОКУСНЫЙ СИКВЕНС-АНАЛИз «нетипичных» BORRELIA BuRGDORFERI
SENSu LATO, изолированных В РОССИИ
ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, 123098, Москва, Россия
17 изолятов Borrelia burgdorferi sensu lato с неясной генетической характеристикой, выделенные в России от различных видов иксодовых клещей (I. persulcatus, I. ricinus и I. pavlovskyi), исследованы методом мультилокусного сиквенс-анализа (MLSA). По результатам типирования, 7 изолятов отнесены к B. bavariensis, 6 — к B. garinii, 3 — предположительно B. finlandensis и 1 — к B. spielmanii, т.е. к видам, которые могут вызывать заболевания группы иксодовых клещевых боррелиозов (ИКБ) у человека. Проанализирован аллельный полиморфизм 5 генов (rrs, fla, groEL, recA, ospA) и спейсера rrfA-rrlB изолятов B. bavariensis и B. garinii. в сопоставлении с их разнообразием в INSDC.
Ключевые слова: Borrelia burgdorferi sensu lato, MLSA, клещи рода Ixodes
Для цитирования: Нефедова В.В., Коренберг Э.И., Горелова Н.Б. Мультилокусный сиквенс-анализ «нетипичных» Borrelia burgdorferi sensu lato, изолированных в России. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 2017; 35(4): 145-150. DOI 10.18821/0208-0613-2017-35-4-145-150.
B. burgdorferi sensu lato — комплекс спирохет, насчитывающий в настоящее время 21 вид (генетических групп), 9 из которых (B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii, B. afzelii, B. spielmanii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B. bavariensis, B. mayonii, B. bissettii) патогенны для человека [1—4]. В Северной и Южной Америке, Европе и Азии от разных биологических источников получены атипичные изоляты Borrelia spp., описанные впоследствии как B. chilensis, B. carolinensis, B. americana, B. kurtenbachii, B. fin-landensis, B. yangtzensis, B. californiensis, и так называемые гено-мовиды 1 и 2 из США, а так же некоторые изоляты, таксономический статус которых пока остается неясным [4—8]. По всей видимости, надвидовая группа B. burgdorferi sensu lato содержит больше видов боррелий, чем это известно сейчас. Боррелиям, как и большинству прокариот, свойственна внутрипопуляцион-ная клональная изменчивость, имеющая принципиально важное адаптивное значение [4, 9—12], которую далеко не всегда принимают во внимание в стремлении к описанию новых видов и внутривидовых таксономических категорий этих спирохет. Применительно к боррелиям ниже надвидовых, мы различаем следующие таксономические категории: вид (геногруппа или «геновид») — подвид (геномная подгруппа) — генетический вариант (сиквенс-тип) [10, 11]. При современном использовании мультилокусного сиквенс-анализа (MLSA/MLST), сиквенс-тип, полученный при анализе совокупности нуклеотидных последовательностей локусов исследованных генов «домашнего хозяйства» (обычно от 4 до 10), сопоставим, как нам представляется, с понятием генетический вариант. Варианты нуклеотидных последовательностей в пределах какого-то одного гена — это аллели (или аллельные варианты) [4, 8, 13].
В лесной зоне России практически повсеместно распространены и совместно циркулируют в природных очагах спирохеты B. afzelii и B. garinii, изолированные от клещей Ixodes persulca-tus, I. ricinus, I. trianguliceps и I. pavlovskyi, от мелких млекопитающих и больных людей [11, 14—18]. Как показали наши исследования спейсера rrfA-rrlB ряда изолятов, весьма вероятно, что в России, изредка встречаются B. valaisiana и B. lusitaniae, а также B. burgdorferi sensu stricto, B. bavariensis и B. spielmanii. Кроме того, от клещей I. persulcatus, I. ricinus и I. pavlovskyi были получены изоляты, отличающиеся своеобразием нуклеотидных
Для корреспонденции: Нефедова Валентина Валерьевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории переносчиков инфекций отдела природно-очаговых инфекций ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России
последовательностей спейсера rrfA-rrlB от типичных боррелий перечисленных видов [10—12, 14—19].
Цель данного исследования — типирование ряда таких «нетипичных» изолятов B. burgdorferi sensu lato методом мультилокусного сиквенс-анализа (MLSA) для уточнения их видовой принадлежности, внутривидового генетического полиморфизма и разнообразия спирохет, циркулирующих на территории России.
Материалы и методы
Для исследования были отобраны 17 первичных изолятов из коллекции лаборатории переносчиков инфекций ФГБУ ФНИ-ЦЭМ имени Н.Ф. Гамалеи Минздрава России (г. Москва). Они были получены в 1991—2006 гг. посевом на среду BSK материала от различных фаз развития голодных иксодовых клещей 3 видов, отловленных в различных субъектах (административных регионах) Российской Федерации. В соответствии с принятой нами системой, маркировка изолята включает его журнальный номер, перед которым указаны первые буквы латинского названия источника изоляции. От клещей I. persulcatus: Ip, Ipl, Ipn
— от имаго, личинок и нимф; от клещей I. ricinus и I. pavlovsky
— соответственно Ir и Ipv, а также от лесной мышовки (Sicis-ta betulina) — Sb. Выделение ДНК боррелий было проведено коммерческим набором «Проба-НК» (ЗАО «ДНК Технология», Россия). Предварительно все изоляты были идентифицированы методом полиморфизма длины фрагментов рестрикции (ПЦР-ПДРФ) участка rrfA-rrlB, секвенированием этого спейсера и гена rrs как B. garinii, атипичные B. burgdorferi sensu stricto и B. spielmanii [4—7, 20, 21] (рис. 1), а последовательности нуклео-тидов депонированы в International Nucleotide Sequence Database Collaboration (INSDC). Информация об исследованных изолятах представлена в табл. 1.
MLSA проводился по схеме, представленной в «Borrelia burgdorferi MLSA Database» (Институт Пастера, Франция) http:// pubmlst.org/bburgdorferi/ и публикации Richter et al. [20] (табл. 2).
Секвенирование выполнено с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer в Межинститутском Центре коллективного пользования «ГЕНОМ» (Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва (http://www. genome-centre.ru). Нуклеотидные последовательности локусов анализируемых генов rrs, fla, groEL, recA, ospA, спейсера rrfA-rrlB (табл. 2) и их объединенные общие последовательности, протяженностью в 2832 пн, сравнивали с типовыми штаммами боррелий разных видов, представленными в базе данных http:// pubmlst.org/cgi-bin/mlstdbnet/agdbnet.pl?file=bb_mlsa.xml и IN-SDC, и анализировали (табл. 3) с использованием пакета программ MEGA (версия 7) и BLAST® http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi. Детальные результаты этого сравнения не приведены в связи с ограничением объема статьи.
Нуклеотидные последовательности фрагментов каждого из локусов, исследованных нами методом MLSA изолятов, депонированы в INSDC (номера доступа: AY573193, AY772204, AY772209—AY772211, FM993432, FM993439, FM993440, AM748049, AM748052, AM748053, AM932203, AM932204, KU672534—KU672591, LT631689—LT631724).
Результаты
Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности rrfA-rrlB спейсера изолята Ir-5215 выявил ее 99—100% сходство с таковыми у изолятов, или несколько меньшее (93—96%) с ампликонами B. spielmanii из ряда европейских стран, а также из Западной-Сибири (рис. 1). Сравнение полученных нами
Таблица 1
Информация об исследованных изолятах
Музейный Источник изоляции Регион и географические Год Результат типирования по спейсеру rrfA-rrlB
номер изолята координаты сбора клещей, от которых получен изолят изоляции Размер участка (пн) Msel-и Dral профили рестрикции (пн) Вид Номер доступа GenBank
Ir-5215 I. ricinus Республика Крым 45°3' с.ш., 34°36' в.д. 2001 222 D/— B. spielmanii AY573193
Ir-3519 I. ricinus Ставропольский край 45°2' с.ш., 41°59' в.д. 1997 253 A2/A2' B. burgdorferi atypic NE49 AY772209
Ir-4721 I. ricinus Краснодарский край 43°6' с.ш., 39°07' в.д. 2000 253 A3/A2 B. burgdorferi atypic Z41493 AY772210
Ir-4812 I. ricinus Краснодарский край 43°6' с.ш., 39°07' в.д. 2000 255 A1/A3' B. burgdorferi atypic Z41293 AY772211
Ir-4370 I. ricinus Ставрополь 45°2' с.ш., 41°59' в.д. 1999 253 B/B' B. garinii 20047 PBi-like KU672538
Ipv-5017 I. pavlovskyi Восточный Казахстан 49°44' с.ш., 84°16' в.д. 2000 253 В/отсутствует B. garinii AY772204
Ipv-6262 I. pavlovskyi Томск 56°50' с.ш., 84°97' в.д. 2006 256 В/В' B. garinii 20047 FM993432
Ipv-6270 I. pavlovskyi Томск 56°50' с.ш., 84°97' в.д. 2006 256 В/В' B. garinii 20047 FM993440
Ipv-6271 I. pavlovskyi Томск 56°50' с.ш., 84°97' в.д. 2006 237 R/R' B. garinii ChY13p AM932203
Ip-6315 I. persulcatus Томск 56°50' с.ш., 84°97' в.д. 2006 256 В/В' B. garinii 20047 FM993439
Ip-6322 I. persulcatus Томск 56°50' с.ш., 84°97' в.д. 2006 237 R/R' B. garinii ChY13p AM932204
Ipl-5752 I. persulcatus Пермский край 59°5' с.ш., 57°1' в.д. Пермский край 59°5' с.ш., 57°1' в.д. 2002 271 Cv4/C'v4 B. garinii NT29 atyp KU672542
Sb-3174 Sicista betulina 2002 271 Cv4/C'v4 B. garinii NT29 AM748049
Ip-570 I. persulcatus Республика Алтай 51°55' с.ш., 87°60' в.д. 1991 250 Bv1/B'v1 B. garinii KU672548
Ipn-1397 I. persulcatus Пермский край 59°5' с.ш., 57°1' в.д. Пермский край 59°5' с.ш., 57°1' в.д. Пермский край 59°5' с.ш., 57°1' в.д. 1994 261 Cv3/C'v3 B. garinii NT29 atyp AM748053
Ipn-2465 I. persulcatus 1996 261 Cv3/C'v3 B. garinii NT29 atyp AM748052
Ipl-4177 I. persulcatus 1998 271 Cv4/C'v4 B. garinii KU672562
Список использованных праймеров
Локус
Длина фрагмента (пн)
Праймеры
rrs 522 F: AGAGTTTGATCCTGGCTTAG (10—29)
R: CTTTACGCCCAATAATCCCGA (572—552) fla 457 F: AACACACCAGCATCACTTTCAGG (475—497)
R: GATTWGCRTGCGCAATCATTGCC (976—954) groEL 268 F: TACGATTTCTTATGTTGAGGG (552—572)
R: CATTGCTTTTCGTCTATCACC (861—841) recA 156 F: GTGGATCTATTGTATTAGATGAAGCTCTTG (170—199)
R: GCCAAAGTTCTGAAACATTAACTCCCAAAG (391—362) ospA 261 F: AATAGGTCTAATATTAGCCTTAATAGC (21—47)
R: TTGATACTAATGTTTTGCCATCTTCTT (334—308) rrf—rrl 222—270 F: CGA CCT TCT TCG CCT TAA AGC (3'-rf) spacer R: AGC TCT TAT TCG CTG ATG GTA (5'-rr/)
нуклеотидных последовательностей локусов отдельно каждого гена (перечислены выше) изолята 1г-5215 с последовательностями аналогичных участков генома B. spielmanii, имеющихся в GenBank, также выявило их 98—100% сходство. Объединенный MLSA последовательностей 6 локусов этого крымского изолята показал, что он имеет 98,8% сходства с французскими B. spiel-manii РС^17Ы5Т (табл. 3), РС-ЭДгШ и РС-Ея2/Ш10, а также 99,88% с PZ30802 (из Венгри), 99,04% — с A14S (из Голландии), с DK35 (из Дании) и входит в большой кластер, образованный на дендрограммах этими боррелиями (рис. 1 и 2).
Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей локусов ospA гена изолятов Ьч3519, &-4721 и &-4812 (табл. 1) выявил их 100% сходство с B. finlandensis SV1 (СР001524), В. Ап-
Таблица 2 landensis subtype 1k1 штамм Ri5 (KM069332), B.
finlandensis subtype 1j1 штамм SV1 (KM069331),
- тогда как с типовым штаммом B31 (CP009657)
B. burgdorferi sensu stricto оно составило не _ более 95%. Результаты секвенирования других исследованных локусов выявили не более 97,4% их сходства с этим типовым штаммом B. burgdorferi sensu stricto (табл. 3). MLSA также подтвердил отличие трех наших изолятов от других типичных B. burgdorferi sensu stricto из разных регионов, как и наличие боррелий с аналогичной структурой генома у клещей I. ricinus в Германии (Z41293, Z41493, Z51094), Швейцарии (NE49) и Франции (5LM218). На дендро-граммах (рис. 1 и 2) исследованные нами изо-ляты входят в большой кластер, образованный американскими, европейскими и азиатскими представителями B. burgdorferi sensu stricto, но стоят несколько особняком в трех меньших кластерах, включающих некоторых боррелий из Европы.
Изолят Ir-4370, как по нуклеотидным последовательностям локусов отдельных секвенированных нами генов, так и по результатам их MLSA оказался на 99,6—100% сходным с типовым штаммом B. bavariensis PBi [22] и относится к почти идентичному с ним сиквенс-типу (табл. 3, 4). Он также на 98—100% сходен с B. bavariensis от клеща I. ricinus из многих стран Центральной и Западной Европы и от клеща I. uriae из Норвегии. Вместе с тем, его отличия от боррелий, которые известны как B. garinii NT29 от клеща I. persulcatus из ряда регионов России [19] и от клеща I. uriae c Командорских островов, составляют только 2%. Результаты MLSA показали (рис. 2), что изоляты Ip-570, Sb-3174, Ipn-1397, Ipn-2465, Ipl-4177, Ipl-5752 (табл. 1) отнесятся к так называемой азиатской подгруппе B. bavariensis. Они имеют максимальное сходство с нуклеотидными последовательностями боррелий
Q
lpv-6270 lpv-6315 lpv-6262 lpv-5017 lpv-6271 lpv-6322
-B.garinii 20047T
B.afzelii VS461T B.afzelii PGau B.afzelii B023 B.bavariensis PBi lr-4370 lp-570 — B.garinii NT29 lpn-1397 lpn-2465 lpl-4177 lpi-5752 Sb-3174
B.lusitaniae PotiBI B.lusitaniae PotiB2T B.valasiana Am501 B.valasiana VS116T B.valasiana UK B.callfornlensls CA446T B.califomlensis CA443 B.califomlensis CA404 B.burgdorferi Z41493 lr-4721 lr-3519
B.burgdorferi NE49 B.burgdorferi CA13 B.burgdorferi IP1 burgdorferi 212 B.burgdorferi 297
-B.burgdorferi B31T
B.genomospecies 2 CA2 B.genomospecies 1 CA29 B.genomospecies 2 CA28T B.genomospecies 1 CA8T B.bissettii DN127 B. burgdorferi Z41293 B.burgdorferi Z51094 lr-4812
B.spielmanii A14S B.spielmanii DK35 B.spielmanii PZ30802 lr-5215
B.spielmanii PC-Eq17N5T B.spielmanii PC-Eq2rN8 B.spielmanii PC-Eq2/1W10 B.andersonii 21123 B.andersonii 21133 B.andersonii 19952
■ B.b
^B.b
I-R h
0,04 0,03 0,02 0,01 0,00
Рис. 1. Дендрограмма нуклеотидных последовательностей спейсера rrfA-rrlB 54 изолятов Borrelia burgdorferi sensu lato (построена методом UPGMA в MEGA7). Жирным шрифтом выделены изоляты, отобранные для MLSA. Номера изолятов, анализируемых в данной работе, выделены жирным шрифтом.
BgVir, SZ и NMJW1, которые по современным представлениям отнесятся к B. bavariensis. Изоляты, типированные нами как B. bavariensis, относились к 7 различным генетическим вариантам, или сиквенс-типам (табл. 4).
0,0300
0,0200
0,0100
ч:
-с
€
i
£
-С
Sb-3174
lpn-1397
lpn-2465
lpl-4177
lpl-5752
B.garinii NT29
lp-570
B.bavariensis PBi
lr-4370
lpv-6271
lpv-6322
B.garinii 20047T
lpv-5017
lpv-6270
lpv-6262
lp-6315
B.valaisiana Am501 B.valaisiana VS116T B.valaisiana UK B.afzelii VS461T B.afzelii B023 B.afzelii PGau B.spielmanii DK35 B.spielmanii A14S B.spielmanii PZ30802 lr-5215
B.spielmanii PC-Eq2rN8 B.spielmanii PC-Eq2/1W10 B.spielmanii PC-Eq17N5T B.andersonii 21133 B.andersonii 19952 B.andersonii 21123 B.californiensis CA446T B.californiensis CA443 B.califomlensis CA404 B.bissettii DN127 B.genomospecies 1 CA8T B.genomospecies 1 CA29 B.genomospecies 2 CA28T B.genomospecies 2 CA2 Burgdorferi B31T B.burgdorferi 297 Burgdorferi IP1
B.burgdorferi 212 Burgdorferi Z51094 B.burgdorferi Z41293 lr-4812
B.burgdorferi CA13 B.burgdorferi Z41493 lr-4721
B.burgdorferi NE49 lr-3519
B.lusitaniae PotiB2T B.lusitaniae PotiBI
0,0000
Рис. 2. Сходство изолятов Borrelia burgdorferi sensu lato (дендрограмма построена методом UPGMA в MEGA7 по результатам MLSA фрагментов 6 генов 54 изолятов). Номера изолятов, анализируемых в данной работе, выделены жирным шрифтом.
Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей спейсера rrfA-rrlB изолятов Ip-6315, Ip-6322, Ipv-5017, Ipv-6262,
Ipv-6270, Ipv-6271 от клещей I. persulcatus и I. pavlovskyi (табл. 1) выявил их значительное сходство с боррелиями B. garinii от клещей I. ricinus из Франции (IPT114), I. persulcatus из Японии (HP13) и I. uriae из Норвегии. Кроме того, по структуре этого
О 'С чп Ir-3519
сд С <и чп 'С Ir- 4721
О ТЗ ^ л Ir- 4812
ь о га B31T
1 е <и 'а чп . ¡3 u PC- Eq17N5T
Ir- 5215
О И Ip- 6315
Ipv-6262
Ipv-6270
"с Ipv-5017
ад (Й 20047T
И Ip- 6322
Ipv-6271
0 4
PBi
Ip-570
NT29
хл чп С Ipl- 5752
Л Ipl-4177
1Й о га Ipn- 2465
Ipn-1397
Sb-3174
g ^
,_, ОО^ оо о©4 с^
О оО Г^-Г^-ЧЭ^ 2 О©' г^ г^ с^
—I.—I.—С^
2 чэ" Г^ Г"^ с^
г^ г^ г^ с^ 3
г^ г^ г^ г^ с^
ОлОлОлОлОл'-'^О^
ООС^С^^О
с^ г^
^ ^ ^ GO Г^ Г"—^
^ ON
оооооо
00 00 00 10 10(~~
^С^ООС^С^С^С^ООООС^-—I
СЛ'—1 •—
Г"^ Г^ ^-о ^-о
ОлОлОлОлОлОлОлОлОлОлО-!
с^ r^ С^ Г^ lo" чъ ^
оо с^оо С^ С^ О©'
0~\ О^Ол
^ОС^ОООООО^ОС^С^^О-—1 ЧЭГ^-СЛСЛ'^ОООООГ^С^ Г^ Г^ чъ С^ С^ С^
ООООС^ОО'^ЧЭГ^-СЛСЛ'^ОООООГ^'—I С^ С^ С^ О©' Г^ Г^ Г^ ^ Г"^ г^ ^ С^
С^
с^ с^ с^
C^C^OO^OC^OOOOOO^OC^C^^OIO
оо ооо©
ЧЪ ч^ ЧЭ KÖ' ^-0' ^-0' ^-0'
г-5 г-4 г-4
c^ c^ c^ c^
1/^5 0^8
c^ c^ c^ c^
c^ c^ c^ c^
C^OO^D C^
c^ c^ c^ c^
c^ c^ c^ c^
c^
c^lc^lc^lc^
1/^5 0^8
c^ c^ c^ c^
c^ c^ c^ c^
участка генома наши изолят^1 оказались на 99% сходными с боррелиями от клещей I. ur-iae с птичьих базаров Исландии, Великобритании, Командорских и Курильских островов России. По нуклеотидным последовательностям ospA гена они практически почти идентичны c B. garinii, изолированной от клещей I. ricinus, крови, спинномозговой и синовиальной жидкостей пациентов в странах Центральной Европы, а также от I. persulcatus из Китая и России (Новосибирская и Томская области, Хабаровский край) [23]. Результаты MLSÄ типирования 6 указанных выше изолятов (табл. 3) позволяют отнести их к 5 различным сиквенс-типам B. garinii (рис. 2, табл. 5).
Обсуждение
Проведенный MLSA подтвердил наши прежние данные [17] о принадлежности изолята Ir-5215, который получен от взрослого голодного клеща I. ricinus из Крыма (Ангарский перевал), к B. spielmanii. Это свидетельствует о том, что патогенная для человека боррелия данного вида распространена не только в Центральной Европе [20], но (по меньшей мере) и в южной части Европейской России.
Три изолята (Ir-3519, Ir-4721 и Ir-4812) от взрослых голодных клещей I. ricinus по результатам ПЦР-ПДРФ анализа и секвени-рования rrfA-rrlB спейсера ранее были отнесены нами к атипичным B. burgdorferi, поскольку имели несколько отличные от типового штамма B31T B. burgdorferi sensu stricto профили MseI- и DraI- рестрикции [17] и оказались сходными с европейскими изо-лятами NE49, Z41293, Z41493. Некоторые исследователи относят такие «необычные» боррелии к типичным представителям B. burgdorferi sensu stricto автохтонно европейского происхождения [8, 24, 25, 26]. Однако, сравнительный анализ результатов секве-нирования «нового поколения» (NGS, Next Generation Sequencing) изолятов B. burg-dorferi sensu stricto из Северной Америки и Европы выявил высокую консолидацию B. finlandensis SV1 и B. burgdorferi Z41493, которые образуют отдельную BAPS (Bayes-ian Analysis of Population Structure) группу 2 [26]. Это позволяют предполагать, что наши изоляты Ir-3519, Ir-4812, Ir-4721, как и некоторые другие европейские атипичные бор-релии (Z41293, Z51094, NE49, 5LM218), которые считают автохтонными европейскими B. burgdorferi s.stricto [7], относятся к новому европейскому виду боррелий — B. finlan-densis. Это предположение представляется вполне реалистичным, поскольку наш сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей ospA гена атипичных российских и европейских изолятов B. burgdorferi s. stricto с боррелиями из баз данных INSDC выявил их 100% сходство с B. finlandensis SV1 (CP001524), B. finlandensis subtype 1k1 штамм Ri5 (KM069332), B. finlandensis subtype 1j1 штамм SV1 (KM069331), тогда как с типовым американским штаммом B31 B. burgdorferi s. stricto (CP009657) — не более 95%. Эти данные позволяют трактовать их по аналогии с приданием самостоятелного статуса B. bavariensis sp. nov. с типовым штаммом PBi, который был изолирован из спинномозговой жидкости пациента с ней-
Таблица 4
Сиквенс-типы (ST) исследованных изолятов Borrelia bavariensis по результатам MLSA 6 генов
Гены и порядковые номера аллелей
.ПЗиЛЛ! rrs fla 1 groEL recA ospA rrf-rrl
NT29 i i i i i i i
Ipn-1397 2 i 2 2 2 2 2
^п-2465 2 i 2 3 2 3 3
Ipl-4177 2 i 2 3 2 4 4
Ipl-5752 2 i 2 4 3 4 5
Sb-3174 2 i 2 2 2 4 б
PBi 3 2 3 5 4 5 7
Ir-4370 3 2 4 5 4 5 8
Ip-570 4 i 5 б 5 б 9
Примечание. Цифры в столбцах — условные порядковые номера аллелей и сиквенс-типов. Обозначения типовых штаммов выделены жирным шрифтом.
Таблица 5
Сиквенс-Сиквенс-типы (ST) исследованных изолятов Borrelia garinii по результатам MLSA 6 генов
Изолят
Гены и порядковые номера аллелей
fla I groEL I recA \ ospA | rrf-rrl
20047T 111111 1
lpv-6262 2 2 2 2 2 2 2
lpv-6270 2 2 2 2 2 2 2
Ip-6315 2 2 2 3 3 3 3
lpv-6271 2 3 1 2 2 4 4
Ip-6322 2 3 1 3 3 3 5
Ipv-5017 3 3 3 4 2 5 6
Примечание. Цифры в столбцах — условные порядковые номера аллелей и сиквенс-типов. Обозначение типового штамма выделено жирным шрифтом.
роборрелиозом в Баварии [13]. В значительной мере оно было основано на отличии нуклеотидных последовательностей гена ospA типа 4 у ряда европейских изолятов от B. garinii 20047 [4, 13, 27, 28].
Большое сходство структуры генома нашего изолята Ir-4370 со спирохетами B. bavariensis из различных регионов, описанное в разделе «результаты» данной статьи, позволяет отнести его к этому виду, а полная идентичность последовательности нуклео-тидов его гена ospA с таковой у изолятов европейской геномной B. bavariensis — к данной подгруппе. Это одна из двух геномных подгрупп, которые выявлены, главным образом, по результатам секвенирования гена ospA. Другая, так называемая «азиатская» подгруппа B. bavariensis, широко распространена в природных очагах Японии, Монголии, Китая и России [19, 27, 29, 30]. По данным, которые представлены выше (изоляты Ip-570, Sb-3174, Ipn-1397, Ipn-2465, Ipl-4177, Ipl-5752) и опубликованы ранее [10, 12, 14, 15], боррелии этой подгруппы часто встречаются среди изолятов от разных фаз развития таежного клеща, а также от различных мышевидных грызунов и больных людей. На данную подгруппу B. bavariensis, по всей видимости, может быть распространено суждение, которое относилось к прежней геномной подгруппе B. garinii NT29 [11], о том, что эти боррелии распространены практически только (или главным образом) в паразитарных системах с основным переносчиком I. persulcatu, в том числе и на территории Восточной Европы. Поэтому, на наш взгляд, ее точнее называть не азиатской, а евразийской. Это подтверждают результаты MLSA боррелий с несколько иным, чем в нашей работе, набором генов [19], который выявил B. bavariensis у клещей I. persulcatus из разных регионов европейской и азиатской частей России. Представляется вполне очевидным, что в различных частях громадного ареала этих боррелий в природных очагах, отличающихся по своей биоценотической структуре, циркулирует гораздо больше генетических вариантов, чем это представлено нами. Они могут быть выявлены при исследовании репрезентативного числа изолятов.
В целом приведенные нами данные подтверждают представления о внутривидовом генетическом разнообразии широко распространенной спирохеты B. garinii [4, 15, 19] и о значительном генетическом полиморфизме ее популяции даже на сравнительно ограниченной территории одного природного очага [10, 12]. Это обусловлено колоссальной клональной изменчивостью B. garinii, которая, по всей видимости, зависит от видового разнообразия ре-зервуарных хозяев и (в меньшей степени) переносчиков.
В этой связи представляется весьма показательным генетическое сходство ряда изолятов B. garinii, полученных от птиц и паразитирующими на них иксодовых клещей разных видов в географически сильно удаленных друг от друга регионах. Так, клещ I. uriae — специфический паразит морских колониальных птиц, имеющий связанный с ними мозаичный преимущественно островной глобальный ареал, в пределах которого другие виды клещей рода Ixodes практически отсутствуют. Клещ I. pavlovskyi в пределах своего распространения встречается симпатрично с I. persulcatus, в отличие от которого взрослые I. pavlovskyi охотно питаются на лесных птицах [31]. Сходство некоторых локусов наших изолятов от I. pavlovskyi из Западной Сибири с так называемыми «морскими» B. garinii от клещей I. uriae и от морских колониальных птиц Исландии, а также Норвегии [30, 32] позволяет предполагать, что генетическая близость этих B. garinii обусловлена не различными переносчиками, а птицами, причем не только морскими, но и других экологических групп. По всей вероятности, боррелии с аналогичной или сходной «своеобразной» генетической структурой могут быть распространены значительно шире, чем это известно сейчас, и в особенности в тех регионах, где птицы принимают существенное участие в борре-лиозном эпизоотическом процессе. В таких природных очагах, как показывают опубликованные данные [15, 18], геновариан-ты B. garinii, которые мы условно называем «птичьими», могут быть также обнаружены у клещей I. persulcatus, I. ricinus и, вероятно, других видов, способных паразитировать на птицах.
Итак, проведенный нами MLSA 17 «нетипичных» первичных изолятов боррелий из различных регионов России в целом подтвердил достоверность результатов анализа методом ПЦР-ПДРФ участка rrfA-rrlB, а также секвенирования этого спейсера и rrs гена. Вместе с тем, он позволил в свете последних представлений о геномике B. garinii и B. bavariensis более точно типировать изоляты, отнесенные ранее к B. garinii, продемонстрировать распространение в России B. finlandensis и реже встречающихся B. spielmanii, которые могут быть этиологическими агентами заболеваний группы иксодовых клещевых боррелиозов. Путем анализа совокупности аллельных вариантов различных генов B. bavariensis и B. garinii выявлены несколько различных сиквенс типов этих боррелий, которые циркулируют в природных очагах.
Финансирование. Работа выполнена при поддержке РФФИ (проект № 16-04-00009).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА (№№ 1—8, 13, 18—30, 31 ом. REFERENCES)
9. Высоцкий В.В., Котлярова Г.А. Поли(гетеро)морфные формы патогенных бактерий в инфекционной патологии. Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. 1999; 2: 100—4.
10. Коренберг Э.И., Нефедова В.В., Горелова Н.Б., Ковалевский Ю.В., Фадеева И.А., Голубова Д.А. Этиологическая структура южнотаежных сочетаний природных очагов иксодовых клещевых боррелиозов. Вестник Российской академии медицинских наук. 2011; 10: 10—5.
11. Коренберг Э.И., Нефедова В.В. Боррелии — возбудители клещевых боррелиозов и эпидемического возвратного тифа. В кн.: Лабинская А.С., Костюкова Н.Н., Иванова С.М., ред. Руководство по медицинской микробиологии. Частная медицинская микробиология и этиологическая диагностика инфекций. М.: БИНОМ; 2010: 844—66.
12. Коренберг Э.И., Помелова В.Г., Осин Н.С. Природноочаговые инфекции, передающиеся иксодовыми клещами. М.: Koмментарий; 2013.
14. Горелова Н.Б., Коренберг Э.И., Воробьева Н.Н., Фризен В.И., Нефедова В.В., Тетерин В.Ю. Изоляция возбудителя иксодового клещевого боррелиоза из крови больных. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2009; 1: 63—6.
15. Горелова Н.Б., Коренберг Э.И., Нефедова В.В. Генетические варианты Borrelia garinii — широко распространенного евразийского возбудителя заболеваний группы иксодовых клещевых боррелиозов. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2010; 3: 7—12.
rrs
16. Нефедова В.В., Коренберг Э.И., Фадеева И.А., Горелова Н.Б. Генетическая характеристика патогенных для человека боррелий, изолированных от клещей Ixodes trianguliceps bir. и Ixodes pavlovskyi pom. Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 2005; 2: 9—12.
17. Нефёдова В.В., Коренберг Э.И., Горелова Н.Б. Генотипирование некоторых изолятов Borrelia burgdorferi sensu lato от клещей Ixodes ricinus из России и Украины. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2010; 1: 21—6.
31. Филиппова Н.А. Таежный клещ Ixodes persulcatus Schulze (Acrana, Ixodidae): морфология, систематика, экология, медицинское значение. Л.: Наука; 1985. (in Russian)
REFERENCES
1. Pritt B.S., Respicio-Kingry L.B., Sloan L.M., Schriefer M.E., Replogle A.J. Bjork J. et al. Borrelia mayonii sp. nov., a member of the Borrelia burgdorferi sensu lato complex, detected in patients and ticks in the upper midwestern United States. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2016; 66(11): 4878—80.
2. Rudenko N., Golovchenko M., Vancova M., Clark K., Grubhoffer L., Oliver J.H. Isolation of live Borrelia burgdorferi sensu lato spirochaetes from patients with undefined disorders and symptoms not typical for Lyme borreliosis. J. Clin. Microbiol. Infect. 2016; 22(3): 267. e9—267. e15. doi: 10.1016/j.cmi.2015.11.009.
3. Mongodin E.F., Casjens S.R., Bruno J.F., Xu Y., Drabek E.F., Riley D.R. et al. Inter- and intra-specific pan-genomes of Borrelia burgdorferi sensu lato: genome stability and adaptive radiation. BMC Genomics. 2013; 14: 693.
4. Margos G., Vollmer S.A., Ogden N.H., Fish D. Population genetics, taxonomy, phylogeny and evolution of Borrelia burgdorferi sensu lato. Infect. Genet. Evol. 2011; 11: 1545—63.
5. Ivanova L.B., Tomova A., González-Acuña D., Murúa R., Moreno C.X., Hernández C. Borrelia chilensis, a new member of the Borrelia burgdorferi sensu lato complex that extends the range of this genospecies in the Southern Hemisphere. Environ. Microbiol. 2014; 16(4): 1069—80.
6. Margos G., Chu Chen-Yi, Takano Ai, Jiang Bao-Gui, Liu We, Kurtenbach K. et al. Borrelia yangtzensis sp. nov., a rodent-associated species in Asia, is related to Borrelia valaisiana. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2015; 65: 3836—40.
7. Casjens S.R., Fraser-Liggett C.M., Mongodin E.F., Qiu W.G., Dunn J.J., Luft B.J., Schutzer S.E. Whole genome sequence of an unusual Borrelia burgdorferi sensu lato isolate. J. Bacteriol. 2011; 193(6): 1489—90.
8. Postic D., Garnier M., Baranton G. Multilocus sequence analysis of atypical Borrelia burgdorferi sensu lato isolates-description of Borrelia cali-forniensis sp. nov., and genomospecies 1 and 2. Int. J. Med. Microbiol. 2007; 297: 263—71.
9. Vysotskiy V.V., Kotlyarova G.A. Poly(heterosexual)morphic forms of pathogenic bacteria in infectious pathology. Zhurnal mikrobiologii epi-demiologii i immunobiologii. 1999; (2): 100—4. (in Russian)
10. Korenberg E.I., Nefedova V.V., Gorelova N.B., Kovalevskiy Yu.V., Fadeeva I.A., Golubova D.A. Etiological structure of southern taiga combinations of natural foci of Ixodid tick-borne borrelioses. Vestnik Rossiyskoy akademii meditsinskikh nauk. 2011; (10): 10—5. (in Russian)
11. Korenberg E.I., Nefedova V.V. Borrelia — pathogens of Tick-borne borrelioses and Epidemic relapsing fever. In: Labinskaya A.S., Kostyukova N.N., Ivanova S.M., eds. Manual of medical microbiology. Private medical microbiology and etiological diagnosis of infections [Rukovodstvo po meditsinskoy mikrobiologii. Chastnaya meditsinskaya mikrobiologiya i etiologicheskaya diagnostika infektsiy]. Moscow: BINOM; 2010: 844— 66. (in Russian)
12. Korenberg E.I., Pomelova V.G., Osin N.S. Natural focal infections transmitted by ticks [Prirodnoochagovye infektsii, peredayushchiesya iksodovy-mi kleshchami]. Moscow: Kommentariy; 2013. (in Russian)
13. Margos G., Vollmer S.A., Cornet M., Garnier M., Fingerle V., Wilske B. et al. A new Borrelia species defined by Multilocus sequence analysis of housekeeping genes. Appl. Environ. Microbiol. 2009; 75(16): 5410—6.
14. Gorelova N.B., Korenberg E.I., Vorob'eva N.N., Frizen V.I., Nefedova V.V., Teterin V.Yu. Isolation of the causative agent of borreliosis from the blood of patients. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobi-ologii. 2009; (1): 63—6. (in Russian)
15. Gorelova N.B., Korenberg E.I., Nefedova V.V. Genetic variants of Borrelia garinii, a widely spread Eurasian pathogen of diseases of the group Ixodes tick-borne borrelioses. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i virusologiya. 2010; (3): 7—12. (in Russian)
16. Nefedova V.V., Korenberg E.I., Fadeeva I.A., Gorelova N.B. Genetic characterization of pathogenic to human Borrelia isolated from the ticks Ixodes trianguliceps Bir. and Ixodes pavlovskyi Pom. Meditsinskaya parazitologiya iparazitarnye bolezni. 2005; (2): 9—12. (in Russian)
17. Nefedova V.V., Korenberg E.I., Gorelova N.B. Genotyping of some isolates of Borrelia burgdorferi sensu lato from Ixodes ricinus ticks from Russia and Ukraine. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i viruso-logiya. 2010; (1): 21—6. (in Russian)
18. Korenberg E.I., Nefedova V.V., Romanenko V.N., Gorelova N.B. The tick Ixodes pavlovskyi as a host of spirochetes pathogenic for humans and its possible role in the epizootiology and epidemiology of Borrelio-ses. Vector Borne Zoonotic Dis. 2010; 10(5): 453—8.
19. Mukhacheva T.A., Kovalev S.Y. Multilocus sequence analysis of Borrelia burgdorferi s.l. in Russia. Ticks Tick Borne Dis. 2013; 4(4): 275—9.
20. Richter D., Schlee D.B., Allgöwer R., Matuschka F.-R. Relationships
of a Novel Lyme Disease Spirochete, Borrelia spielmani sp. nov., with Its Hosts in Central Europe. Appl. Environ. Microbiol. 2004; 70(11): 6414—9.
21. Wang G., van Dam A.P., Dankert J. Phenotypic and genetic characterization of a novel Borrelia burgdorferi sensu lato isolate from a patient with Lyme borreliosis. J. Clin. Microbiol. 1999; 37(9): 3025—8.
22. Hao Q., Hou X. Geng Z., Wan K. Distribution of Borrelia burgdorferi sensu lato in China. J. Clin. Microbiol. 2011; 49(2): 647—50.
23. Gómez-Díaz E., Boulinier T., Sertour N., Cornet M., Ferquel E., McCoy K.D. Genetic structure of marine Borrelia garinii and population admixture with the terrestrial cycle of Lyme borreliosis. Environ. Microbiol. 2011; 13(9): 2453—67.
24. Margos G., Gatewood A.G., Aanensen D.M., Hanincová K., Terekhova D., Vollmer S.A. et al. MLST of housekeeping genes captures geographic population structure and suggests a European origin of Borrelia burgdorferi. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008; 105(25): 8730—5.
25. Marti Ras N., Postic D. Foretz M., Baranton G._Borrelia burgdorferi sensu stricto, a bacterial species «made in the U.S.A.»? Int. J. Syst. Bacteriol. 1997; 47 (4): 1112—7.
26. Castillo-Ramírez S., Fingerle V., Jungnick S., Straubinger R.K., Krebs S., Blum H. et al. Trans-Atlantic exchanges have shaped the population structure of the Lyme disease agent Borrelia burgdorferi sensu stricto. Sci. Rep. 2016; 6: 22794.
27. Margos G., Wilske B., Sing A., Hizo-Teufel C., Cao W.C., Chu C. et al. Borrelia bavariensis sp. nov. is widely distributed in Europe and Asia. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2013; 63: 4284—8.
28. Huegli D., Hu C.M., Humair P.-F., Wilske B., Gern L. Apodemus species mice are reservoir hosts of Borrelia garinii OspA serotype 4 in Switzerland. J. Clin. Microbiol. 2002; 40(12): 4735—7.
29. Takano A., Nakao M., Masuzawa T., Takada N., Yano Y., Ishiguro F., Fujita H. et al. Multilocus sequence typing implicates rodents as the main reservoir host of human-pathogenic Borrelia garinii in Japan. J. Clin. Mi-crobiol. 2011; 49(5): 2035—9.
30. Scholz H.C., Margos G., Derschum H., Speck S., Tserennorov D., Erden-ebat N. et al. High prevalence of genetically diverse Borrelia bavariensis-like strains in Ixodes persulcatus from Selenge Aimag, Mongolia. Ticks Tick Borne Dis. 2013; 4(1-2): 89—92.
31. Filippova N.A. Taiga tick Ixodes persulcatus Schulze (Acrana, Ixodidae): morphology, systematics, ecology, medical importance [Taezhnyy kleshch Ixodes persulcatus Schulze (Acrana, Ixodidae): morfologiya, sistematika, ekologiya, meditsinskoe znachenie]. Leningrad: Nauka; 1985. (in Russian)
32. Tveten A.-K. Exploring diversity among Norwegian Borrelia strains originating from Ixodes ricinus ticks. J. Microbiol. 2014; 2014: Article ID 397143. http://dx.doi.org/10.1155/2014/397143.
Nefedova V.V., Korenberg EI, Gorelova N.B.
MULTILOCUS SEQUENCE ANALYSIS «ATYPICAL» BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO, ISOLATED IN RUSSIA
Federal Research Center for Epidemiology and Microbiology Named After the Honorary Academician N.F. Gamaleya, Ministry of Health of the Russian Federation, 123098, Moscow, Russia
17 isolates of Borrelia burgdorferi sensu lato with an unclear genetic characteristic, isolated in Russia from various species of Ixodes ticks (I. persulcatus, I. ricinus and I. pavlovskyi), have been studied by Multilocus Sequencing Analysis (MLSA). According to the results of typing, these isolates were identified as B. bavariensis (n = 7), B. garinii (n = 6), B. finlandensis (n = 3) and B. spielmanii (n = 1), i.e. to species that can cause diseases of the group of ixodid tick-borne borreliosis (ITBB) in humans. The allelic polymorphism of 5 genes (rrs, fla, groEL, recA, ospA) and spacer rrfA-rrlB of B. bavariensis and B. garinii isolates in comparison with their diversity in INSDC was analyzed.
For citation: Nefedova V.V., Korenberg E.I., Gorelova N.B. Multilocus Sequence Analysis «Atypical» Borrelia Burgdorferi Sensu Lato, Isolated In Russia. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology) 2017; 35(4): 145-150 (Russian). DOI 10.18821/0208-0613-201735-4-145-150.
For correspondence: Nefedova Valentina Valer'evna, Ph.D Biology, senior scientist researcher at the Department of Feral Herd Infection, Laboratory of Infection Vectors at the Federal State Budgetary Institution «Federal Research Centre for Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F. Gamaleya» of the Ministry of Health of the Russian Federation
Acknowledgments. The work was supported by the Russian Foundation
for Basic Research (Project No. 16-04-00009).
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Received 15.11.16 Accepted 05.06.17
