CC BY
32
© Т. М. Явишева, А. С. Ягубов, 1996 УДК 616-006.-07:611-018.7
Т. М. Явишева, А. С. Ягубов
МОРФОМЕТРИЯ КЛЕТОК НОРМАЛЬНОГО ЭПИТЕЛИЯ И РАКА ЛЕГКОГО ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ АНАЛИЗАТОРА «КОГЧТЛОР^»
Отдел молекулярно-биологических и радиоизотоппых методов исследования
В последнее время появляется все больше работ, свидетельствующих о том, что эпителий различных органов млекопитающих структурирован идентично — по типу функциональных единиц, состоящих из базальных клеток и их потомков [2—4]. Однако в литературе практически отсутствуют данные, касающиеся количественной морфологии клеток базального слоя эпителия, который является определяющим звеном в формировании функциональных единиц.
В настоящее время имеются сведения о том, что нормальная эпителиальная ткань и ткань раковой опухоли имеют одинаковые механизмы пролиферации. Одну из причин злокачественного роста связывают с изменениями структур функциональных единиц.
Целью нашей работы было изучение количественной морфологии базального слоя нормального эпителия и опухолевой ткани (на примере рака легкого человека) и выявление некоторых признаков, характеризующих нормальный и злокачественный рост.
Материалы и методы. Изучали эпителиальную ткань на роговице мыши, так как вследствие прозрачности стромы и отсутствия сосочковых выростов этот орган представляет собой идеальную модель для исследования эпителия. Исследовали многослойный плоский нео-роговевающий эпителий роговицы глаза на 60 глазах 30 половозрелых мышей-самок линии ВАЬВЛу.
Эпителий роговицы глаза изучали на тотальных плоскостных препаратах, обработанных азотнокислым серебром, по Ранвье и по Фель-гену—Розенбеку, митотическую активность клеток эпителия роговицы — на тотальных плоскостных препаратах, обработанных по Фельгену—Розенбеку. Подсчитывали фигуры митоза на всю роговицу в двух взаимно перпендикулярных осях в утренние и вечерние часы.
Исследовали опухолевую ткань 14 больных, страдавших раком легкого, в возрасте от 40 до 60 лет.
Изучали отпечатки опухолевой ткани, обработанные азотнокислым серебром по Ранвье. Всего было исследовано 42 образца опухолевой ткани с различных участков опухоли (на каждую опухоль приходилось по 3 образца).
Морфометрический анализ материала проводили на специализированном анализаторе изображения «Когигоп» (Германия). С помощью имеющихся программных средств было проведено шкалирование, т. е. перевод изображений клеток из точек экрана в миллиметры. Изучали площади базальных клеток эпителия и опухолевых клеток, их ядер, степень эллиптичности (СЭ) клеток и ядер. СЭ определялась как отношение значения наименьшей оси эллипса к его наибольшей. Чем больше значение этого параметра приближается к 1, тем более округлой формы та или иная структура и наоборот.
Получены гистограммы распределения клеток по вышеперечисленным параметрам. Все значения полученных параметров были разбиты на 65 классов. В каждом конкретном случае анализировали
3 000—4 000 клеток.
Результаты и обсуждение. В утренние часы количество митозов у 5 мышей составляло 20 (профаза и телофаза) на 10 полей зрения, у 7—11 ядер в профазе и телофазе и у 3 мышей — 14 фигур митоза на 10 полей зрения. В вечерние часы число митозов у 10 мышей
T. M. Yavisheva, A. S. Yagubov
MORPHOMETRY OF NORMAL EPITHELIAL AND HUMAN LUNG CARCINOMA CELLS USING A KONTRON ANALYZER
Department for Molecular Biological and Radioisotopic Investigations, CRC RAMS
There are many recent publications demonstrating that epithelium of various mammalian organs is structured identically, i. e. is formed by functional units consisting of basement cells and their progeny [2-4]. However, there are practically no data on quantitative morphology of epithelial basement cells which play a leading part in formation of the functional units.
There is some evidence in support of the fact that normal epithelial tissue and cancer tissue have similar mechanisms of proliferation. Structural changes in their functional units are considered one of the causes of malignant growth.
The purpose of our investigation was to study quantitative morphology of basement layer of normal epithelium and tumor tissue (on the example of human lung carcinoma) and to analyze some characteristics of the normal and malignant growths.
Materials and Methods. The study was performed on mouse corneal epithelium, because due to transparency of its stroma and the absence of papillae this organ is an ideal model for study of epithelium. The object of the study was multilayer flat non-keratinizing corneal epithelium from 60 eyes of 30 BALB/cj mature female mice.
Eye corneal epithelium was studied on total plane specimens treated with silver nitrate according to Ranvier and Fuelgen-Rosenbeck, mitotic activity of corneal epithelial cells was studied on total plane specimens treated according to Fuelgen-Rosenbeck. Mitosis figures were counted per entire cornea in two perpendicular axes in the morning and in the evening.
Tumor tissue for the study was taken from 14 patients with lung cancer at the age ranging from 40 to 60 years.
The study was performed on tumor tissue imprints from various tumor areas (3 imprints per tumor) treated with silver nitrate according to Ranvier. A total of 42 tumor specimens were investigated.
Morphometry of the specimens was performed using a special image analyzer Kontron (Germany). Scaling, i.e. conversion of cell images from dots on the display into millimeters, was effected using relevant soft-ware. We studied cell area, cell nuclear area, cell and nucleus degree of ellipticity (DE) in the basement layer of normal epithelium and tumor tissue. DE was defined as ratio of ellipsis shortest to longest axes. The closer this value was to unit the more round was thé cell structure and vice versa.
Histograms of cell distribution with respect to the above-mentioned characteristics were plotted. All parameter values were divided into 65 classes. About 3-4 thousand cells were analyzed in each case.
Results and Discussion. In the morning the number of mitoses in 5 mice was 20 (prophase and telophase) per 10 visual fields, in 7 mice 11 nuclei in prophase and telophase and in 3 mice 14 mitosis figures per 10 visual fields. In the evening the number of mitoses in 10 mice was 3 per 10 visual fields, in 5 mice 2 per 10 visual fields (prophase and telophase). Thus, there was a clear dépendance of mitosis activity on the hour of the day, which allowed evaluation of epithelial proliferation activity changes.
Comparison of cell distribution histograms with re-
Таблица 1 Table 1
Количественная характеристика клеток базального слоя эпителия роговицы Quantitative characterization of corneal epithelial basement cells
Условное название рядов клеток СЭ Содержание клеток с определенной СЭ во всей популяции, % Содержание клеток каждого класса во всей популяции, % Количество классов клеток, входящих в определенный ряд клеток Площадь клеток, мкм2
Клетки пика 1 Peak 1 cells 0,5774 20—30 20—30 1 43,67
Клетки пика 2 Peak 2 cells 0,6124 8—10 8—10 1 52,41
Узкие клетки Narrow cells 0,1077—0,2615 9—10 0,1—1,2 17 43—99
Вытянутые клетки Oblong cells 0,2616—0,4154 16 1,8-2,5 10 -
Переходные клетки Transitional cells 0,4155—0,5692 16 0,5—1,5 11 -
Овальные клетки Oval cells 0,6154—0,7846 10 0,09—1,3 11 51,69—81,9
Клетки пика А Peak A cells 0,7194 0,3 0,3 1 78,61
Клетки пика Б Peak В cells 0,7385 5 5 1 52,41
Круглые клетки Round cells 0,7847—1,0 6 0,02—0,1 14 60,3—64,6
Клетки пика В Peak С cells 0,7906 2 2 1 69,87
Conventional names of cell series DE Percentage of cells with a certain DE in the population Percentage of cells of each series in the population No. of cell classes within a cell series Cell area, mcm2
было 3 фигуры на 10 полей зрения, у 5 мышей — 2 фигуры митоза на 10 полей зрения (профаза и те-лофаза). Таким образом, выявляется четкая зависимость митотической активности в зависимости от времени суток, что позволяет оценивать пролиферативную активность эпителия в динамике.
При сравнении гистограмм распределения клеток по СЭ и площади в вечерние часы, когда пролиферативная активность клеток эпителия снижена, выявлено, что наибольший удельный вес (20—30%) среди всей популяции базальных клеток занимают клетки с СЭ 0,5774 и площадью 43,67 мкм2, включающие 1 класс клеток и условно названные нами клетками пика 1 (см. табл. 1). Второе место по удельному весу в популяции принадлежит клеткам с СЭ 0,6124, которые также занимают 1 класс и обозначены как клетки пика 2. При анализе гистограмм слева направо по СЭ выделяются ряды клеток, занимающих различный удельный вес в популяции. Так, самый крайний левый ряд клеток с СЭ 0,1077—
0,2615 условно назван нами узкими клетками, следующий за ним ряд клеток с СЭ 0,2615—0,4154 — вытянутыми и с СЭ 0,4154—0,5692 — переходными клетками.
При анализе правых областей гистограмм выявляется ряд овальных клеток с СЭ от 0,6154 до 0,7846, в котором имеется два пика клеток: пик А с СЭ 0,7194 и пик Б с СЭ 0,7385. Следующий за ним ряд — круглые клетки с СЭ от 0,7846 до 1,0. Среди круглых клеток выделяется пик В с СЭ 0,7906 (рис.1, а).
Основное наше внимание было уделено клеткам
spect to DE and area in the evening when epithelial cell proliferation was decreased showed that cells with DE 0.5774 and area 43.67 mcm2 were the most frequent (20-30%) in the whole basement cell population. These cells included 1 cell class and were conventionally called peak 1 cells (see the table). Cells with DE 0.6124 were the second common in the population. These cells also occupied one class and were called peak 2 cells. Analysis of the histograms from left to right with respect to DE distinguished series of cells with different specific weight in the population. The first series from the left with DE 0.1077-0.2615 was conventionally called narrow cells, the following series with DE 0.2615-0.4154 were called oblong and with DE 0.4154-0.5692 transitional cells.
Analysis of the right area of the histograms discovered a series of oval cells with DE 0.61547 to 0.7846 having two peaks: A with DE 0.194 and B with DE 0.7385. The next series of round cells with DE 0.7846 to 1.0 had a peak C with DE 0.7906.
We focussed on peak 1, A, B cells, i.e. transitional, oblong and round cells, because by morphometric data these cells were closely connected.
In the morning when epithelial cell mitosis was active the rate of peak 1 cells was 8-15%, while in the evening when the proliferative activity was decreased this rate reached 20-30%. Analysis of the cell distribution diagrams in order of decrease in peak 1 cells (i. e. in order of ascending mitotic activity) discovered very flexible, dynamic changes.
0,3
Круглые клетки Round cells
Юг
9
8
7 ■
6
5
4
3
2
1
0
10
Круглые клетки Round cells
Рис. 1. Распределение клеток эпителия глаза мыши по форме в процессе нарастания пролиферации.
а — численность клеток пика 1—25%; Ь — численность клеток пика 1—10%. Здесь и на рис. 2 по оси абсцисс — СЭ клеток; по оси ординат — количество клеток определенной формы, %.
Fig. 1. Mouse eye epithelial cell distribution with respect to shape with increase in proliferation activity.
Here and in fig.2 numbers on the x axis show cell DE; numerals on the у axis show number of cells of a certain shape; a, rate of
peak 1 cells is 25%; b, rate of peak 1 cells is 10%.
пиков 1, А, Б, переходным, вытянутым и круглым клеткам, так как, по данным морфометрии, эти клетки оказались тесно связаны между собой.
В утренние часы, когда митотическая активность клеток эпителия высокая, значение пика клеток 1 составляет 8—15%, а в вечерние часы при снижении пролиферативной активности 20—30%. Когда гистограммы распределения клеток по СЭ в утренние и вечерние часы были разложены в убывающем по значению пика 1 порядке (т. е. в порядке нарастания митотической активности клеток эпителия), то обнаружились очень гибкие, динамические изменения в гистограммах.
При снижении значения пика 1 постепенно увеличивается количество переходных и вытянутых клеток. Одновременно с этим плавно уменьшается количество клеток пика Б и пропорционально этому увеличивается значение клеток пика А. Когда количество клеток пика 1 достигает 19%>, численность переходных клеток становится равной 19%, а вытянутых — 23%. Значение клеток пика Б уменьшается с 5 до 3,5%, а пика А, наоборот, увеличивается с 0,3 до 1,5%, т.е. в сумме значение пиков А и Б составляет около 5%.
При дальнейшем динамическом наблюдении, когда количество клеток пика 1 снижается до 10%, а переходных клеток увеличивается до 25% и вытянутых до 30%, происходит выравнивание значений пиков А и Б (2 и 2%) (рис. 1, Ь). Дальнейший переход клеток пика Б в А не происходит. Когда произошло выравнивание значений обоих этих пиков, снижается количество вытянутых клеток с 30 до 25%), а численность круглых клеток увеличивается на 4—5%. После того как численность вытянутых клеток уменьшилась на 5%, вновь начинается плавный переход клеток пика Б в А.
Таким образом, пролиферативные процессы в базальном слое эпителия сопровождаются снижением количества клеток пика 1 и пропорциональным увели-
Transitional and oblong cells were gradually increasing in number with decrease in peak 1 values. Simultaneously the number of peak B cells was decreasing with peak A cells increasing proportionally. When the rate of peak 1 cells reached 19%, the rate of oblong cells was also 19% and the rate of oblong cells reached 23%. Peak B frequency was decreasing from 5 to 3.5%, while peak A showed increase from 0.3 to 1.5%, i. e. the total of peaks A and B was about 5%.
Further, when the rate of peak 1 cells reduced to 10%, transitional cells reached 25% and oblong ones 30%, the peaks A and B became equal (2% each) (fig.l, b). There is no transition of peak B into peak A cells. When these peaks became equal the number of oblong cells reduced from 30 to 25% while the rate of round cells increased by 4-5%. After the 5% reduction in oblong cells, peak B cells started to change into peak A ones.
Thus, proliferative processes in epithelial basement layer were accompanied by reduction in the rate of peak 1 cells with proportional rise in transitional and oblong cells and conversion of peak B cells into peak A.
As proliferation proceeded areas of oblong and transitional cells increased from 94.8-99 to 172.3-176.6 mcm2. Areas of peak 1, A, B cells remained unchanged.
Analysis of nuclear area distribution histograms showed that nucleus areas of peak 1, A, B cells as well as those of oval and round cells remained within the same class ranges as their cell areas, i.e areas of the nuclei in question did not change, irrespective of epithelial cell proliferative activity.
As concerns oblong or transitional cells their nuclear areas increased from 94.8-99 to 120.6-124.9 mcm2.
Thus, peak 1 cells changed into their derivative forms, i.e. transitional and oblong cells, as proliferation activity increased. Peak 1 cell and nucleus areas were not chang-
чением количества переходных и вытянутых клеток с одновременным переходом клеток пика Б в А.
В ходе пролиферации увеличились площади вытянутых, переходных клеток с 94,8—99 до 172,3— 176,6 мкм2. Площади клеток пиков 1, А, Б, овальных и круглых клеток не изменились в динамике.
При изучении гистограмм распределения площадей ядер клеток нами выявлено, что независимо от пролиферативной активности клеток эпителия площади ядер клеток пиков 1, А, Б, овальных и круглых находились в тех же классовых интервалах, что и площади этих клеток, т. е. площади данных ядер не изменялись в динамике.
Что же касается ядер вытянутых, переходных клеток, то в процессе динамического наблюдения происходит увеличение их ядер с 94,8—99 до 120,6—124,9 мкм2.
Таким образом, при нарастании пролиферативных процессов в эпителии клетки пика 1 переходят в свои производные формы — переходные и вытянутые клетки. Площади клеток и ядер пика 1 не изменяются в динамике. Следовательно, ядерно-цитоплазматическое соотношение в этих клетках высокое и стабильное. Площади же вытянутых, переходных клеток увеличиваются быстрее, чем площадь их ядер, что влечет за собой уменьшение в этих клетках ядерно-цитоплазматичес-кого соотношения. Отсюда очевидно, что клетки пика 1 и их производные составляют группу пролиферирующих клеток.
Важно отметить, что при достижении вытянутыми клетками 30% часть из них (5%) переходит в круглые клетки, которые в процессе возрастания пролиферативной активности эпителия имеют постоянный размер площади клетки и ядра. Следует предположить, что круглые клетки — это вытянутые клетки, непосредственно вступившие в митоз.
Нами выявлено, что уменьшение числа вытянутых клеток на 5% происходит лишь тогда, когда количество клеток пиков Б и А будет равным. И в то же время по достижении вытянутыми клетками численности 30% переход клеток пика Б в А прекращается. Таким образом, вытянутые клетки и клетки пика Б функционально связаны друг с другом по принципу отрицательной обратной связи.
В опухолевой ткани на гистограммах распределения клеток по СЭ обнаружены идентичные норме ряды клеток (рис. 2, а). В динамике нам никогда не удавалось обнаружить количество клеток пика 1 более 16—20%, в то время как удельный вес переходных клеток составлял 19%), а вытянутых клеток — 29%. Это происходит, по-видимому, за счет активации пролиферативных процессов в опухолевой ткани.
На гистограммах распределения опухолевых клеток по СЭ, как и в норме, нами обнаружено, что при дальнейшем снижении удельного веса клеток пика 1 до 10% происходит плавное увеличение переходных клеток с 19 до 20%, а вытянутых клеток — с 29 до 30%. При этом количество клеток пиков Б и А постепенно становится равным (рис. 2, Ь). В этот момент происходит снижение вытянутых клеток на 4%. По достижении вытянутыми клетками численности 30%, как и в норме, клетки пика Б прекращают переходить в клетки пика А.
10 9 8
7 6
5
4
3 2 1 0
А Б Крутые клетки
Round cells
% b
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1 0
Рис. 2. Распределение клеток рака легкого человека по форме в процессе нарастания пролиферации.
а— численность клеток пика 1—20%; b — численность клеток пика 1—10%.
Fig. 2. Human lung carcinoma cell distribution with respect to shape with increase in proliferation activity.
a, rate of peak 1 cells is 20%; b, rate of peak 1 cells is 10%.
ing during observation. Therefore, the nucleus-cytoplasm ratio in these cells was high and stable. While areas of oblong and transitional cells were increasing faster than areas of their nuclei which involved reduction in the nucleus-cytoplasm ratio of these cells. It follows that peak 1 cells and their derivatives belonged to proliferating cells.
Of note, that on reaching 30% a part (5%>) of oblong cells becomes round with cell and nucleus area constant as epithelial proliferation activity was increasing. This suggests that the round cells are oblong cells entering mitosis.
We discovered that the 5% reduction in oblong cell count occurred only after the number of peak В cells became equal to that of peak A cells. While after oblong cells reached 30% the transition of peak В cells into peak A ones stopped. Thus, the oblong cells and peak 1
10
Круглые клетки Round cells
6 1
4
1
В литературе [5] имеются сообщения о том, что нормальные и опухолевые клетки имеют схожие характеристики роста, таким образом, предполагается одинаковая программа роста у обоих типов клеток.
Возможно, что на начальных стадиях развития у опухолевых клеток не затронуты механизмы, контролирующие митотический цикл в целом [1].
В опухоли количество переходных клеток в момент перехода их части в митоз несколько ниже, чем в норме, что можно связать с достаточно быстрой трансформацией этих клеток в вытянутые, т. е. имеет место укорачивание клеточного цикла.
Итак, по данным автоматизированной морфомет-рии в опухолевой ткани имеются такие же, как и в нормальном эпителии, группы клеток. Во время выравнивания количества клеток пиков Б и А и достижения вытянутыми клетками численности 30% происходит, как и в норме, переход вытянутых клеток непосредственно в митоз. Таким образом, в популяции опухолевой ткани имеется жесткая регуляция митотической активности клеток, в которой участвуют клетки пиков 1, Б и А. Регуляция митотической активности опухолевых клеток на этом этапе не нарушена и осуществляется, как и в норме, по принципу отрицательной обратной связи.
ЛИТЕРА ТУРА /REFERENCES
1. Васильев Ю. М., Маленков А. Г. Клеточная поверхность и реакция клетки. — JI, 1968.
2. Даншенко В. И. Системный анализ морфогенеза рака молочной железы: Дис. ... д-ра мед. наук. — М., 1983.
3. Летучая Ф. И., Кетлинская С. А. II Цитология. —1980. — Т.22, № 2. — С. 176—181.
4. Ягубов А. С., Даниленко В. И. //Арх. анат. — 1988. — № 2. — С. 74 — 77.
5. Skehan P. II Growth. — 1986. — Vol. 50. — P. 486.
Поступила 19.09.951 Submitted 19.09.95
cells appear to be functionally related to each other in an inverse manner.
Tumor tissue cell distribution histograms with respect to DE demonstrate cell series identical to normal ones (fig. 2, a). We failed to find more than 16-20% of peak 1 cells while the rate of transitional cells was 19% and that of oblong cells 29%. This may be due to activation of proliferative processes in tumor tissue.
Similar to normal cells tumor cell distribution histograms with respect to DE showed that further decrease in peak 1 cells to 10% was accompanied by gradual increase in transitional cells from 19 to 20% and in oblong cells from 29 to 30%, the number of peak B and A cells becoming equal (fig. 2, b). At that moment the rate of oblong cells showed a 4% reduction. Like in normal epithelium, peak B cells stopped transition into peak A after oblong cells reached 30%.
There are publications [5] reporting common characteristics of normal and tumor cells which suggests common program of their growth.
Mechanisms of control of mitosis as a whole do not seem impaired at early stages of development [1].
In tumor the number of transitional cells at the moment when a part of them enters mitosis is somewhat lower than in normal tissue which may be due to rather rapid transformation of these cells into oblong ones,
i. e. cell cycle shortening.
Thus, computerized morphometric findings show that tumor tissue has the same cell groups as normal epithelium. Similarly to normal tissue, oblong cells enter mitosis when cells of peaks A and B become equal in number and oblong cells reach 30%. Thus, there is strong regulation of cell mitotic activity in tumor cell population. Peak 1, A and B cells obey this regulation. Regulation of tumor cell mitotic activity is not compromised at this stage and is effected by inverse feed-back.
Pharmacia &Upjohn
