CC BY
32
ХИМИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ПЕРЕРАБОТКИ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ
УДК 561.284.579.61
Хвойные бореальной зоны. 2018. Т. XXXVI, № 3. С. 265-269
MUCOR HIEMALIS: ОЦЕНКА ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КОРМОВЫХ ПРОДУКТОВ
Е. В. Алаудинова, П. В. Миронов, Р. Х. Эназаров
Сибирский государственный университет науки и технологий имени академика М. Ф. Решетнева Российская Федерация, 660037, г. Красноярск, просп. им. газ. «Красноярский рабочий», 31
Е-mail: alaudinovaev@yandex,ru
Сегодня дефицит высококачественных белковых пищевых и кормовых продуктов на нашей планете оценивается примерно в 25 млн тонн в год. В этой связи в ряду первоочередных задач современной биотехнологии стоит изыскание новых видов сырья, новых видов продуцентов белка, а также разработка высокоэффективных технологий получения пищевых и кормовых продуктов, обогащенных белком.
Потенциальным микроорганизмом для получения белковых кормовых продуктов является плесневый гриб Mucor hiemalis (M. hiemalis), отличающийся высокой скоростью роста, неприхотливостью и легко переносящий низкие положительные температуры. Штамм M. hiemalis MH-17.1, был выделен в виде чистой культуры из биомассы, собранной с погибших деревьев лиственницы сибирской (Larix sibirica L.) в окрестностях г. Красноярска. Предварительная оценка содержания белка в исследуемом объекте показала, что M. hiemalis MH-17.1, в зависимости от условий культивирования, может содержать от 20 до 30 % белка в расчете на абсолютно сухую массу (а. с. м.). По заключению КГБУ «Красноярская краевая ветеринарная лаборатория» глубинная биомасса M. Hiemalis MH-17.1 непатогенна для теплокровных организмов.
Задачей настоящего исследования являлось определение качественного и количественного состава аминокислот, входящих в состав общего белка глубинной биомассы M. hiemalis MH-17.1. В составе общего белка идентифицировано 17 индивидуальных аминокислот. При этом белок богат незаменимыми аминокислотами -до 50 % от общей суммы аминокислот, что примерно на 15 % больше, чем в стандарте пищевого белка (казеине) и пшенице. Важно, что в белке M. hiemalis MH-17.1 преобладают аминокислоты, играющие ведущую роль в углеводно-жировом обмене и наращивании массы. Всё это позволяет рекомендовать M. hiemalis MH-17.1 в качестве штамма-продуцента для получения белковых кормовых продуктов для сельского хозяйства.
Ключевые слова: Mucor hiemalis, глубинная культура, общий белок, аминокислоты, белковые кормовые продукты.
Conifers of the boreal area. 2018, Vol. XXXVI, No. 3, P. 265-269 MUCOR HIEMALIS: EVALUATION OF PROSPECTS FOR FEEDINGSTUFF PRODUCTION E. V. Alaudinova, P. V. Mironov, R. H. Enazarov
Reshetnev Siberian State University of Science and Technology 31, Krasnoyarsky Rabochy Av., Krasnoyarsk, 660037, Russian Federation E-mail: alaudinovaev@yandex.ru
Today, the deficit of high-quality protein food and feedingstuff on our planet is estimated at about 25 million tons per year. In this regard, among the priorities of modern biotechnology is the search for new types of raw materials, new types of protein producers, as well as the development of highly efficient technologies for obtaining food and feedingstuff enriched with protein.
A potential microorganism for the production of protein feedingstuff is the moldy fungus Mucor hiemalis (M. hiemalis), characterized by high growth rate, unpretentiousness and resistant to low positive temperatures. M. hiemalis MH-17.1 strain was isolated as a pure culture from biomass collected from dead Siberian larch trees (Larix sibirica L.) in the vicinity of Krasnoyarsk. A preliminary evaluation of the protein content in the investigated object showed that M. hiemalis MH-17.1, depending on the cultivation conditions, may contain 20 to 30 % protein in terms of an absolutely dry mass. According to the Krasnoyarsk Regional Veterinary Laboratory, the biomass of M. Hiemalis MH-17.1 is non-pathogenic for warm-blooded organisms.
Алаудинова Е. В., Миронов П. В., Эназаров Р. Х. Mucor Hiemalis: оценка перспективы использования для получения ...
The purpose of this study was to determine the qualitative and quantitative composition of the amino acids that make up the total protein of the biomass M. hiemalis MH-17.1. In the total protein, 17 individual amino acids were identified. Moreover, the protein is high of essential amino acids - up to 50 % of the total amount of amino acids, which is approximately 15 % more than in the standard of dietary protein (casein) and wheat. It is important that in the protein M. hiemalis MH-17.1, predominate amino acids, which play a leading role in carbohydrate-fat metabolism and mass increasing. All this makes it possible to recommend M. hiemalis MH-17.1 as a producer strain for the production of protein feedingstuff for agriculture.
Keywords: Mucorhiemalis, mycelium, bioconversion, total protein, amino acids, protein feedingstuff.
ВВЕДЕНИЕ
Одной из острейших проблем современного человечества является дефицит белковых продуктов высокого качества. По данным Института питания РАМН, начиная с 1992 г. в России потребление белковых продуктов снизилось примерно на 30 %, соответственно, увеличилось потребление углеводсодержащей пищи (хлебопродуктов, макаронных изделий, картофеля и т. д.), ежегодный дефицит пищевого белка достиг 1 млн тонн. При этом в семьях с низким доходом потребление белка в сутки составляет не более 45 г при норме 70 г. Снижение потребления белка имеет место не только в России, но и во многих странах мира. Общий дефицит белка на планете оценивается более чем в 100 млн тонн в год. По этой причине современная биотехнология в ряд приоритетных задач ставит устранение проблемы, связанной с недостатком белковых продуктов, посредством изыскания новых видов сырья, новых видов продуцентов белка, а также разработки высокоэффективных технологий получения пищевых и кормовых продуктов, обогащенных белком.
На кафедре химической технологии и биотехнологии СибГУ им. М. Ф. Решетнева с 2000 г. ведется работа по поиску новых возможных микробиологических продуцентов белка для микробиологической конверсии растительных (в первую очередь древесных) отходов. Одним из потенциальных микроорганизмов-продуцентов белка для получения кормовых продуктов, обогащенных белком является плесневый гриб Мисог Ыета^ (мукор зимний). Задачей данного исследования являлось установление качественного состава и количественного содержания аминокислот, входящих в состав общего белка глубинной биомассы Мисог Ыета^ (М. Hiemalis).
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования являлся штамм М. ЫетаШ МИ-17.1, выделенный в виде чистой культуры из биомассы Мисог Ыета^, собранной с погибших деревьев лиственницы сибирской (Ьапх sibirica Ь.) в окрестностях г. Красноярска.
Молекулярно-генетическая идентификация штамма проводилась в отделе генетики и селекции «Центра защиты леса Красноярского края» г. Красноярска.
Систематическое положение Мисог Шета^, из которого выделен штамм М. ЫетаШ МИ-17.1, следующее: надцарство эукариоты - ЕисагШа; царство настоящие грибы - Мусо1а, отдел зигомикота - Zigomycota; класс зигомицеты - Zigomycetes, порядок мукоральные -Мисога^, семейство мукоровые - Мисогасеае, род мукор - Мисог, вид - Мисог ЫетаШ [1].
Для оценки перспективности использования M. hiemalis MH-17.1 в качестве штамма-продуцента была культивирована его биомасса в глубинных условиях. Культивирование проводили в стационарном лабораторном биореакторе СеСа (Gallenkamp controlled environment culture apparatus, Великобритания) объемом 6 л при непрерывном механическом перемешивании со скоростью 400 об/мин. Биореактор оснащен датчиками, позволяющими контролировать рН, температуру питательной среды, перистальтическими насосами для подачи компонентов питательной среды и посевного материала.
Аэрация и барботаж культуры осуществлялась стерильным воздухом, расход воздуха - 100 л/ч на 1 л среды, температура питательной среды - (25±1) °С; рН - 5,0. Глубинное культивирование проводили на крахмаламмонийной среде следующего состава: крахмал - 30 г/л; (NH4bSO4 - 3,5 г/л; NaNOs - 3,5 г/л; NaCl - 0,1 г/л; K2HPO4 - 0,225 г/л; MgSO4-7H2O -0,5 г/л; KCl - 0,75 г/л; KH2PO4 - 1,275 г/л; CaCl2-4H2O -0,1 г/л.
Перед стерилизацией крахмальный клейстер для снижения вязкости обрабатывали в течение 30 мин при 60 °С промышленным ферментным препаратом -термостабильной а-амилазой (Термоамил 120 L, Германия).
Определение содержания общего белка в биомассе мицелия проведено с амидо-черным 10 В по методу Г. А. Бузуна [2]. Аминокислотный состав белка определяли после гидролиза 6 н HCl на автоматическом анализаторе аминокислот ААА 339М (Microtechna, Чехия) по методу [3].
Получено заключение КГБУ «Красноярская краевая ветеринарная лаборатория» о непатогенности глубинной биомассы M. hiemalis MH-17.1 для теплокровных организмов. Известно, что гриб Mucor hiemalis издавна используется в пищевой промышленности.
В соответствии с «Санитарно-эпидемиологическими правилами» СП 1.3.2322-08, действующими на территории РФ с 01.05.2008 [4], грибы рода Mucor отнесены к IV группе опасности (приложение 1). Следует отметить, что некоторые виды дрожжей рода Candida, широко применяемые в гидролизной и микробиологической промышленности для получения этилового спирта и белковых кормовых продуктов входят в III и IV группы опасности. Несмотря на то, что гриб Mucor hiemalis, по данным [4], опасности не представляет, при работе с ним, как и с дрожжами, требуется соблюдение установленных правил работы с микроорганизмами и техники безопасности.
В работе приводятся средние арифметические значения 3 аналитических повторностей экспериментов.
Оценка значимости различий проведена методом сравнения средних значений по критерию Стьюдента при доверительной вероятности P = 0,95.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Предварительная оценка глубинной биомассы M. hiemalis MH-17.1, как штамма-продуцента показала, что, в зависимости от условий культивирования, биомасса может содержать 30-35 % белка в расчете на абсолютно сухую массу (а. с. м.). Следовательно, при микробиологической конверсии растительного сырья, используемого в качестве субстрата при культивировании M. hiemalis MH-17.1, полученный продукт будет обогащаться белком штамма-продуцента.
В таблице приведены результаты исследования аминокислотного состава белка M. hiemalis MH-17.1 в сравнении с аминокислотным составом эталонного пищевого белка (казеина) и белка пшеницы.
В составе общего белка M. hiemalis MH-17.1 обнаружено 26 нингидрин-положительных соединений, из которых идентифицированы 18 индивидуальных аминокислот. Преобладающими являются треонин, аспа-рагиновая (сумма аспарагина и аспарагиновой кислоты) и глутаминовая (сумма глутамина и глутаминовой кислоты) кислоты и пролин. Содержание этих компонентов находится в пределах 7,5-12 % от суммы аминокислот. Доминирующими в белке являются аминокислоты глутаминового пула, к которым относятся глутаминовая кислота, пролин и аргинин, их общее содержание составляет около 24 %.
Если высокое содержание условно незаменимой глутаминовой кислоты, достигающее 42 % от суммы аминокислот данного пула, присуще продуктам микробиологического синтеза [5; 6], то доминирование в составе глутаминового пула пролина, совершенно не характерно. Объяснение данного факта может заключаться в гидрофильных свойствах пролина и его
Аминокислотный состав общего белка Mucor hiemalis
способности восстанавливать структуру белков после повреждения [7; 8]. Вероятно, столь высокое содержание в составе общего белка пролина позволяет Мисог ИгвтаН^' легко переносить низкие положительные температуры, сохраняя при этом высокую скорость роста.
В составе белка отмечается высокое содержание незаменимых аминокислот с разветвленной боковой цепью (лейцин + изолейцин + валин), а также незаменимых аминокислот, относящихся к ароматическому пулу (фенилаланин + тирозин). Их суммарное содержание составляет около 15-16 %.
Обращает на себя внимание, что в белке М. МвтаИ^' МН-17.1 доминируют аминокислоты, входящие в состав всех природных белков животных организмов, активно участвующие в энергетическом, углеводно-жировом обмене и синтезе тканевых белков организма, т. е. в наращивании массы [9; 10]. Это лейцин, изолейцин и условно незаменимая глутаминовая кислота. Кроме того, глутаминовая кислота принимает участие в обезвреживании и выведении аммиака из животного организма.
Высокий уровень треонина, способствующего активному усвоению всех аминокислот, также существенно влияет на обмен веществ животного организма [9]. В то же время белок лимитирован по лизину, что в целом характерно для продуктов растительного происхождения и микробиологического синтеза [5; 6]. Отсутствие триптофана объясняется его неустойчивостью в условиях гидролиза минеральными кислотами, что является частью подготовки пробы для аминокислотного анализа.
Рассматривая Мисог ИгвтаН^' в качестве потенциального микроорганизма-продуцента белка для получения кормовых продуктов, требуется установить биологическую ценность белка по содержанию в нём незаменимых аминокислот.
Наименование аминокислот
Содержание в белке, % от суммы
белок скор белок эталон- скор белок пше- скор
М. hiemalis ный [11] ницы [9]
Незаменимые аминокислоты
Изолейцин 4,18±0,20 104,50 4,00 100,00 3,90 97,50
Лейцин 5,52±0,28 78,85 7,00 100,00 6,80 97,14
Лизин 4,12±0,20 74,91 5,50 100,00 3,30 60,00
Метионин + цистин 6,55±0,33 187,14 3,50 100,00 3,30 94,28
Треонин 8,60±0,41 215,00 4,00 100,00 3,30 82,50
Валин 6,34±0,29 126,80 5,00 100,00 4,80 96,00
Фенилаланин + тирозин 15,21±0,57 253,50 6,00 100,00 8,40 140,00
Триптофан - - 1,00 100,00 1,60 160,00
Заменимые аминокислоты
Аспарагиновая кислота 7,55±0,38 6,00
Аргинин 2,21±0,09 5,74
Серин 3,02±0,11 4,54
Глутаминовая кислота 10,04±0,36 25,0
Пролин 12,07±0,75 9,00
Глицин 5,12±0,22 4,13
Аланин 5,37±0,24 4,00
Гистидин 4,10±0,17 2,67
Алаудинова Е. В., Миронов П. В., Эназаров Р. Х. Mucor Hiemalis: оценка перспективы использования для получения
Анализируя результаты исследования (см. табл.) необходимо отметить, что белок M. hiemalis MH-17.1 богат незаменимыми аминокислотами. Их содержание достигает 50 % от общей суммы аминокислот, т. е. по этому показателю белок глубинной культуры примерно на 15 % превышает белок казеина (принятого в качестве стандарта пищевого белка), а также белок фуражного зерна пшеницы (обычной добавки в корм сельскохозяйственных животных).
Современным стандартом пищевых белков является показатель скор - скорректированный аминокислотный коэффициент усвояемости белков, рекомендованный для применения при оценке качества белков Объединенным экспертным советом ФАО/ВОЗ (1973) [11]. Сравнение скора незаменимых аминокислот белка глубинной культуры M. hiemalis MH-17.1 со скором эталонного белка - казеина и белка пшеницы показывает, что M. hiemalis MH-17.1 значительно превосходит по данному показателю и казеин, и пшеницу. Следовательно, усвояемость белка M. hiemalis MH-17.1 выше усвояемости стандарта пищевого белка (казеина), а также белка пшеницы - традиционной кормовой добавки.
ВЫВОДЫ
Таким образом, показано, что биомасса глубинной культуры Mucor hiemalis MH-17.1 не патогенна для теплокровных организмов. Биологическая ценность биомассы Mucor hiemalis MH-17.1, обусловлена высоким содержанием легкоусвояемого белка, включающего около 50 % незаменимых аминокислот. Данные аминокислоты входят в состав белков животных организмов и играют ведущую роль в активизации метаболических процессов, направленных на наращивание массы животных.
Установленные характеристики позволяют рекомендовать штамм Mucor hiemalis MH-17.1 в качестве штамма-продуцента для получения методом биоконверсии растительного сырья (древесных и сельскохозяйственных отходов) обогащенных белком кормовых продуктов.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
1. Жизнь растений в шести томах. Т. 2. Грибы / под ред. М. В. Горленко. М. : Просвещение, 1976. 479 с.
2. Бузун Г. А., Джемухадзе К. М., Мелешко Л. Ф. Определение белка в растениях с помощью амидо-черного // Физиология растений. М., 1982. С. 198-204.
3. Effect of cold shock on the mitochondrial activity and on the temperature of winter wheat seedlings / V. Vojnikov [et al.] // Biochem. Physiol. Pflanzen. 1984. Vol. 179. P. 327-330.
4. СП 1.3.2322-08. Санитарно-эпидемиологические правила, действующие на территории РФ с 01.05.2008 г. (Зарегистрировано в Минюсте РФ 21.02 2008 г. № 11197).
5. Панфилов В. И. Биотехнологическая конверсия углеводсодержащего растительного сырья для полу-
чения продуктов пищевого и кормового назначения : дис. ... д-ра техн. наук : 03.00.23 / Панфилов Виктор Иванович. М., 2004. 359 с.
6. Технология биоконверсии растительного сырья. Ч. II. Перспективные технологии микробиологической конверсии растительной биомассы / П. В. Миронов [и др.] ; Сиб. гос. технологич. ун-т. Красноярск, 2002. 159 с.
7. Gleeson D., Lelu-Walter M. A., Parkinson M. Influence of exogenous proline on embriogenic cultures of larch (Larix leptoeuropaea Dengler), spruce (Picea sitchensis (Bong.) Carr.) and oak (Quercus robur L.) subjected to cold and salt stress // Ann. For. Sci. 2004. Vol. 61, № 4. P. 125-128.
8. Overexpression of the Arabidopsis CBF3 transcriptional activator mimics multiple biochemi cal changes associated with cold acclimation / S. J. Gilmour [et al.] // Plant Physiol. 2000. Vol. 124, № 4. P. 18541865.
9. Хохрин С. Н. Корма и кормление животных. СПб. : Лань, 2002. 512 с.
10. Нормы и рационы кормления сельскохозяйственных животных. Справочное пособие. 3-е изд., пе-рераб. и доп. / под ред. А. П. Калашникова, В. И. Фи-синина, В. В. Щеглова, Н. И. Клейменова. М. : Рос-сельхозакадемия, 2003. 456 с.
11. Joint FAO/WHO Ad hoc expert committee on energy and protein requirements. Rome, 1973. P. 522.
REFERENCES
1. Zhizn' rasteniy v shesti tomakh. T. 2. Griby / pod red. M. V. Gorlenko. M. : Prosveshcheniye, 1976. 479 s.
2. Buzun G. A., Dzhemukhadze K. M., Meleshko L. F. Opredeleniye belka v rasteniyakh s pomoshch'yu amidochernogo // Fiziologiya rasteniy. M., 1982. S. 198— 204.
3. Effect of cold shock on the mitochondrial activity and on the temperature of winter wheat seedlings / V. Vojnikov [et al.] // Biochem. Physiol. Pflanzen. 1984. Vol. 179. P. 327-330.
4. SP 1.3.2322-08. Sanitarno-epidemiologicheskiye pravila, deystvuyushchiye na territorii RF s 01.05.2008 g. (Zaregistrirovano v Minyuste RF 21.02 2008 g. No. 11197).
5. Panfilov V. I. Biotekhnologicheskaya konversiya uglevodsoderzhashchego rastitel'nogo syr'ya dlya polucheniya produktov pishchevogo i kormovogo naznacheniya : dis. ... d-ra tekhn. nauk : 03.00.23 / Panfilov Viktor Ivanovich. M., 2004. 359 s.
6. Tekhnologiya biokonversii rastitel'nogo syr'ya. Ch. II. Perspektivnye tekhnologii mikrobiologicheskoy konversii rastitel'noy biomassy / P. V. Mironov [i dr.] ; Sib. gos. tekhnologich. un-t. Krasnoyarsk, 2002. 159 s.
7. Gleeson D., Lelu-Walter M. A., Parkinson M. Influence of exogenous proline on embriogenic cultures of larch (Larix leptoeuropaea Dengler), spruce (Picea sit-shensis (Bong.) Carr.) and oak (Quercus robur L.) subjected to cold and salt stress // Ann. For. Sci. 2004. Vol. 61, No. 4. P. 125-128.
8. Overexpression of the Arabidopsis CBF3 transcriptional activator mimics multiple biochemi cal changes associated with cold acclimation / S. J. Gilmour [et al.] // Plant Physiol. 2000. Vol. 124, No. 4. P. 18541865.
9. Khokhrin S. N. Korma i kormleniye zhivotnykh. SPb. : Lan', 2002. 512 s.
10. Normy i ratsiony kormleniya sel'skokhozyayst-vennykh zhivotnykh. Spravochnoye posobiye. 3-e izda-
niye pererab. i dop. / pod red. A. P. Kalashnikova, V. I. Fisinina, V. V. Shcheglova, N. I. Kleymenova. M. : Rossel'khozakademiya, 2003. 456 s.
11. Joint F AO/WHO Ad hoc expert committee on energy and protein requirements. Rome, 1973. P. 522.
© Алаудинова Е. В., Миронов П. В., Эназаров Р. Х., 2018
Поступила в редакцию 04.04.2018 Принята к печати 28.06.2018
