CC BY-ND
18
54
ЗНиСО
МАЙ Н0Е (290)
УДК 616.98-036.21:579.834.114
СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ОТЕЧЕСТВЕННОГО МУЗЕЯ БОРРЕЛИЙ
Л.А. Куркатова, Э.И. Коренберг, Н.Б. Горелова
ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Россия
Со сложной проблемой этиологии иксодовых клещевых боррелиозов связаны практические аспекты их серологической диагностики, терапии и специфической профилактики. Для изучения микроорганизмов рода Borrelia с помощью постоянно совершенствующихся современных молеку-лярно-биологических методов создан музей боррелий, состоящий из хранилища и электронной базы данных с алгоритмом ее компьютерного формирования и пополнения в MySQL для применения в среде Интернет. Он дает возможность более детально использовать культуры, изолированные в разное время, от различных резервуарных хозяев, переносчиков и пациентов из различных регионов, для углубленного изучения таксономии и внутривидовой гетерогенности боррелий. В настоящее время музей содержит около 1 250 изолятов и примерно 7 430 единиц хранения (аликвот).
Ключевые слова: музей боррелий, хранилище, электронная база данных, изоляты.
L.A. Kurkatova, E.I .Korenberg, N.B. Gorelov □ MODERN CONDITION OF THE DOMINIC
MUSEUM OF BORRELY □ Gamalei NF State Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia.
The practical aspects of serological diagnosis, therapy and specific prophylaxis of Ixodid Tick-borne borrelioses are associated with the complex problem of their etiology. To study the microorganisms of the genus Borrelia with constantly improving modern molecular-biological methods the Museum of Borrelia, comprising storage and an electronic database with the computer algorithm of its formation and replenishment in MySQL for use in the Internet environment. It enables more details to use of a culture isolated at different times from different reservoir hosts, vectors and patients from different regions, for in-depth study of the taxonomy and intraspecific heterogeneity of Borrelia. Currently the museum contains about 1 250 isolates and approximately 7 430 storage units (aliquots). Key words: Museum of Borrelia, storage, electronic database, isolates.
Иксодовые клещевые боррелиозы (ИКБ) или заболевания группы болезни Лайма [7] относятся к природно-очаговым зоонозам с трансмиссивным механизмом передачи возбудителей, которые относятся к спирохетам рода Borrelia. К настоящему времени известно, что этиологически самостоятельные заболевания этой группы могут вызывать патогенные для человека спирохеты ряда видов: Borrelia bur-gdoferi sensu stricto, B. garinii, B. afzelii, B. spie-lmanii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B. bavariensis, B. mayonii, B. bissettii Кроме того, описаны еще примерно 12 близких к ним видов боррелий, патогенность которых для человека пока не установлена [18]. Их основные переносчики -иксодовые клещи группы ricinus/persulcatus, с которыми связано распространение этих спирохет и вызываемых ими заболеваний главным образом в умеренном климатическом поясе Евразии и Северной Америки. Большая часть мирового ареала ИКБ находится в пределах России. Это обусловлено широким распространением их природных очагов, в которых важнейшую роль в циркуляции боррелий и заражении людей принадлежит таежному (I. persul-catus) и лесному (I. ricinus) клещам [9, 16].
Особая актуальность проблемы ИКБ обусловлена тем, что по уровню заболеваемости они занимают первое место среди всех природ-но-очаговых инфекций. По данным Федерального центра Роспотребнадзора, больных борре-лиозом регистрируют в 73 субъектах Российской Федерации от Прибалтики до Дальнего Востока и Южного Сахалина [3, 4].
Для изучения таксономии, внутривидовой гетерогенности боррелий, этиологии ИКБ, их лабораторной диагностики и профилактики с применением непрерывно совершенствующихся молекулярно-биологических методов исследования изолятов в лаборатории переносчиков инфекций НИИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР (ныне ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России) по инициативе и под руководством Э.И. Коренберга в 1983 г. был создан и начал регулярно пополняться музей боррелий [5]. С самого начала деятельности музея в основу работы с коллекцией была заложена строгая система учета всех поступающих изо-лятов и их образцов, выдаваемых для исследования. Для соответствующей регистрации были введены лабораторные журналы и карточки «движения» каждого изолята боррелий, а также журналы заморозки образцов.
Подавляющее большинство проб, закладываемых на хранение в музей, представляет собой аликвоты первичных культур боррелий (после их первого пересева), которые получены путем их изоляции из различных биоматериалов на среде BSK (Barbour-Stoenner-Kelly). В первые годы работы ее готовили по описанному рецепту [15] без селективных добавок или с их добавлением. Примерно с 2000 года для посевов использовали готовую среду BSK-H MEDIUM COMPLETE. Изоляция боррелий, описанная ранее в ряде публикаций, осуществлялась путем внесения в эту среду внутренних органов клещей или различного материала от мелких млекопитающих (селезенка, почки,
МАЙ №5 (290)
ЗНивО
сердце, мочевой пузырь, моча, кровь, биоптаты кожи и уха) и больных людей (кожные биопта-= ты из эритем, кровь) [5]. Посевы находились в сэ термостате при 33 °С до 2 месяцев. Рост борре-лий выявляли еженедельным просмотром ка-^^ пель посева культуры в темнопольном микроскопе. При первом обнаружении спирохет не-г-ь замедлительно производился пересев на среду BSK-II. Пробы культур (аликвоты), в которые добавлен стерильный нейтральный глицерин (до его конечной концентрации - 10-15 %), длительно хранятся в низкотемпературных камерах при -70 °С.
В настоящее время музей представляет собой два взаимосвязанных компонента: хранилище культур и электронную базу данных. Разработан алгоритм формирования и пополнения компьютерной базы данных MySQL для применения в среде Интернет.
Все изоляты и их аликвоты хранятся в пронумерованных криопробирках объемами 0,53 мл или 4,8 мл, или 6-15 мл и заложены в соответствующие, также пронумерованные, штативы на 36, 81 и 100 мест. Таким образом, каждая пробирка может быть легко найдена по номеру коробки и месту в ней, на котором она находится. Эти порядковые номера хранения образцов внесены в электронную базу данных. В ней представлен изначальный номер самого изолята (например, Ip-3), данный ему по принятому нами сочетанию латинских букв и цифр: латинские буквы обозначают объект, из которого выделена культура (I — Ixodes, p — persulcatus), а цифры - номер по лабораторному журналу фиксации посевов (в данном случае № 3). Эти справочные музейные номера приводятся при любом дальнейшем использовании изолятов, в публикациях и при депонировании информации о структуре их генома в международный GenBank. База данных нашего музея боррелий содержит всю основную информацию по каждому хранящемуся изоляту, включая дату и место сбора (получения) и сведения о биоматериале, из которого он выделен, метод и результаты первичной идентификации и последующего типирования, количество хранящихся аликвот и др.
Периодически пополняющийся музей в настоящее время содержит одну из наиболее крупных мировых коллекций боррелий. Она содержит около 1250 изолятов B. burgdorferi sensu lato (B. afzelii, B. bavariensis, B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii, B. japonica, B. lusita-niae, B. spielmanii, B. valaisiana,), а также бор-релий, передающихся аргасовыми клещами (B. hermsii, B. parkerii, B. persica, B. turicata) и B. recurrentis. Кроме того, имеются микст-, а также не полностью типированные изоляты. Музей в общей сложности насчитывает примерно 7 430 единиц хранения (аликвот). Более половины из них приходится на наиболее распространенные в России B. garinii и B. afzelii. Биоматериалы для изоляции боррелий преимущественно получены сотрудниками лабо-
ратории переносчиков инфекций (реже других учреждений) в 18 субъектах Российской Федерации (от Калининградской области до Хабаровского и Приморского краев), а также в Белоруссии, Казахстане, Киргизии, Литве, Молдове, Украине, Чехии, Эстонии.
Музей - это фундаментальная основа для изучения этиологии ИКБ, таксономии борре-лий и их внутривидовой изменчивости. Он дает возможность со временем, по мере совершенствования лабораторных методов, более детально исследовать давно изолированные образцы боррелий. Так, идентификация первых отечественных изолятов B. burgdorferi sensu lato, полученных в 1987-1989 гг. от иксодовых клещей, и их сравнение с типовыми американскими штаммами была проведена с использованием моноклональных антител [10]. Некоторые из российских изолятов, находящиеся в музейной коллекции, были использованы исследователями ряда стран при изучении серо-типов, плазмидного профиля, генетической структуры, таксономии и филогении боррелий, включая характеристику генетических групп и первоописания самостоятельных геновидов [8]. Российские изоляты Ip-3, Ip-21, Ip-90, которые по сей день хранятся в нашем музее, были, наряду с другими изолятами из разных стран, использованы при первоописании B. garinii и группы VS 461 (получившей в дальнейшем название B. afzelii) и в отличие от B. burgdorferi представляют собой самостоятельные генови-ды [14]. Эта работа заложила основу современных представлений о группе B. burgdorferi sensu lato. Изоляты из нашего музея (Ir-210, Ip-90, Ip-3 и Ip-89) использованы также при выявлении 4 различных групп боррелий по полиморфизму длины фрагментов рестрикции [17].
Методом ПЦР-ПДРФ, который был предложен в 1994 г. [19] и на протяжении многих лет считался основным при определении видовой принадлежности боррелий, сотрудники лаборатории переносчиков инфекций исследовали около 700 первичных изолятов из разных регионов России и сопредельных стран, полученных в 1995-1996 гг., и выявили циркуляцию и распространение на территории нашей страны B. garinii, B. afzelii, B. lusitaniae, B. valaisiana и B. burgdorferi sensu stricto и др. [1, 2, 6]. Получены данные, характеризующие генетический полиморфизм B. garinii, B. afzelii — наиболее распространенных в Евразии возбудителей заболеваний ИКБ [11, 13]
В последнее время начато изучение музейных изолятов более современным методом мультилокусного сиквенс анализа (MLSA) для уточнения их видовой принадлежности, внутривидового генетического полиморфизма и разнообразия спирохет, циркулирующих на территории России [12].
Музей живых культур имеет важное значение для изучения боррелий, так как дает возможность депонировать и на долгие годы сохранять первичные изоляты, возвращаться к их
56
ЗНивО
МАЙ НАС (290)
повторному анализу и более детальному изучению по мере совершенствования лабораторных методов [8], а также обмениваться ими между разными научными коллективами.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (проект № 16-04-00009).
3.
5.
7.
ЛИТЕРАТУРА
Горелова Н.Б. и др. Изоляция боррелий от клеща Ixodes trianguliceps (Ixodidae) и возможное значение этого вида в эпизоотологии иксодовых клещевых бор-релиозов / Н.Б. Горелова, Э.И. Коренберг, Ю.В. Ковалевский [и др.] // Паразитология. 1996. № 30 (1). С. 13-18.
Горелова Н. Б. и др. Первая изоляция Borrelia burgdor-feri sensu stricto в России / Н.Б. Горелова, Э.И. Коренберг, Д. Постик [и др.] // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2001. № 4. С. 10-12. Государственный доклад: о состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Российской Федерации в 2015 году. М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. 2016. 200 с: [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://www.rospotrebnadzor.ru/ documents/details.php? ELEMENT_ID=6851 (дата доступа: 18.05.2017).
Коренберг Э.И. Инфекции, передающиеся иксодовы-ми клещами в лесной зоне, и стратегия их профилактики: изменение приоритетов // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2013. № 5 (72). С. 7-17. Коренберг Э.И. и др. Проблемы иксодовых клещевых боррелиозов / Э.И. Коренберг, Н.Б. Горелова. 1993. С. 31-37.
Коренберг Э.И. и др. Новые для России виды борре-лий - возможные возбудители иксодовых клещевых боррелиозов в России / Э.И. Коренберг, Н.Б. Горелова, Д. Постик [и др.] // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1999. № 2. С. 3-5. Коренберг Э.И. и др. Иксодовые клещевые боррелио-зы - новая группа заболеваний человека / Э.И. Коренберг, В.Н. Крючечников // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1996. № 4. С. 104-108.
8. Коренберг Э.И. и др. Основные итоги генотипирова-ния боррелий в России / Э.И. Коренберг, В.В. Нефедова, И.А. Фадеева [и др.] // Бюллетень сибирской медицины. 2006. № 1 С. 87-92.
9. Коренберг Э.И. и др. Природноочаговые инфекции, передающиеся иксодовыми клещами / Э.И. Коренберг, В.Г. Помелова, Н.С. Осин. 2013. С. 174-231.
10. Крючечников В.Н. и др. Идентификация боррелий, изолированных в СССР от клещей Ixodes persulcatus Shulze / В.Н. Крючечников, Э.И. Коренберг, С.В. Щер-
баков [и др.] // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1988. № 12. С. 41-44.
11. Нефедова В.В. и др. Генетические варианты Borrelia garinii - широко распространенного евразийского возбудителя заболеваний группы иксодовых клещевых боррелиозов / В.В. Нефедова, Э.И. Коренберг, Н.Б. Горелова // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2010. № 3. С. 7-12.
12. Нефедова В.В. и др. Мультилокусный сиквенс анализ «нетипичных» Borrelia burgdorferi sensu lato, изолированных в России / В.В. Нефедова, Э.И. Коренберг, Н.Б. Горелова // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2017. № 4. С. 2-7.
13. Фадеева И.А. и др. Генетические варианты Borrelia afzelii - одного из возбудителей иксодовых клещевых боррелизов / И.А. Фадеева, В.В. Нефедова, Э.И. Ко-ренберг // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2005. № 3. С. 18-22.
14. Baranton G. et al. Delineation of Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii sp. nov., and group VS461 associated with Lyme borreliosis / G. Baranton, D. Pos-tic, I. Saint Girons [et al.] // Inern. J. Syst. Bacteriol. 1992. Vol. 42. № 3. P. 378-383.
15. Barbour A.G. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes // The Yale Journal of Biology and Medicine. 1984. Vol. 57. № 4. P. 521-525.
16. Filippova N.A. A Hypothesis for the Paleogenesis of the Distribution of the Main Vectors for Lyme Disease // In Modern Acarology. 1991. Vol. 1. P. 109-118.
17. Fukunaga M. et al. Analysis of Borrelia species associated with Lyme disease by rRNA gene restriction fragment length polymorphism / M. Fukunaga, M. Sohnaka, Yanagihara // J. Gen. Microbiol. 1993. Vol. 139. P. 1141-1146.
18. Margos G. et al. Population genetics, taxonomy, phylog-eny and evolution of Borrelia burgdorferi sensu lato / G. Margos, S.A. Vollmer, N.H. Ogden [et al.] // Infection Genetics and Evolution. 2011. Vol. 11. P. 15451563.
19. Postic D. et al. Diversity of Borrelia burgdorferi sensu lato evidenced by restriction fragment length polymorphism of rrf(5S)-rrl(23S) intergenic spaser amlicons / D. Postic, M.V. Assous, P.A.D. Grimont [et al.] // Inern. J. Syst. Bacteriol. 1994. Vol. 44. P. 743-752.
Контактная информация:
Коренберг Эдуард Исаевич, тел.: +7 (926) 205-92-05, e-mail: edkorenberg@ yandex.ru Contact information: Korenberg Eduard, phone: +7 (926) 205-92-05, e-mail: edkorenberg@ yandex.ru
V
