CC BY
23
0 Коллектив авторов, 1995 УДК 616-006.0.92.9-085
Т. М. Явишева, А. С. Ягу бое, И. С. Голубева,
И. Ю. Кубасова
КОЛИЧЕСТВЕННАЯ МОРФОЛОГИЯ ЭПИТЕЛИЯ ГЛАЗА МЫШИ В ПРОЦЕССЕ ХИМИОТЕРАПИИ
Отдел молекулярно-биологических и радиоизотопных методов исследования, НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей
На основе комплексного анализа гистограмм распределения клеток по различным параметрам нами разработана схема исследования морфофункциональных особенностей клеток базального слоя эпителия в различные периоды его жизнедеятельности [4, 5].
Интересно проследить на основе этого метода морфофункциональные особенности клеток эпителия глаза мыши при воздействии на популяцию эпителия роговицы химиопрепарата дактиномицина, вызывающего регрессию опухолей различной локализации. Действие химиопрепаратов недостаточно избирательно в отношении опухолевой ткани. Предполагается, что быстро пролиферирующая опухолевая ткань несколько больше повреждается противоопухолевыми препаратами, чем нормальная. Однако и в ряде нормальных тканей темп пролиферативных процессов весьма велик и именно в них интенсивно проявляются эффекты противоопухолевых препаратов. В первую очередь это костный мозг, селезенка, слизистые оболочки различных органов и т.д. [1].
Материалы и методы. Противоопухолевую активность химиопрепарата дактиномицина изучали на мышах линии ВАЬВ/д с перевиваемым мышиным штампом плазмоцитомы МОРС-406 по принятой в ОНЦ РАМН методике [2, 3].
8 мышам (16 глаз) внутрибрюшинно перевивали взвесь измельченных опухолевых узлов, расположенных в брюшной полости по брыжейке, по 0,5 мл/мышь взвеси, разведенной средой 199 из расчета
1 г опухолевой ткани на 10 мл среды. Лечение начинали через 48 ч после перевивки. Время перевивки 14 дней. Проводили лечение 5 мышей (10 глаз) дактиномицином в дозе 0,04 мг/кг массы мыши внутрибрюшинно при 5-кратном ежедневном введении. 3 мыши (6 глаз), которым препарат не вводили, были контрольными.
Исследовали плоскостные препараты, обработанные нитратом серебра, на анализаторе изображения «КоЫгоп».
Изучение роговиц проводили, анализируя гистограммы распределения клеток по степени их эллиптичности (СЭ), а также по стандартному критерию оценки противоопухолевой эффективности химиопрепарата — торможению роста опухоли по объему, выраженному в процентах к контролю (% ТРО) с минимальным критерием эффективности 50%.
Результаты и обсуждение. Ранее нами [4, 5] выявлено, что наибольший удельный вес (20—30%) среди всей популяции базальных клеток эпителия глаза мыши занимают клетки с СЭ 0,5774 — клетки пика 1. При анализе гистограмм слева направо по СЭ четко выделяются ряды клеток, занимающих различный удельный вес в популяции: узкие (10%, СЭ 0,1077—0,2615), вытянутые (16%, СЭ 0,2615—0,4154), переходные (16%, СЭ 0,4154—0,5692), овальные (10%, СЭ 0,6154—0,7846), круглые (6%, СЭ 0,7846—1,0). Среди овальных клеток выделяются два пика: А и В (0,3 и 5%), а среди круглых клеток — пик С (2%) (рис. 1, а). Клетки пика 1, созревая, переходят в переходные клетки и в свою ак-
T. M. Yavisheva, A. S. Yagubov, I. S. Golubeva,
I. Yu. Kubasova
QUANTITATIVE MORPHOLOGY
OF MOUSE EYE EPITHELIUM DURING
CHEMOTHERAPY
Detartment of Molecular-Biological and Radioisotopic Methods of Investigation, Research Institute of Experimental Diagnostics and Therapy of Tumors
Basing on the complex analysis of histograms of cell distribution with respect to a variety of parameters we have developed a scheme for study of morphofunc-tional peculiarities of epithelial basal cells at various stages of the epithelial life [4,5].
We attempted to apply this methodology to study morphofunctional features of mouse eye epithelium under the action of a chemotherapeutical dactinomycin inducing regression of tumors of various sites on corneal epithelium. Chemotherapeuticals’ effect on tumor tissue is not selective enough. Rapidly proliferating tumor tissue is supposed to suffer a greater damage under the action of antitumor drugs than normal tissue. However, some normal tissues demonstrate rather rapid proliferation too, and it is in these tissues that the antitumor effects are most marked. First of all they include brain, spleen, mucosa of various organs, etc. [1].
Materials and Methods. Dactinomycin antitumor activity was studied on BALB/cj mice bearing a murine plasmocytoma MOPC-406 strain transplanted according to the method adopted at CRC RAMS [2,3].
Suspension of triturated abdominal tumor nodes located along the mesentery diluted in medium 199 at 1 g tumor tissue per 10 ml medium was transplanted intraperitoneally to 8 mice (16 eyes) at 0.5 ml suspension per mouse. Treatment was started at 48 hours following transplantation. Transplantation duration was 14 days. The treatment with dactinomycin was given at 0.04 mg/kg mouse body weight intraperitoneally daily for 5 days to 5 mice (10 eyes). 3 mice (6 eyes) were control and received no treatment.
The stydy was performed on plane specimens treated with caustic silver using a Kontron image analyzer.
The cornea analisis was based on cell distribution histograms with respect to cell ellipticity degree (ED) and involved the standard criterion of drug antitumor activity, tumor growth inhibition, expressed as percentage of control volume (%TGI) with minimal effecitivty 50%.
Results and Discussion. We discovered previously [4,5] predominance (20-30%) of cells with ED 0.5774 (peak 1 cells) in the population of basal cells of mouse eye epithelium. Review of histograms distinguishes series of cells with specific ED, such as narrow (10%, ED 0.1077-0.2615), oblong (16%, ED 0.2615-0.4154), transitional (16%, ED 0.4154-0.5692), oval (10%, ED 0.6154-0.7846), round (6%, ED 0.7846-1.0). There are two peaks, A and B (0.3 and 5%>), among the oval cells, and the peak C (2%) among the round cells (fig. 1, a). The peak 1 cells become mature to change into transitional and active cells that undergo mitosis. These are oblong cells. In the process of proliferation a part of the oblong cells mature to become more differentiated narrow cells, while the others fail to mature and are pushed out to the upper layers where they undergo fission.
The oblong cells are characterized by synchronization, i.e. 5% of the oblong cells after reaching 30%)
Experimental Investigations
тивную форму, которая непосредственно вступает в митоз — это вытянутые клетки. При пролиферации часть вытянутых клеток проходит стадию созревания, в результате которой получаются более дифференцированные узкие клетки, другая же часть клеток выталкивается из популяции, не созревая, в вышележащие слои, где они вновь делятся.
Вытянутым клеткам свойственна синхронизация, т. е. через определенный промежуток времени 5% вытянутых клеток по достижении ими численности 30% выходит непосредственно в митоз, что влечет за собой повышение пика В на 5%. При этом пролиферация клеток пика В подавляется за счет обратной отрицательной связи. Узкие клетки вследствие пролиферативной активности эпителия выталкиваются в вышележащие слои эпителиальной ткани. После сокращения численности вытянутых клеток до 25% снимается блок клеток пика В, которые вновь начинают пролиферировать.
Переход 5% вытянутых клеток непосредственно в митоз и одновременная элиминация 5% узких клеток происходят лишь в тот момент, когда количество клеток пика В будет равным таковому пику А. Сами же клетки пика В начинают пролиферировать лишь тогда, когда 1/3 их перейдет в клетки пика А.
В настоящей работе гистограммы распределения клеток по СЭ в контроле в основном совпадали с гистограммами нормального эпителия мыши. Мы наблюдали снижение количества клеток пика 1 (СЭ 0,5774) до 8%), увеличение количества переходных клеток (СЭ 0,4154—0,5692) до 24,4% и вытянутых клеток (СЭ
0,2615—0,4154) до 28%. Численность клеток пика В с СЭ 0,7385 составляла 3%, а клеток пика А с СЭ 0,7194 — 2%. Количество овальных клеток (СЭ 0,6154—0,7846) составляло 15%), а круглых клеток — 6%. Численность же клеток пика С была 2%, следовательно, в данном
Рис. 1. Гистограмма распределения клеток по СЭ в эпителии глаза мыши в норме (а) и при лечении дактино-мицином (Ь).
По оси абсцисс — значение СЭ; по оси ординат — количество клеток определенной формы.
1 — клетки пика 1 (СЭ 0,5774).
Fig. 1. Histogram of cell distribution with respect to ED in eye epithelium of normal mice (a) and of mice treated with dactinomycin (b).
Numbers along the x axis show ED; numerals along the у axis show number of cells of particular shape.
1, peak 1 cells (ED 0.5774).
undergo mitosis which leads to a 5% increase in peak B. Peak В cell prolifiration is inhibited due to negative feedback. As a result of epithelial proliferative activity the narrow cells are pushed out to the upper layers of the epithelium. After a reduction in oblong cells to 25% the block of peak В cells is removed, and they start proliferating again.
The transition of 5% of the oblong cells to mitosis and the simultaneous elimination of 5% of the narrow cells occur when the numbers of the peak A and peak В cells are equal. Peak В cells start proliferating only after 1/3 of them changes into peak A cells.
In our study histograms of cell distribution with respect to ED in the control were similar to histograms of mouse normal epithelium. We observed a reduction in peak 1 cells (ED 0.5774) upto 8%, an increase in transitional (ED 0.4154-0.5692) upto 24.4% and in oblong cells (ED 0.2615-0.4154) upto 28%. Peak В cells with ED 0.7385 were 3%, while peak A cells with ED 0.7194) were 2%. Portion of oval cells (ED 0.6154-0.7846) was 15%, and that of round cells was 6%. Since peak С cells were 2%) the transition of a part of the cells to peak С cells (i.e. to prophase) had not taken place yet.
Thus the epithelium demonstrated normal process of development.
Analisis of test histograms showed a large (28%)
случае еще не произошло перехода части вытянутых клеток в клетки пика С, т. е. в профазу.
Таким образом, в эпителии в данном случае не нарушены процессы нормальной жизнедеятельности.
При анализе гистограмм в опыте выявлено, что количество клеток пика 1 — высокое (28%), численность же переходных клеток составляет 12,6%, вытянутых — 20,5% (рис. 1, Ь). Численность клеток пика В, переходящих в свою активную форму А, уменьшается на 30%, что свидетельствует о том, что клетки пика В вышли непосредственно в митоз. Подтверждением этому служит повышение удельного веса овальных и круглых клеток до 13 и 8% соответственно (в норме 10 и 6%), количество которых повышается в процессе пролиферативной активности клеток эпителия. Необходимо отметить, что хотя и происходит переход клеток пика В в клетки пика А, однако этот переход замедлен. Мы наблюдали увеличение количества клеток пика В до 6%, а клеток пика А — до 2% (в норме численность клеток пиков В и А в сумме составляет 5%), т. е. здесь имеет место замедление вступления клеток пика А в митоз, другими словами, удлиняется время клеточного цикла.
Значение клеток пика С составляет, как и в норме, всего 2%, что еще раз подтверждает тот факт, что перехода вытянутых клеток в митоз не происходит.
Таким образом, клетки пика В продолжают пролиферировать, хотя за счет обратной отрицательной связи происходит подавление выхода этих клеток в пролиферацию (высокое количество клеток пика 1 — 28%). Переход же клеток пика 1 в вытянутые клетки отсутствует, т. е. на уровне этих клеток произошел блок за счет эффекта примененного химиопрепарата дак-тиномицина. Надо полагать, что когда количество клеток пика 1 достигнет 30%, пролиферация клеток пика В прекратится совсем. Очевидно, на основе этого принципа отрицательной обратной связи происходит подавление пролиферации опухолевой ткани.
При сравнении со стандартными методами нами обнаружены элементы регрессии опухоли: торможение роста опухоли в процентах по отношению к контролю на 7—10-е сутки составило 84—85% (при минимальном критерии эффективности 50%>), что свидетельствует о высокой противоопухолевой эффективности дактиномицина.
Таким образом, данные, полученные при анализе гистограмм распределения клеток по различным параметрам и в результате общепринятых методов исследования, в основном совпадают, т. е. происходит блок перехода клеток пика 1 в вытянутые клетки, что ведет к подавлению пролиферации клеток пика В по принципу отрицательной обратной связи, приводя в свою очередь к торможению роста опухоли на 84—85%.
Итак, проведенное исследование свидетельствует о том, что мы можем судить об эффективности противоопухолевого воздействия химиопрепаратов на ин-тактные слизистые оболочки или непосредственно на популяцию опухолевой ткани при помощи разработанного нами метода морфофункциональной оценки жизнедеятельности эпителиальной ткани. Это позволит использовать данный метод в сочетании с общеизвестными методами для более эффективного изучения противоопухолевой активности химиопрепаратов как в эксперименте, так и в клинике.
portion of peak 1 cells, with transitional cells being 12.6% and oblong cells reaching 20.5% (fig. 1, b). The number of peak В cells changing into their active form A demonstrates a 30% reduction which proves peak В cells to enter mitosis. This is confirmed by the increase in the oval and round cells to 13 and 8%, respectively (normal 10 and 6%), which occurs during epithelial cell proliferation. Of note that the transition of peak В cells into peak A cells is slow. We observed an increase in the number of peak В cells to 6% and of peak A cells to 2% (normal peak A and В cell total is 5%), which was evidence of a slow down in peak A cell entering mitosis, in other words of greater duration of the cellular cycle.
Peak С cells were 2%>, i.e. similar to the normal level, which proved no transition of the oblong cells into mitosis.
Thus the peak В cells continue proliferating though the cell entering proliferation is inhibited due to the negative feedback (high rate of peak 1 cells - 28%). There is no transition of peak 1 cells into oblong cells,
i.e. there is a block at the level of these cells due to dactinomycin effect. It seems that when the peak 1 cells reach 30%, the peak В cells will stop proliferating. Inhibition of tumor cell proliferation may be based on the negative feedback.
Comparison with standard methods revealed tumor regression elements as follows: percentage of tumor growth inhibition in relation to the control on day 7-10 was 84-85% (the minimal efficiency being 50%), which was evidence of high dactinomycin antitumor activity.
Thus, our findings in analysis of cell distribution histograms correspond to results of standard methods of investigation, i.e. the transition of the peak 1 cells into oblong cells is blocked which leads to inhibition of peak В cell proliferation due to the negative feedback, which in turn causes a 84-85% inhibition of tumor growth.
So, our study demonstrates that conclusion about efficiency of antitumor effect of chemotherapeuticals on intact mucosa or directly on tumor tissue may be drawn on the basis of the morphofunctional analysis of epithelial tissue development. This method may be used in combination with standard methodologies for more accurate evaluation of antitumor activity of chemotherapeuticals both in experiments and in the clinical practice.
ЛИТЕРА ТУРА/REFERENCES
1. Переводчикова H. И. Противоопухолевая химиотерапия. — М., 1986.
2. Софьина 3. П. // Химиотерапия опухолевых заболеваний. — М., 1984.— С. 11—42.
3. Софьина 3. П., Сыркин А. Б. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США. — М., 1980.
4. Явишева Т. М., Хлынина Е. Г. Морфофункциональные особенности клеток базального слоя эпителия роговицы мыши. Деп. в ВИНИТИ, 1994. — 1924-В-94.
5. Явишева Т. М., Хлынина Е. Г. Некоторые механизмы регуляции пролиферации базальных клеток эпителия роговицы мыши. Деп. в ВИНИТИ, 1994. — 1922-В-94.
Поступила 20.10.94 / Submitted 20.10.94
