К вопросу о функциональной активности генома клеток органов и тканей организма-опухоленосителя Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

© И. П. Шабалкин, А. С. Ягубов, 1995 УДК 616.006.04:575.113

И. П. Шабалкин, А. С. Ягубов

К ВОПРОСУ О ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ГЕНОМА КЛЕТОК ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ ОРГАНИЗМА-ОПУХОЛЕНОСИТЕЛЯ

Отдел молекулярно-биологических и радиоизотоп/1ы.х методов исследования

В настоящее время становится все более признанным положение о том, что развитие неопластического процесса в организме сопровождается изменениями функции генов клеток нормальных тканей и органов, что в конечном счете приводит к нарушению гомеостаза организма [5—8]. Настоящая работа посвящена выяснению некоторых аспектов данной проблемы, а именно, изменению функциональной активности генома нормальных клеток в процессе развития опухоли в орга-низме-опухоленосителе.

Для решения поставленной задачи был использован разработанный нами ранее [4] метод оценки функциональной активности генома клеток. Метод основан на цитофотометрическом анализе популяции клеток при окраске ядер клеток, по Фельгену (окраска на ДНК) и нафтоловым желтым Б (окраска на гистоны). Актуальность изучения взаимодействия гистонов и ДНК при изменении функциональной активности генома клетки вытекает из большого количества исследований [1, 9]. Для количественного определения функциональной активности генома клеток введен показатель Кфаген — коэффициент функциональной активности генома клеток, который выведен из отношения величины гис-тон/ДНК после определения оптической плотности ядра, окрашенного по приведенной выше методике. Этот коэффициент дает возможность, с одной стороны, изучить количественный состав популяции клеток, находящихся в состоянии нормальной или измененной (повышенной/пониженной) функциональной активности генома, а с другой — оценить степень дифферен-цировки клеток.

Материалы и методы. Объектом исследования служили мыши, которым перевивали 6—106 опухолевых клеток в объеме 0,2 мл физиологического раствора на мышь. Функциональную активность генома клеток различных органов и тканей организма-опухоленосителя изучали по критерию Кфаген на моделях: лейкоза Ь-1210, перевивной карциномы легкого Льюиса, перевивного рака шейки матки, перевивной аденокарциномы толстой кишки, перевивной саркомы Крокера С-180, саркомы С-298, спонтанной аденокарциномы молочной железы. В качестве контроля использовали интактных мышей соответствующих линий. Материалом для анализа служили мазки-отпечатки костного и головного мозга, печени, почек, тонкой кишки.

Препараты подсушивали на воздухе в течение 1 ч, после чего фиксировали при 4° С в течение 1 ч 10 мин в забуференном 10% нейтральном формалине [2] с последующей их промывкой проточной теплой (37° С, 30 мин) и дистиллированной (10 мин) водой. Прогретые при 37° С препараты гидролизовали в течение 20 мин в 5 н.НС1 при 37° С, затем споласкивали в холодной 1 Н.НС1 и дистиллированной воде, после чего переносили на 2 ч 10 мин в заранее прогретый до комнатной температуры раствор реактива Шиффа pH 2,7 [2]. Окрашенные препараты трижды по 10 мин промывали в сернистых водах. Далее следовала промывка теплой водопроводной (20 мин) и дистиллированной (10 мин) водой. Подсушенные препараты в течение 45 мин окрашивали 0,1% раствором нафтолового

I. P. Shabalkin, A. S. Yagubov

TO THE PROBLEM OF FUNCTIONAL ACTIVITY OF CELL GENOME OF TUMOR-BEARERS’ ORGANS AND TISSUES

Department of Molecular Biological and Radioisotopic Investigations

The idea that neoplastic development in the body is accompanied by change in functioning of genes of normal tissues and organs becomes commonly admitted at present [5-8]. This investigation considers some aspects of the problem, namely the way of genome activity changing in normal cells under the effect of tumor development in tumor-bearers.

In order to investigate this problem we used a method for evaluation of cell genome functional activity developed previously by the authors [4]. The method is based on cytophotometry of cell populations involving cell nucleus staining according to Felgen (DNA staining) and using naphthol yellow S (histone staining). Our study of interaction of histones and DNA in the process of changing cell genome functional activity was prompted by numerous publications on this problem including [1,9]. In order to quantify cell genome functional activity we introduced Kfagen, coefficient of cell genome functional activity, calculated by the histone/DNA ratio after measurement of optical density of nuclei stained according to the techniques mentioned above. This coefficient allowed, on the one hand, quantification of cell populations with normal or changed (increased/decreased) genome functional activity and, on the other hand, evaluation of degree of cell differentiation.

Materials and Methods. The study was performed in mice implanted with 6-106 tumor cells in 0.2 ml saline solution per mouse. Cell genome functional activity of tumor-bearer’s organs and tissues was studied using the Kfagen criterion on the following models: leukemia L-1210, transplantable Lewis lung carcinoma, transplantable uterine cervical carcinoma, transplantable colonic adenocarcinoma, transplantable Crocker sarcoma C-180, sarcoma C-298, spontaneous mammary adenocarcinoma. Intact mice of the same lines were used as control. Analysis was made on touch-smears of bone marrow, brain, liver, kidneys, small intestine.

The samples were air dried for 1 h, then fixed at 4°C for 1 h 10 min in buffered 10% neutral formalin [2] and washed in warm (37°C, 30 min) and distilled (10 min) running water. The samples preheated at 37°C were then hydrolyzed for 20 min in 5N HC1 at 37°C to be rinsed in cold IN HC1 and distilled water, then transferred to Schiff reagent solution pH 2.7 preheated to room temperature to stay for 2 h 10 min [2]. The stained samples were washed three times (10 min each) in sulphuric water. Then they were washed in warm tap (20 min) and distilled (10 min) water. The samples were then dried for 45 min and stained with 0.1% naphthol yellow S solution (pH 2.8). The stained samples were washed three times (1 min each) in tertiary butyl alcohol (2-methylpropanol-2) preheated to 26°C. The washed samples were then dried for 24 h in dry air oven at 37°C.

One hundred cells of an organ/tissue from test and control animals were analyzed in each experiment. Quantification of results was made by measuring cell nuclear optical density at 575 nm for Felgen stained cells and at 445 nm for naphthol yellow S-stained cells using a Univar (Austria) mass spectrophotometer. Analysis of variances was performed by Student test at p=0.05.

Cell distribution histograms with respect to Kfagen were constructed basing on the results obtained. To evaluate deviation of test from

Таблица 1

Влияние опухоли на изменение величины Кфагвн в клетках организма-опухоленосителя (р < 0,05) Tumor effect on Kfagen value in tumor-bearer’s cells (p < 0.05)

Table 1

Вид новообразования

Орган/ткань организма

головной мозг (кора больших полушарий)

почка (корковый слой)

тонкая кишка (каемчатый эпителий)

костный мозг

Перевивная карцинома легкого Льюиса

Transplantable Lewis lung carcinoma контроль/control опыт/test С

Перевивной лейкоз L-1210 Transplantable leukemia L-1210 контроль/control опыт/test С

Перевивной рак шейки матки (5) Transplantable uterine cervical carcinoma контроль/control олыт/test С

Перевивная аденокарцинома толстой кишки

Transplantable colonic adenocarcinoma контроль/control опыт/test С

Спонтанная аденокарцинома молочной железы

Spontaneous mammary adenocarcinoma контроль/control опыт/test С

Перевивная саркома Крокера С-180 Transplantable Crocker sarcoma С-180 контроль/control опыт/test С

Перевивная саркома С-298 Transplantable sarcoma С-298 контроль/control опыт/test С

1,81 (1,70 2,18 (2,01 33

1,69 (1,49 1,90 (1,77 30*

1,69 (1,59 1,63 (1,54 29*

1,69 (1,60 2,16 (2,04 40

1,79 (1,67 1,96 (1,83 29*

1,97 (1,85 2,42 (2,22 39

1,64 (1,51 2,29 (2,15 51

1,92)

2,35)

1,89)

2,07)

1,79)

1,72)

1,78)

2,28)

1,91)

2,09)

2,09)

2,62)

1,77)

2,43)

1,08 (1,04 + 1,12) 1,76 (1,62 1,90)

71

1,42 (1,36 - 1.48) 1,74 (1,66 + 1,82) 35

1,38 (1,33 + 1,43) 1,60 (1,55 + 1,65) 54

1,03 (0,99 + 1,07) 1,76 (1,63 + 1,89) 73

1,30 (1,22 - 1,38) 1,52 (1,46 - 1,58) 56

1,62 (1,53 4 1,71) 1,29 (1,22 - 1,36) 42

1,36 (1,30 - 1,42) 1,40 (1,33 4 1,47) 25*

1,22 (1,15 1,54 (1,46 45

1,29)

1,62)

1,17 (1,12 + 1,22) 1,49 (1,41 + 1,57) 48

1,32 (1,23 + 1,41) 1,71 (1,61 + 1,81) 39

1,52 (1,40 + 1,64) 1,47 (1,38 + 1,56) 22*

1,44 (1,36 4 1,52) 1,74 (1,64 4 1,84) 47

1,71 (1,60 4 1,82) 1,51 (1,41 4 1,61) 33

1,62 (1,54- 1,70) 1,40 (1,34 4 1,46) 39

1,22 (1,15 + 1,29) 1,39 (1,31 + 1,47) 35

0,91 (0,88 + 0,94) 1,21 (1,17 + 1,25) 69

0,90 (0,87 + 0,93) 1,16 (1,10 + 1,22) 57

1,01 (0,97 - 1,05) 1,21 (1,16 1,26) 64

1,15 (1,10 - 1,20) 1,20 (1,14 ч- 1,26) 14*

0,99 (0,95 4 1,03) 1,01 (0,96 4 1,06) 15*

1.25 (1,20 4 1,30)

1.25 (1,19 4 1,31) 25*

1,29

2,03

85

1,42

1,45

23*

1,27

1,55

51

1,33

1,64

41

1,39

1,70

65

1,68

1,29

52

1.33

1.34 29*

1,24

1,93

1,36

1,38

1,24

1,46

1,34)

2,13)

1,49)

1,52)

1,30)

1,64)

1,27 1,39)

1,56 ч- 1,72)

1,35 ч- 1,43) 1,64 4- 1,76)

1,60

1,20

1,74)

1,38)

1.28 4- 1,38)

1.29 4- 1,39)

Tumor type

brain (cerebral hemisphere cortex)

kidney (cortex)

small intestine (ciliated epithelium)

bone marrow

liver

Organ/tissue

Примечание. С — степень отклонения значений опыта от контроля (в %); звездочка — различие статистически недостоверно (р< 0,05). Note. С, divergence of test and control values (%); asterisk, the difference is not statistically significant at p< 0.05.

желтого S (pH 2,8). Окрашенные препараты трижды по 1 мин промывали в третичном бутиловом спирте (2-метилпропанол-2), предварительно прогретом до 26° С. Промытые препараты высушивали в течение 1 сут в суховоздушном термостате при 37° С.

В каждом из экспериментов анализировали по 100 клеток органа/ткани в опыте и контроле соответственно. Количественную оценку результатов получали путем определения оптической плотности ядра клетки при окраске по Фельгену при А = 575 нм, при окраске нафтоловым желтым S при А = 445 нм на микроспектрофотометре «Univar» (Австрия). Все полученные данные обрабатывали методом вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента при р = 0,05.

На основе полученных данных строили гистограммы распределения клеток в зависимости от значений Кфаген. Для оценки степени отклонения значений опыта от контроля предложен показатель С, выраженный в процентах. Данный показатель определяют по разности между площадью гистограммы опыта и той частью площади

control values we used characteristic C defined as the difference between test histogram area and the part of control histogram area coinciding with the test histogram area with equal number of cells analyzed (see the figure) and expressed as percentage. Since histogram area is the sum of areas of rectangles having one equal side for test and control (the same step size on the axis taken as unity) actual divergence of test and control values may be determined as the number of test cells having Kfagen different from control and the number of test cells exceeding the number of control cells with the same Kfagen-

As an example consider histograms of distribution of liver cells from intact and tumor-bearing mice (see the figure). The first difference in the histograms is that only 48 of 100 cells from transplantable Crocker sarcoma-bearing mice have Kfagen values coinciding with those of intact mice. So, C is 52%. The second incompliance is associated with different number of cells in each rank of the test and control histograms. Comparison of these histograms shows the rank of cells which undergo changes under the effect of some factor.

гистограммы контроля, которая совпадает с площадью гистограммы опыта при одинаковом количестве проанализированных клеток (рис. I). Так как площадь гистограммы оценивается как сумма площадей прямоугольников, одна из сторон которых одинакова для опыта и контроля (один и тот же размер шага на оси абсцисс координат гистограммы, условно принятый за единицу), то фактическая степень отклонения опыта от контроля сводится: к оценке количества клеток опыта, величина Кфаген которых не имеет аналогичных значений в контроле; определению числа клеток опыта с конкретной величиной Кфаген, превышающей число клеток контроля с такими же значениями Кфаген.

В качестве примера рассмотрим гистограммы распределения клеток печени интактного животного и животного-опухоленосителя (см. рис. 1). Первое различие между гистограммами заключается в том, что из 100 проанализированных клеток печени мыши с перевивной саркомой Крокера только 48 клеток имеют значения Кфаген, совпадающие со значениями Кфаген клеток печени интактного животного. Отсюда показатель С равен 52%. Второе различие связано с разным количеством клеток, приходящихся на каждый разряд гистограммы опыта и контроля. Сравнительная оценка этих гистограмм позволяет ответить на вопрос: в клетках какого разряда происходят изменения под действием того или иного фактора.

Результаты и обсуждение. Как видно из табл. 1, одни типы опухолей имеют широкий спектр действия на организм-опухоленоситель, влияние других менее выражено. Так, после перевивки карциномы легкого Льюиса в клетках всех изученных органов/тканей мышей наблюдается достоверно значимое увеличение значений Кфаген, что указывает на повышение в них степени дифференцировки при наличии опухоли в организме. В то же время при перевивной саркоме С-298 степень дифференцировки повышается только лишь в головном мозге. Интересно, что при данной опухоли в эпителии тонкой кишки выявляется статистически достоверное уменьшение среднего значения Кфаген по сравнению с интактными животными. Отмеченный факт еще более ярко выражен в органах мышей после перевивки саркомы Крокера С-180, когда уменьшение величины Кфаге„ наблюдали в клетках тонкой кишки, печени и почек. Следует подчеркнуть, что в большинстве наших экспериментов наряду с достоверно значимыми изменениями среднего значения КфаГе„, свойственными тем или иным органам/тканям животных-опухолено-сителей, нередко величина Кфаге„ не отличалась от значения такового органов/тканей контрольных животных. Это говорит о том, что в данном случае рост опухоли не оказывает существенного влияния на функциональную активность генома клеточной популяции того или иного органа/ткани. Так, средняя величина Кфага, не изменялась при лимфолейкозе Ь-1210 в популяции клеток печени, головного мозга, при перевивном раке шейки матки — головного мозга, при перевивной аденокарциноме толстой кишки — тонкой кишки, при спонтанном раке молочной железы — головного и костного мозга, при саркоме Крокера — костного мозга, при саркоме 298 — печени, почек и костного мозга. Разнонаправленное влияние опухоли на организм-опухоленоситель обусловлено, по-видимому, изменением генной активности в клетках тканей орга-низма-хозяина. Так, по данным В. П. Шелепова и соавт. [7], исследовавших характер экспрессии некоторых генов в тканях крыс с перевивными гепатомами Г-27 и Зайделя, значительное увеличение экспрессии генома по тесту актинового гена наблюдается в печени, умеренное — в головном мозге, отсутствие изменений----------

А'

о о

о о

о о о

о о о

о о о

о о о

ООО * о *000**00 «000**00 *«009*00 **00**00 ******ФвОО*ФвО о ********в*»«*оооо *******99*99*0*00

****************09 *

Q I I I I I I--1-1--1-1--1-1-

0,5 0,7 0,9 1,1 1,3 1,5 1,7 1,9 2,1 2,3 2,5 2,7

Рис. 1. Гистограммы распределения клеток печени у мышей в зависимости от изменения величины Кфагек.

По оси абсцисс — значения показателя Кфаген; по оси ординат — частота обнаружения клеток с определенным значением Кфаген. Кружок — печень интактного животного, крестик — печень животного с перевивной саркомой Крокера.

Fig. 1. Histograms of mouse liver cell distribution with respect to variation of Kfagen.

Numbers on the x axis show K(agen values; numbers on the у axis show frequency of cells with a particular Kfagen value. Circles designate intact mouse liver, crosses designate liver of mice with transplanted Crocker sarcoma.

Results and Discussion. The table shows that some tumor types exert a broad range of actions on the bearer’s body while the effect of others is less pronounced. For instance, transplantation of Lewis lung carcinoma resulted in a significant increase in Kfagen in all organs/tissues of the mice which suggested a rise in degree of cell differentiation in tumor-bearing animals. While transplantation of sarcoma C-298 led to increase in differentiation in brain cells only. Of interest that colonic epithelium of animals bearing this tumor demonstrated a statistically significant reduction in average Kfagen values as compared to intact mice. This phenomenon is still more expressed in mice undergoing transplantation of Crocker sarcoma C-180 when Kfagen was decreased in cells from small intestine, liver and kidneys. It should be noted that in parallel with statistically significant change in average Kfagen values under the effect of some tumors it often happened that Kfagen values in some tumor-bearers’ organ/tissues were the same as in intact mice. This shows that tumor development had no considerable effect on functional activity of cell population genome of some organs and tissues. For instance, there were no changes in Kfagen average values in cell populations from the liver and brain under the effect of leukemia L-1210, in brain under the effect of transplantable uterine cervical carcinoma, in small intestine of colonic adenocarcinoma-bearers, in brain and bone marrow under the action of spontaneous mammary carcinoma, in bone marrow of animals with Crocker sarcoma, in the liver, kidneys and bone marrow under the effect of sarcoma 298. The variety of tumor effects

15

10

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *

в почках; по тесту гена теплового шока (белок hsp 70) в головном мозге — подавление, в печени — повышение экспрессии гена, а в почках даже появление новых транскриптов.

Изменение экспрессии генов под влиянием растущей в организме опухоли, по мнению ряда авторов [6, 8], вызывает деспециализацию тканей организма-опухолено-сителя, перенапряжение его физиологических систем, что чревато разнообразными расстройствами гомеостаза.

Среди других полученных нами данных обращает на себя внимание одно обстоятельство: различие по Кфаге„ между органом/тканью интактного животного и тем же органом/тканью животного-опухоленосителя статистически достоверно, если показатель С равен или превышает 33% (см. табл. 1). Причина этого явления в том, что при наличии опухоли, как уже было сказано, изменяется функциональная активность генома клеток органа/ткани организма-опухоленосителя. Однако отмеченные изменения не будут оказывать существенного влияния на орган в процессе выполнения им определенной специфической функции до тех пор, пока количество функционально измененных клеток в органе не достигнет определенной предельной величины. По нашим данным [3], эта критическая точка соответствует 1/3 клеток популяции, отклоняющихся от нормы. Нами [3] показано, что у детей, больных острым лимфобластным лейкозом, но находящихся в момент обследования в ремиссии, наступлению рецидива предшествуют изменения в качественном составе популяции клеток костного мозга. За несколько месяцев до клинического проявления рецидива в популяции клеток костного мозга больного число клеток, отклоняющихся от нормы по критерию Кфаген (показатель С), превышает 33%. Причем если показатель С был меньше 33%, больной находился в ремиссии.

Эти наблюдения позволяют высказать предположение, что популяция клеток органа/ткани переходит в качественно новое состояние, когда изменяется не менее 1/3 входящих в нее клеток. Если считать, что популяция представляет собой систему, состоящую из сообщества клеток, а организм — совокупность данных систем, то, опираясь на экспериментальные данные, можно прийти к заключению, что любая система должна переходить в качественно новое состояние в том случае, если качественно изменяется не менее 1/3 составляющих ее элементов.

Таким образом, из анализа экспериментальных данных следует, что опухоль изменяет характер функционирования органа/ткани организма-опухоленосителя в том случае, если при наличии опухоли не менее 1/3 популяции клеток органа/ткани переходит в качественно новое состояние.

ЛИТЕРА ТУРА/REFERENCES

1. Бакаев В. В., Бакаева Т. Г., Доманский Н. Н. // Молекул, биол. —1981,—Т. 15.—С. 824—834.

2. Пирс Э. Гистохимия. — М., 1962.

3. Шабалкип И. П., Желудкова О. Г. Использование метода оценки функциональной активности генома клетки в ранней диагностике рецидива острого лимфобластного лейкоза. Деп. ВИНИТИ № Ю13-В94.

on the tumor-bearing body seems to be due to alteration of gene activity in tissue cells of the host. Y.P.Shelepov et al. [V] as well as Zeidel studied expression of some genes in tissues of rats bearing transplanted hepatoma H-27 to demonstrate in active gene test a considerable increase of genome expression in the liver, a moderate increase in the brain, no change in kidneys; in the heat shock test (protein hsp 70): suppression in the brain, increased gene expression in the liver and suppression of new transcriptors in kidneys. In the opinion of some authors [6,8] the change in gene expression under the action of tumor results in tissue despecialization in the bearer’s body, hyperstress in its physiological systems which lead to various homeostasis disorders.

Another interesting finding is that the differences in Kfagen between an organ/tissue of intact mice and the same organ/tissue of tumor-bearers was statistically significant if С was 33% or more (see the table). The reason of this phenomenon is that the presence of a tumor changes cell genome functional activity of tumor-bearers. However, the resultant changes do not produce any considerable effect on an organ as concerns its specific functioning until the number of cells undergoing functional changes in this organ reaches a certain limit value. According to our findings [3] this critical amount of abnormal cells is 1/3 of cell population. We showed previously [3] that children with acute lymphoblastic leukemia who were in remission at examination demonstrated changes in qualitative profile of bone marrow cells before relapse. Several months before clinical relapse the proportion of Kfagen abnormal bone marrow cells (C) in these patients exceeded 33%. Of note that the patients were in remission while С was less than 33%. These observations suggest that cell populations of certain organs/tissues come into a qualitatively new state when 33% or more of their cells are changed. Assuming that a cell population is a system consisting of cell associations and a body is an integrity of these systems, and basing on experimental findings one may come to the conclusion that any system must come to a qualitatively new state if not less than 1/3 of its elements undergo qualitative change.

Thus, analysis of experimental data shows that tumors change the functioning of an organ/tissue of a tumor-bearer if not less than 1/3 of cells of the organ/tissue come into a qualitatively new state.

4. Шабалкип И. П., Мамонтов С. Г. Гистохимический метод оценки функциональной активности генома клетки. Деп. ВИНИТИ № 3134-В93.

5. Шабалкип И. П. Механизмы возникновения и развития патологических процессов в высшем организме. Деп. ВИНИТИ № 1012-В94.

6. Шапот В. С., Шелепов В. П. // Бюл. экспер. биол. — 1983. — № 8. — С. 3—12.

7. Шелепов В. П., Моисеев В. Л., Чекулаев В. А. и др. // Цитология. — 1988. — № 9. — С. 1152.

8. Шелепов В. П., Моисеев В. Л., Забойкип М. М. и др. // Бюл. экспер. биол. — 1989.—№ 7. — С. 81—83.

9. Шестопалов Б. В. // Молекул, биол. — 1988. — Т. 22.— С. 331—337.

Поступила 22.03.95 / Submitted 22.03.95