CC BY
38
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
EXPERIMENTAL INVESTIGATIONS
© Коллектив авторов, 1999 УДК 616.006.04-007
В. И. Минаев, И. П. Шабалкип, А. С. Ягу бое
ДИНАМИКА ИЗМЕНЕНИЯ УРОВНЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ГЕНОМА КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА И СЕЛЕЗЕНКИ В ПРОЦЕССЕ РОСТА И РАЗВИТИЯ ПЕРЕВИВАЕМОГО ЛИМФОИДНОГО ЛЕЙКОЗА Ь-1210
Лаборатория молекулярно-биологических методов исследования
Известно, что распространение лейкемического процесса, прогноз заболевания и ответ на терапию во многом зависят от характера нарушений процессов взаимодействия кроветворной и иммунной систем организма. Снижение функции «иммунного надзора», изменение пула нормального кроветворения — симптомы, связанные с самыми частыми проявлениями лейкозов. В основе данных процессов лежит, как правило, изменение функционального состояния генома как опухолевых клеток, так и клеток органов и тканей организма-опухоленосителя под влиянием различных регуляторных факторов [4]. При этом следует отметить, что основной акцент в проблеме изучения взаимоотношений между организмом и опухолью был сделан на решение проблемы методами молекулярной биологии. Однако последние работы [5—13] показали, что для изучения данной проблемы применимы и методы морфологии, в частности гистохимии. Установлено [12], что величина отношения гистон/ДНК после окраски ядра клетки по Фельгену (окраска на ДНК) и нафтоловым желтым Б (окраска на гистоны) характеризует изменение функционального состояния генома клетки. С помощью данного показателя, названного коэффициентом функциональной активности генома клетки (Кфаген), было обнаружено [5, 7, 8, 10, 13], что любая изучаемая популяция клеток (опыт) переходит в качественно новое состояние, если изменяется функциональная активность генома не менее чем у 1/3 ее клеток относительно нормы или предыдущего ее состояния (контроль).
V.I.Minayev, I.P.Shabalkin, A.S.Yagubov
CHANGES IN FUNCTIONAL ACTIVITY OF BONE MARROW AND SPLEEN CELL GENOME DURING GROWTH AND DEVELOPMENT OF TRANSPLANTED LYMPHOID LEUKEMIA L-1210
Laboratory for Molecular Biological Study Methods
Leukemia course, prognosis and response to therapy depend to a high degree upon impairment of the interaction between the hemopoietic and immune systems of the body. Decreased immunity surveillance and changes in the normal hemopoiesis pool are common signs of leukemia. These events as a rule result from changes in functioning of cell genomes of the tumor and other organs and tissues of the tumor-bearing body under the effects of a variety of regulatory factors [4]. It should be noted that the study of interactions of the body and tumor was previously performed mainly basing on molecular biological methods. However, recent reports 15-13] demonstrate that morphological, particularly his-tochemical techniques are also useful tools in this study. It has been demonstrated [12] that the ratio histone/DNA after Feulgen (DNA) and naphthol yellow S (histone) staining characterizes the cell genome functional activity. This characteristic, termed coefficient of cell genome functional activity (Cfagen), was used to show [5,7,8,10,13| that any cell population (test) shifts into a new qualitative state after genome functional activity changes in at least 1 /3 of the cells as compared to the normal or previous state (control). It was also demonstrated [7,11,13] that the tumor affects organs or tissues of the tumor-bearing body if: a) the compared populations (control (test) have identical cells in respect of their genome functional activity; b) percentage of such cells in the test population is at least by 1/3 greater than that in the control population. Modal cells, i.e. cells dominating in the population in question, play a special
Показано [7, 11, 13], что опухоль влияет на органы или ткани организма-опухоленосителя, если: а) в сравниваемых (контроль — опыт) популяциях имеются клетки, идентичные друг другу по уровню функциональной активности их геномов; б) доля таких клеток в изучаемой популяции (опыт) должна превышать не менее чем на 1/3 процентное число клеток контрольной популяции. Особая роль в этих исследованиях отводится модальному, т. е. доминирующему в популяции, классу клеток. При сравнении гистограмм «опыт — контроль» по распределению в них клеток с разными значениями Кфаген было установлено [7, 11], что если в изучаемой популяции доля клеток, идентичных по величине Кфаген клеткам контрольной популяции, превышает процентное число последних не менее чем на 1/3 и группируются они слева от модального класса клеток контрольной популяции, то опухоль вызывает изменение значений Кфаген клеток изучаемой популяции по сравнению с контролем в сторону увеличения их величин, если справа — опухоль оказывает противоположное действие. Представленные данные литературы свидетельствуют, что в исследовании взаимоотношений организма и опухоли, с одной стороны, достигнуты определенные успехи, с другой — что для окончательного решения данной проблемы требуется выяснение еще многих вопросов. Например, на уровне изучения клеточных популяций совершенно неизвестно: влияет ли переход популяции клеток опухоли из одной стадии развития в другую на изменение спектра чувствительности к ней органов и тканей организма, как отвечает в этих условиях организм на агрессию опухоли. С целью выяснения данных вопросов нами проведены исследования по изучению динамики изменения функционального состояния генома клеток костного мозга, селезенки и опухоли в процессе роста и развития перевиваемого лимфоидного лейкоза Ь-1210 мышей.
Материалы и методы. Для решения поставленной задачи использован гистохимический метод оценки функциональной активности генома клеток [12]. Количественное определение функциональной активности генома клетки проводили по критерию Кфаген — величины, выводимой из отношения гистон/ДНК после определения на микроспектрофотометре оптической плотности ядра клетки, окрашенного по Фельгену и нафтоловым желтым 8. Объектом исследования были мыши-самцы линии ОВА, которым перевивали внутри-брюшинно 6 • 106 опухолевых клеток лимфоидного лейкоза И210. В эксперименте использовано 35 животных. Биоматериал брали на 2,4,6-й дни, считая с момента перевивки опухолевых клеток И210. Узкие интервалы между сроками взятия материала обусловлены тем, что лимфоидный лейкоз И210 принадлежит к популяциям с коротким периодом развития. Средняя продолжительность жизни животных с опухолью 9—11 дней [3]. Материалом для анализа служили отпечатки селезенки, а также мазки костного мозга и асцитической жидкости, содержащей опухолевые клетки. Биоматериал брали от животных без перевиваемых опухолей (контроль) и живот-ных-опухоленосителей. Препараты обрабатывали по описанной методике [12]. На основе полученных данных строили гистограммы распределения клеток в зависимости от значений Кфаген. Для оценки степени отклонения исследуемой популяции от стандарта использован показатель С, выраженный в процентах. Следует отметить, что «стандарт» в нашем контексте означает объект, который взят в качестве контроля по отношению к другому объекту
role in this study. Comparison of the test ( control histograms of distribution of cells with different Cfagen values in these populations demonstrated [7,11] that if the percentage of the test cells identical by Cfagen to cells from the control population exceeds the latter by 1 /3 and these cells are located to the left from the modal class of the control population then the tumor induces increase in Cfagen values of the test population as compared to the control, if these cells are situated to the right from the modal class then the tumor produces the opposite effect. The published findings show a significant progress in the study of the body (tumor relationship but there are still many questions to be answered. At the level of cell populations it is unclear whether the tumor cell population-al shift to another stage of development influences the range of sensitivity to the tumor of organs and tissues of the tumor-bearing body, as it is demonstrated for the body response to tumor aggression. To elucidate these questions we studied changes in functional activity of genomes of bone marrow, spleen and tumor cells in the process of growth and development of transplantable lymphoid leukemia L-1210 in mice.
Materials and Methods. The study was performed using the histo-chemical method for evaluation of cell genome functional activity [12]. Measurement of the cell genome functional activity was carried out using a Cfagen criterion. The Cfagen is the histone/DNA ratio as measured by microspectrophotometry of optical density of cell nuclei after Feulgen and naphthol yellow S staining. The study was performed in 35 DBA male mice after intraperitoneal transplantation of 6x106 cells of lymphoid leukemia L-1210. Biological sampling was performed on days 2, 4 and 6 from transplantation. These rather short intervals were chosen because L-1210 is a rapidly developing tumor. Mean life-span of tumor-bearing animals is 9 to 11 days [3]. The analysis was performed on smears of the spleen, bone marrow and ascitic fluid containing tumor cells. The biological specimens were taken from intact (control) and tumor-bearing mice (test). Preparation of the specimens was carried out as described elsewhere [12]. Cell distribution histograms with respect to Cfagen were then drawn. A parameter C was used to assess deviation of the test population from reference standard. It should be noted that the reference standard in this context means an object which is used as control in respect of another object from the same group of comparison. The parameter C is the sum of values Cl which is the difference between the percentage of test cells with a certain Cfagen value and the percentage of standard cells with the same Cfagen within the standard histogram, and C2 which is percentage of test cells with Cfagen values that are not found in the standard. The modal cell class was defined by the following procedure. First we found minimal and maximal Cfagen values of the test and standard. The highest and the lowest Cfagen values were taken as limits for drawing a common histogram including all test and standard Cfagen values. The total number of ranks in the common histogram was divided into three equal parts to have 3 ranks with a greater number of cells in each. Then we found percentage of test and standard cells in each rank. This methodology allows the dominating cell type to be distinguished even in fuzzy histograms. Statistical analysis of the findings was performed using the Student ?-test (/?<0.05).
Results and Discussion. As seen (table 1) the difference in mean Cfagen was not statistically significant in groups 1-3, i.e. the test cell population L-1210 did not shift into another state during its development [7,8,10]. In other words, functional activity of these cells’ genome is the same both during tumor progression and regression. This fact may to a certain extent account for the successful clinical treatment of lymphatic leukemia
Таблица 1 ТаЫе1
Динамика изменения уровня функциональной активности генома клеток нормальной и опухолевой популяций организма в течение роста и развития перевиваемого лимфоидного лейкоза мышей L-1210
Changes in genome functional activity of a normal and a neoplastic cell populations during the growth and development of transplantable lymphatic leukemia L-1210 in mice
№ группы Группа сравнения Показатель Процентное число клеток опыта, превышающее число клеток стандарта в пределах его гистограммы и расположенных от модального класса клеток стандарта
Кфаген C, % c„% слева справа
1 Клетки L-1210 (2 дня) — клетки L-1210, использованные для перевивки L-1210 cells (2 days) - L-1210 cells (transplanted) 1,12(1,08—1,16) 1,17(1,10—1,24) 13
2 Клетки L-1210 (2 дня) — клетки L-1210 (4 дня) L-1210 cells (2 days) - L-1210 cells (4 days) 1,12(1,08—1,16) 1,08(1,04—1,12) 13
3 Клетки L-1210 (4 дня) — клетки L-1210 (6 дней) L-1210 cells (4 days) - L-1210 cells (6 days) 1,08(1,04—1,12) 1,10(1,07—1,13) 13
4 Клетки L-1210, использованные для перевивки*, — костный мозг (контроль) L-1210 cells (transplanted)* - bone marrow (control) 15 15
5 Клетки L-1210, использованные для перевивки*, — селезенка (контроль) L-1210 cells (transplanted)* - spleen (control) 30 30
6 Костный мозг (контроль) — костный мозг (2 дня) Bone marrow (control) - bone marrow (2 days) 0,90(0,87—0,93) 0,77(0,74—0,80) 36
7 Селезенка (контроль) — селезенка (2 дня) Spleen (control) - spleen (2 days) 0,98(0,95-1,01) 0,91(0,88—0,94) 33
8 Селезенка (2 дня)* — клетки L-1210 (2 дня) Spleen (2 days)* - L-1210 (2 days) 0,91(0,88-0,94) 1,12(1,08—1,16) 49 — 49
9 Клетки L-1210 (2 дня)* — селезенка (2 дня) L-1210 (2 days)* - spleen (2 days) 53 53 —
10 Костный мозг (2 дня)* — селезенка (2 дня) Bone marrow (2 days)* - spleen (2 days) 0,77(0,74—0,80) 0,91(0,88—0,94) 35 — 35
11 Костный мозг (4 дня)* — клетки L-1210 (4 дня) Bone marrow (4 days)* - L-1210 (4 days) 0,80(0,77—0,83) 1,08(1,04—1,12) 67 — 67
12 Клетки L-1210 (4 дня)* — костный мозг (4 дня) L-1210 (4 days)* - bone marrow (4 days) 51 51 —
13 Селезенка (2 дня) — селезенка (4 дня) Spleen (2 days) - spleen (4 days) 0,91(0,88—0,94) 0,99(0,95—1,03) 34
14 Костный мозг (4 дня)* — селезенка (4 дня) Bone marrow (4 days)* - spleen (4 days) 0,80(0,77—0,83) 0,99(0,95-1,03) 63 — 63
15 Селезенка (4 дня)* — костный мозг (4 дня) Spleen (4 days)* - bone marrow (4 days) 63 63 —
16 Костный мозг (6 дней)* — клетки L-1210 (6 дней) Bone marrow (6 days)* - L-1210 (6 days) 0,79(0,75—0,83) 1,10(1,07—1,13) 71 — 71
17 Клетки L-1210 (6 дней)* — костный мозг (6 дней) L-1210 (6 days)* - bone marrow (6 days) 38 38 —
18 Селезенка (6 дней)* — клетки L-1210 (6 дней) Spleen (6 days)* - L-1210 (6 days) 0,97(0,92—1,02) 1,10(1,07—1,13) 48 — 48
19 Клетки L-1210 (6 дней)* — селезенка (6 дней) L-1210 (6 days)* - spleen (6 days) 44 43 1
Cfagen C, % c„% to the left to the right
Group No. Comparison groups Parameters Percentage of test cells exceeding percentage of standard cells within its histogram and situated in respect of the modal cell class
Примечание. * орган или опухоль, взятые в качестве стандарта в группе сравнения. Note. *, an organ or tumor used as a reference standard in comparison groups.
Таблица 2 Table2
Динамика распределения по величине Кфаген клеток популяции перевиваемого лимфоидного лейкоза L-1210 в пределах 1 —3 разрядов его гистограммы
Changes in distribution of transplantable lymphatic leukemia L-1210 cells with respect to their Cfagen within histogram ranks 1 to 3.
Процентное число клеток опухоли в 1—3 разрядах ее гистограммы
Объект изучения Возраст опухоли, дни после пределы значений Кфаген, приходящиеся на каждый разряд
перевивки О т СО О 1,1-1,3 1,4-1,6
№ разряда
1 2 3
Клетки L-1210, использованные для перевивки/ Transplanted L-1210 cells - 29 57 14
Клетки L-1210/L-1210 2 35 56 9
Клетки L-1210/L-1210 4 44 47 9
Клетки L-1210/L-1210 6 38 57 5
1 2 3
Tumor аде, rank No.
Object days after 0,8-1,0 1,1-1,3 1,4-1,6
transplantation Cfagen limits within a rank
Percentage of tumor cells in ranks 1 -3 of its histogram
в одной и той же группе сравнения. Показатель С складывается из суммы таких показателей, как С1 — процентное число клеток опыта с конкретной величиной Кфаген, превышающих процентное число клеток стандарта с такими же значениями Кфаген в пределах гистограммы стандарта, и С2 — процентное число клеток опыта, величина Кфаген которых не имеет аналогичных значений у объек-та-стандарта. Модальный класс клеток определяли, используя следующий методический прием. Прежде всего были найдены минимальные и максимальные значения Кфаген гистограмм опыта и стандарта. Выбрав из них самую малую и самую большую величины Кфаген, определяли пределы для построения общей гистограммы, куда входили бы все значения Кфаген клеток опыта и стандарта. Затем суммарное число всех разрядов общей гистограммы разделили на 3 равные части, т. е. на 3 разряда. Увеличив таким способом долю клеток, приходящихся на разряд, определяли процентное число клеток опыта и стандарта, соответствующих каждому разряду. Такой методический прием дает возможность выделить доминирующий в популяции тип клеток даже в гистограммах с «размытым» рисунком. Все данные были обработаны статистически с использованием критерия Стьюдента (р < 0,05).
Результаты и обсуждение. Как видно из полученных данных (табл. 1), в 1—3-й группе сравнения различие по средней величине Кфаген статистически недостоверно, следовательно, изучаемая популяция опухолевых клеток Ь-1210 в процессе своего развития не переходит из одного качественного состояния в другое [7, 8, 10]. Иначе говоря, уровень функциональной активности генома клеток данной популяции как в период прогрессивного роста опухоли, так и в стадии регрессии остается постоянным. Этот факт, по-видимому, в какой-то степени объясняет успешный клинический опыт лечения лимфолейкоза [14, 15]. Дело в том, что современная химиотерапия
[14,15]. The to-day chemotherapy for lymphoblastic leukemia is aimed to inhibit the modal class, i.e. blast cell type dominating in the population in question. Since the modal class of L-1210 population does not change (table 2) during the study period (most cells fall within rank 2 of the tumor histogram) the therapeutic effect on the leukemic cell population is positive in any period of its development [1,2,14]. In spite of the fact that the functional status of L-1210 cell genome is a constant value, the effects of the tumor on organs of the tumor-bearing body are different in individual time intervals. The appearance of tumor cells in the body (see the figure, stage 1) produces a unidirectional effect on the hemo-and lymphopoietic systems, i.e. there is a statistically significant fall of mean Cfagen as compared to the control in the bone marrow and spleen populations (see table 1, groups 6 and 7). This means that the bone marrow and spleen populations shift into a new qualitative state under the action of tumor cells. The C values (36% and 33%) in groups 6 and 7 are another evidence in favor of the shift. As demonstrated previously [5,7,8,10] a population changes into a new quality if C is equal or greater than 33%. Following from these findings the conclusion may be made that one of the first effects of L-1210 on the body is related to the change in functional activity of genome of hemopoietic and immunity surveillance cells. Interestingly, that the bone marrow and spleen have no effect on L-1210 cells during this period of tumor growth (see table 1, groups 4 and 5). As the neoplastic disease
лимфобластного лейкоза направлена на то, чтобы уничтожать модальный класс, т. е. доминирующий в популяции тип бластных клеток. Так как в данном случае в течение всего периода наблюдений модальный класс клеток Ь-1210 (табл. 2) не меняется (большинство клеток приходится на 2-й разряд гистограммы опухоли), то воздействие терапевтических агентов на популяцию лейкозных клеток в любой период их роста должно давать положительный эффект лечения, что и наблюдается в действительности [1,2, 14]. Несмотря на то что функциональное состояние генома клеток опухолевой популяции Ь-1210 есть величина постоянная, влияние опухоли на органы жи-вотного-опухоленосителя в разные периоды ее роста различно. Появление в организме опухолевых клеток (см. схему, этап 1) вызывает однонаправленное их действие на систему гемо- и лимфопоэза: в популяциях костного мозга и селезенки происходит статистически достоверное снижение средней величины Кфаген по сравнению с контролем (см. табл. 1, 6-я и 7-я группы). Это означает, что под влиянием опухолевых клеток наблюдается переход популяций костного мозга и селезенки в качественно новое состояние. На это указывает и величина показателя С в 6-й и 7-й группах сравнения, которая равна 36 и 33% соответственно. Согласно имеющимся данным [5, 7, 8, 10], если показатель С равен или больше 33%, популяция переходит в качественно новое состояние. Исходя из этих данных, можно прийти к заключению, что один из первичных эффектов действия опухолевых клеток Ь-1210 на организм связан с изменением уровня функциональной активности генома кроветворных клеток и клеток «иммунного надзора». Интересно, что в этот период роста опухоли, как можно видеть (см. табл. 1, 4-я и 5-я группы), костный мозг и селезенка не влияют на опухолевые клетки Ь-1210. В ходе развития опухолевого процесса взаимоотношения опухоли с изучаемыми органами приобретают все более сложный характер. Уже на втором этапе своего развития 2-дневные клетки Ь-1210 (см. схему) оказывают влияние на селезенку (см. табл. 1, 8-я группа), вызывая снижение в ее популяции среднего значения Кфаген, что указывает на изменение уровня функциональной активности генома клеток селезенки. Это значит, что качественно изменился состав популяции клеток селезенки: в ее популяции появилось 53% клеток (см. табл. 1, 9-я группа), идентичных по функциональной активности своего генома клеткам Ь-1210. Появление последних способствовало тому, что одновременно с действием на опухолевые клетки Ь-1210 (см. схему) изменившаяся 2-дневная клеточная популяция селезенки оказывает влияние на костный мозг (см. табл. 1, 10-я группа), понижая в его популяции величину Кфаген (см. табл. 1, 6-я группа), т. е. индуцируя появление в костном мозге субпопуляции низкодифференцированных клеток, предположительно являющихся коммитирован-ными клетками-предшественниками гемопоэза [9].
Схема Diagram
Взаимное влияние клеток опухоли, костного мозга и селезенки на разных этапах развития перевиваемого лимфоидного лейкоза L-1210.
Прямая стрелка — влияние объекта, вызывающего повышение значений Кфаген в объекте -мишени; стрелка со штриховкой — влияние объекта, вызывающее понижение значений Кфаген в объекте-мишени.
Reciprocal interactions of the tumor, bone marrow and spleen at different stages of development of the transplantable lymphatic leukemia L-1210.
The straight arrow demonstrates the influence of the object increasing Cfagen values in the target; the hatched arrow shows the influence of the object reducing Cfagen in the target.
Этап
Клетки L-1210, использованные для перевивки L-1210 cells (transplanted)
Костный мозг (контроль) Bone marrow (control)
Селезенка (контроль) Spleen (control)
L-1210 (2 дня) 2 days
Костный мозг (2 дня) Селезенка (2 дня)
Bone marrow (2 days) ^4 Spleen (2 days)
1210 (4 дня) 4 days
Костный мозг (4 дня) Bone marrow (4 days)
Селезенка (4 дня) Spleen (4 days)
L-1210 (6 дней) 6 days
Костный мозг (6 дней) Bone marrow (6 days)
Селезенка (6 дней) Spleen (6 days)
progresses the body ( tumor interaction becomes more complicated. Already at the second stage of the tumor development the 2-day-old L-1210 cells (see the figure) affect the spleen (see table 1, group 8) and induce reduction in mean Cfagen value of the population which reflects the level of functional activity of splenic cell genome. This also means that the splenic cells have underwent a qualitative change, i.e. 53% of splenic cell population (see table 1, group 9) became identical to L-1210 cells by their genome functional activity. After the appearance of these cells the altered 2-day cell population of the spleen influences bone marrow (see table 1, group 10) as well as L-1210 cells (see the figure). This influence results in reduction of mean Cfagen in the bone marrow population (see table 1, group 6), i.e.
Для рассматриваемого нами второго этапа развития опухоли характерно то, что не только опухоль действует на селезенку, но и селезенка оказывает влияние на опухоль (см. табл. 1, 9-я группа). Третий этап развития опухоли Ь-1210 аналогичен предыдущему, но теперь уже объектом атаки опухолевых клеток является костный мозг. Из анализа 11-й группы сравнения можно видеть, что справа от модального класса клеток костного мозга доля опухолевых клеток Ь-1210, идентичных по значениям Кфаген клеткам костного мозга, превышает процентное число клеток последнего на 67%. Это означает, что 4-дневная опухолевая популяция Ь-1210 изменяет функциональное состояние популяции клеток костного мозга в сторону снижения уровня функциональной активности генома его клеток [7, 11]. Это обусловливает, по-видимому, появление в костном мозге субпопуляции низкодифференцированных гемопоэтических кле-ток-предшественников [9]. В ответ клетки костного мозга с изменившейся функциональной характеристикой, по-видимому, начинают синтезировать факторы, которые повышают уровень функциональной активности генома как опухолевых клеток (12-я группа), так и клеток селезенки (15-я группа). Переход под влиянием костного мозга популяции клеток селезенки в качественно новое состояние, надо полагать, способствует активизации ее иммунологической функции. С точки зрения Е. Б. Владимирской и Н. А. Торубаровой [2], особое значение в процессе иммунологической регуляции гемопоэза могут иметь антигены гистосовместимости (НЬА-АВ и НЬА-ОЯ), обнаруженные на гемопоэтических клетках. По мнению авторов, наличие антигенов гистосовместимос-ти на клетках-предшественниках гемопоэза делает возможным их участие в реакциях с иммунокомпе-тентными клетками (лимфоцитами). В свете изложенного весьма интересным является одно наблюдение. Сравнение между собой второго и третьего этапов развития опухоли Ь-1210 (см. рисунок) показало, что если на втором этапе имеет место взаимное разнонаправленное влияние объектов в системе «опухоль — селезенка» (при этом опухоль не действует на костный мозг!), то на третьем этапе наблюдается обратный эффект: опухоль не влияет на селезенку в условиях разнонаправленного взаимодействия объектов системы «опухоль — костный мозг». Этот факт свидетельствует о том, что в процессе развития опухоли Ь-1210 изменяется направление атаки опухолевых клеток на объекты системы « органы кроветворения — лимфоидные органы».
Картина дальнейшего развития опухоли (четвертый этап развития) характеризуется еще большей необычностью действия опухоли (см. рисунок). В этот период наблюдается массированная атака опухолевых клеток как на костный мозг, так и на селезенку (16-я и 18-я группы сравнения), направленная на понижение уровня функциональной активности генома клеток этих органов. В ответ органы вызывают повышение
appearance in the bone marrow of a poorly differentiated cell subpopulation which is probably a population of committed precursors of hemopoietic cells [9]. What is characteristic of stage 2 is that both the tumor acts on the spleen and the spleen acts on the tumor (see table 1, group 9). Stage 3 of L-1210 development is similar to stage 2 except that it is bone marrow which is the tumor target. The share of L-1210 cells identical by Cfagen to bone marrow cells and situated to the right from the bone marrow modal class (see table 1, group 11) is 67% greater than in the bone marrow. This means that the 4-day L-1210 population reduces functional activity of bone marrow cells genome [7,11]. This may account for the appearance of a population of poorly differentiated hemopoietic cell progenitors in the bone marrow [9]. In response the bone marrow cells with the reduced functional activity may start to produce factors which increase functional activity of genomes of both the tumor (group 12) and the spleen (group 15). The shift of the splenic cells into a new quality under the effect of the bone marrow seems to promote activation of the spleen immunological function. E.B.Vladimirskaya and N.A.Torubarova [2] believe the histocompatibility antigens (HLA-AB and HLA-DR) found on hemopoietic cells to play an important part in the immunological regulation of hemopoiesis. The investigators think that the presence of the histocompatibility antigens on hemopoiesis progenitor cells makes possible their reactions with immunocompetent cells (lymphocytes). Consider an interesting phenomenon. Comparison of stages 2 and 3 of L-1210 development (see the figure) shows that there are reciprocal differently directed influences of the objects in the ‘tumor - spleen’ system (mind that the tumor produces no effect on the bone marrow!) while stage 3 demonstrates an opposite effect: the tumor does not influence the spleen while there are differently directed interactions of the objects in the ‘tumor - bone marrow’ system. This finding is evidence of the fact that L-1210 changes the target for its attack from the ‘hemopoietic - lymphoid organs’ system with disease progression.
Further L-1210 development (stage 4) is still more peculiar (see the figure). There is a massive attack of the tumor on both the bone marrow and the spleen (groups 16 and 18) which leads to reduction in cell genome functional activity of these organs. In response these organs induce increase in the tumor cell genome functional activity (groups 17, 18).
Stages 2 to 4 are a sort of competition of organ versus tumor teams in which the most powerful one becomes the winner. In terms of our concept this means that the more the share of tumor cells exceeding percentage of the standard cells within its histogram in the groups ‘organ (standard) - tumor’ and ‘tumor (standard) - organ’ as compared to the similar cell share of an organ the more probable is the tumor effect. Indeed, the L-1210 share (67%) producing effect on the bone marrow in group 11 at stage 3 (see table 1) is greater than the percentage of bone marrow cells (51 %) influencing the tumor in group 12. At stage 4 the share of tumor cells also exceeds the
в опухоли данного показателя функционального состояния популяции (17-я и 18-я группы).
Из сравнительного анализа этапов развития опухоли складывается впечатление, что разнонаправленное взаимодействие в системе (опухоль — орган( представляет собой, образно говоря, игру в перетягивание каната борющимися командами, где побеждает сильнейшая из команд. Применительно к нашим данным это означает, что чем больше в группах сравнения «орган (стандарт) — опухоль», «опухоль (стандарт) — орган» будет доля опухолевых клеток, превышающих процентное число клеток стандарта в пределах его гистограммы, по сравнению с долей таких же клеток органа, тем реальнее возможность проявления эффекта действия опухоли. Действительно, при сравнении 11-й и 12-й групп (см. табл. 1) на третьем этапе развития в 11-й группе доля клеток Ь-1210 (67%), влияющих на костный мозг, оказывается больше процентного числа клеток костного мозга (51%), влияющих на опухоль в 12-й группе. На четвертом этапе развития доля опухолевых клеток точно так же превышает процент клеток органов в сравниваемых группах. Так, в 16-й группе доля опухолевых клеток, идентичных клеткам костного мозга, превышает процентное число последних на 71 %, в то время как в 17-й группе процент клеток костного мозга превышает долю опухолевых клеток всего на 38%, т. е. наблюдается явное количественное преимущество («перетягивание каната») опухолевых клеток, идентичных по Кфаген клеткам костного мозга, над долей клеток костного мозга, идентичных клеткам опухоли, при взаимном влиянии опухоли и костного мозга друг на друга. Сохраняется данное преимущество и при сравнении 18-й и 19-й групп, в которых мишенью для атаки опухолевых клеток служит селезенка. Вместе с тем совершенно по-другому выглядит картина взаимного влияния селезенки и опухоли на втором этапе развития клеток Ь-1210. Здесь (см. табл. 1, 8-я и 9-я группы) наблюдается обратный эффект: в 9-й группе сравнения доля клеток селезенки, идентичных клеткам опухоли, несколько больше (53%) процент клеток Ь-1210 (49%), идентичных по Кфаген клеткам селезенки в 8-й группе. Превышение доли клеток селезенки над долей опухолевых клеток дает возможность селезенке в будущем, т. е. к третьему этапу развития клеток Ь-1210, полностью восстановить популяцию своих клеток до состояния, соответствующего норме. Об этом свидетельствует сравнительный анализ 11-й и 13-й групп. Указанный факт свидетельствует, что противодействие органа клеткам опухоли зависит от того, превышает ли доля клеток органа процентное число клеток опухоли в системе «опухоль — орган». Опираясь на всю совокупность полученных данных, рассмотрим, в чем выражается эффект взаимного влияния друг на друга объектов системы «опухоль — органы гемопоэза и лимфопоэза» на разных этапах развития перевиваемого лимфоидного лейкоза Ь-1210 (см. схему).
percentage of organ cells in the groups compared. For instance, the share of tumor cells (group 16) identical to bone marrow ones is by 71 % greater than the bone marrow percentage, while in group 17 the share of bone marrow cells exceeds the share of tumor cells by 38% only, i.e. the tumor cells win the competition. Comparison of groups 18 and 19 in which the spleen is the target of the tumor attack demonstrates that the winner is the same. However, the situation changes significantly at stage 2 of L-1210 development. There is an opposite effect at this stage (see table 1, groups 8 and 9): the spleen (group 9) has a larger proportion (53%) of cells identical to tumor cells than the portion of L-1210 cells (49%) identical by Cfagen to splenic cells in group 8. The surplus of the splenic cells over the tumor cells will further (by stage 3) ensure complete recovery of splenic cells to the normal status as seen by comparison of groups 11 and 13. This finding suggests that the counteraction of an organ against tumor cells depends upon whether percentage of the organ cells exceeds the percentage of tumor cells in the ‘tumor - organ ’system.
Let us consider the reciprocal effects of objects from the ‘tumor - hemopoiesis and lymphopoiesis organs’ system at different stages of development of the transplantable lymphatic leukemia L-1210 (see the figure).
Stage 1. Within the first 2 days after transplantation L-1210 cells change the genome functional activity of bone marrow and spleen cells. The hemopoietic and lymphopoietic organs have no effect on the L-1210 cells.
Stage 2. At 2 days following transplantation the tumor cells continue their action on the spleen while stop to influence the altered bone marrow cell population. This stage is indicative of immunity dysfunction and already altered hemopoiesis. The body compensation-adapta-tion response is enhancement of splenic effects on the growing tumor and the bone marrow.
Stage 3. On day 4 after transplantation the tumor cells change the target and focus on the bone marrow rather than on the spleen. At these stage the quantity and quality of splenic cells recover to normal. There is a spleen ( bone marrow reciprocal influence. Under the action of the spleen the bone marrow enhances its effect on the tumor and in parallel induces a reverse effect on the spleen seemingly in the feedback manner.
Stage 4. There is a massive attack of the tumor both on the bone marrow and the spleen. Both organs respond to this action.
Thus, there are several phases in the tumor action on the body: a) first the tumor assesses sensitivity of hemo-and lymphopoietic organs to L-1210 cells; b) on discovering that bone marrow and spleen cell populations react to the tumor action in a similar way, L-1210 tries to find the most prone organ in the hemo- and lymphopoiesis system and attacks the spleen; c) as the spleen appears resistant to L-1210 the tumor tries to find another prone organ in the hemo- and lymphopoiesis system and attacks the bone marrow; d) L-1210 launches a massive attack on both the spleen and bone marrow.
Первый этап. В течение первых 2 сут после перевивки опухолевые клетки Ь-1210 изменяют функциональное состояние генома клеток как костного мозга, так и селезенки. Органы гемо- и лимфопоэза не оказывают влияния на клетки Ь-1210.
Второй этап. Через 2 сут после перевивки опухолевые клетки продолжают оказывать аналогичное предыдущему действие на селезенку, в то же время не влияя на ранее измененную популяцию клеток костного мозга. Таким образом, на данном этапе наблюдается дисфункция иммунной системы при уже измененном гемопоэзе. Результатом ответной компенсаторно-при-способительной реакции организма является то, что в селезенке активизируются процессы, влияющие как на растущую опухоль, так и на костный мозг.
Третий этап. На 4-е сутки после перевивки опухолевые клетки изменяют направление атаки на объекты системы «кроветворные — лимфоидные органы(, воздействуя теперь не на селезенку, а на костный мозг. На данном этапе количественно-качественный состав селезенки восстанавливается до нормы. Наблюдается взаимное влияние селезенки и костного мозга друг на друга. Под влиянием селезенки в костном мозге происходит активизация процессов, оказывающих влияние на опухоль; в свою очередь активизированные клетки костного мозга, по-видимому, в соответствии с механизмом обратной связи индуцируют в селезенке обратный эффект.
Четвертый этап. Данный этап развития опухоли характеризуется массированной атакой опухолевых клеток как на костный мозг, так и на селезенку. Оба органа в свою очередь действуют на опухоль.
Таким образом, тактика и стратегия действия опухоли включает в себя несколько фаз: а) первоначально опухолью оценивается чувствительность органов гемо-и лимфопоэза к клеткам Ь-1210; б) установив, что первая реакция популяций клеток костного мозга и селезенки на действие опухолевых клеток одинакова, клетки Ь-1210 ставят перед собой задачу поиска наиболее чувствительного к опухолевым клеткам органа системы гемо- и лимфопоэза, для чего атакуется орган иммунной системы — селезенка; в) обнаружив резистентность селезенки к действию клеток Ь-1210, опухолевые клетки ищут более слабое место в системе гемо- и лимфопоэза; таким объектом оказывается костный мозг; г) заканчивается агрессия опухоли массированной атакой клеток Ь-1210 на оба органа гемо- и лимфопоэза.
The tumor effect depends upon the surplus of tumor cells in the ‘organ (standard) ( tumor’ system over the share of organ cells in the ‘tumor (standard) - organ’ system: the greater the surplus the more real the tumor aggression.
При этом эффективность действия опухоли на орган зависит от того, насколько процентное число опухолевых клеток в группе сравнения «орган (стандарт) — опухоль» будет больше доли клеток органа в группе сравнения «опухоль (стандарт) — орган»: чем больше разница, тем реальнее агрессия опухоли.
ЛИТЕРА ТУРА / REFERENCES
1. Баидун Л. В. //Гемат. и трансфузиол. — 1996. — № 4. — С. 35-40.
2. Владимирская Е. Б., Торубарпва Я. А. Острые лейкозы и гипоплазии кроветворения у детей. — М., 1985.
3. Козлов А. М., Софьина 3. П. //Бюл. экспер. биол. — 1978. — № 2. - С. 715-717.
4. Пальцев М. А., Иванов А. А. Межклеточные взаимодействия. — М., 1995.
5. Шабалкин И. П., Ягубов А. С. //Вестн. ОНЦ РАМН. —
1995. -№ 4. — С. 14-17.
6. Шабалкин И. П. //Вопр. онкол. — 1996. — № 6. —
С. 86-90.
7. Шабалкин И. П. Динамика функционального состояния клеточных популяций в процессах раннего эмбриогенеза, нормального и опухолевого роста: Дис.... д-ра биол. наук.
- М., 1997.
8. Шабалкин И. П., Мамонтов С. Г. //Вестн. РГМУ. — 1997.
— № 1. — С. 56-62.
9. Шабалкин И. П. //Докл. АН РФ. - 1997. - Т. 357, № 4. -С. 561-564.
10. Шабалкин И. П., Ягубов А. С., Минаев В. И. //Вестн. ОНЦ РАМН. - 1997. — № 1. — С. 3-4.
11. Шабалкин И. П. //Вопр. онкол. — 1997. — № 6. —
С. 632-638.
12. Шабалкин И. П. //Цитология. — 1998. — Т. 40, № 1. —
С. 107-116.
13. Шабалкин И. П., Ягубов А. С. //Докл. АН РФ. — 1998. —
Т. 362, №3. - С. 1-6.
14. Bacigalupo А. еtal.//J. Immunol.— 1980. — Vol. 125,
N4.-P. 1449-1452.
15. Baum E. et al. //Med. Pediatr. oncol. — 1983. — N 11,—
P. 1 —7.
Поступила 25.02.99/ Submitted 25.02.99
