CC BY
64
БИОЛОГИЯ
УДК 598.13:591.436:591.543
Е. И. Антонова
МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ УЛЬТРАСТРУКТУРНЫХ ПРОЯВЛЕНИЙ РЕПАРАТИВНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ В ПЕЧЕНИ ЧЕРЕПАХ ВИДА TRACHEMYS SCRIPTA ELEGANS ПОСЛЕ ДЕЙСТВИЯ ГИПЕРТЕРМИИ
Через час после однократного перегревания наряду с мозаичными процессами деструкции - нарушение структуры митохондрий гепатоцитов, развертывание программ гибели (апоп-тоз, аутофагия) - проявляются репаративные процессы срочной реализации: активация функциональной активности ядрышка, частичной конденсации хроматина, активация синтетической деятельности живых гепатоцитов.
After one-hour unitary overheating alongside with mosaic processes of destruction - infringement of structure of hepatocyte's mitochondrion, expansion of programs of destruction (apoptosis, auto-phagia) reparative processes of urgent realization emerge - activation of amplification of functional activity of nucleolus, partial condensation of chromatin, activation of synthetic activity alive hepatocyte.
Проблема взаимоотношений организма и окружающей среды предполагает прежде всего изучение тех приспособительных реакций, с помощью которых организм и его органы поддерживают гомеостаз, ибо «общая черта всех компенсаторно-приспособительных реакций состоит в том, что все они представляют собой ту или иную комбинацию его физиологических функций» [9, c. 9]. Температура среды обитания определяет выживаемость организмов, изменение показателей нормы реакции, темпов роста и развития животных, интенсивности обмена веществ [3, c. 8; 13 — 15; 17, c. 9; 18; 20; 23; 25, c. 10]. Экспериментальные приемы (тепловой шок) имеют как адекватную физиологическую актуальность (климато-географическая миграция, условия высокотемпературных технологий), так и экспериментальную и клиническую основу. Нормально функционирующие ткани пойкилотермных животных обладают способностью регулировать толерантность к гипертермии в зависимости от их исходного индивидуального уровня устойчивости, обусловленного генотипом особи [6, c. 8; 19; 21; 22, c. 10]. Именно термотест является наиболее показательным для выявления различий в неспецифической устойчивости на короткие воздействия гипертермии [11; 12, c. 9]. Цель исследования — выявить характерные проявления раннего внутрикле-
Вестник РГУ им. И. Канта. 2008. Вып. 7. Естественные науки. С. 67—75.
точного этапа репаративной регенерации в период неспецифической реакции печени черепах вида Ттаекетуэ scripta elegans на действие гипертермии. Задачи исследования: определить степень дест-руктивно-репаративных процессов, провести анализ морфометрических показателей органелл гепатоцитов у интактных и экспериментальных животных; изучить характер деструктивных изменений энергетического, лизосомального и пластического аппарата, а также пути элиминации гепатоцитов в условиях гипертермии.
68
Материалы и методы
Острое перегревание черепах вида Тгаскетуэ scripta elegans (самцы трехлетки) проводили в течение 20 — 30 минут в принудительном статичном терморежиме при 42 °С в условиях свободного плавания в термоградиентном лотке с дополнительной аэрацией [4, с. 8]. Для морфологических исследований образцы печени фиксировали в 4 %-ном растворе параформа на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) с добавлением сахарозы (5 %), готовили фронтальные срезы толщиной 10 мкм и окрашивали 0,1 %-ном толуидиновым синим. В дальнейшем материал дофиксировали в 1 %-ном растворе четырехокиси осмия и плоскопараллельно заливали в смесь эпон-аралдит. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом, цитратом свинца. Просмотр и фотографирование ультратонких срезов производили на электронном микроскопе НйасЫ-600Н. Электронно-микроскопическое исследование проводилось для оценки состояния объемной плотности (мкм3/мкм3/ %), поверхностной плотности (мкм2/мкм3) и численной плотности (мкм0/мкм3) митохондрий, хроматина, гранулярной и аг-ранулярной эндоплазматической сети, ядрышка, липидов, лизосом, гликогена гепатоцитов в 50 полях зрения паренхимы печени, при увеличении 3—20 тыс. Объемные, поверхностные и численные показатели структур гепатиоцитов изучались на электроннограммах с использованием программы ИТНБСБЛ ImageTool 3.0 на 100 мкм2 площади паренхимы печени. Статистическую обработку полученного материала осуществляли с помощью пакета прикладных программ БЬаЙзИса^ [8, с. 9]. Значимость различий между независимыми выборками определяли с помощью критерия Манн — Уитни и по критерию однородности Вилкоксона (и).
Результаты
После перегревания черепах отмечается следующая картина. На ультратонких срезах паренхимы печени у интактных животных наблюдается большое число липидных капель, полей гликогена в цитоплазме гепатоцитов, а также аутофагосом и многоядерных гепатоцитов (рис. 1). Митохондрии в основном округлой и овальной формы, гетерогенные по степени уплотнения матрикса. Тесная топографическая связь митохондрий с ГЭС в области ядра отражает интенсивность синтетических процессов белков на экспорт.
Рис. 1. Двуядерный гепатоцит. Гранулы гликогена пресмыкающихся вида Trachemys scripta elegans. Контроль. Увеличение в 4 тыс. раза
После перегревания, так же как и у интактных животных, увеличивается количество двуядерных гепатоцитов и коллагена в пространстве Диссе. Выявлены даже четырех ядерные гепатоциты. Мембрана обоих полюсов практически лишена микроворсинок. В цитоплазме гепатоцитов выражен процесс гидратации, который может быть связан с нарушением ионного гомеостаза. Усиление синтетической активности гепатоцитов проявляется в увеличении объемной плотности ГЭС — в сравнении с контролем на 77,8 % (0,05 ± 0,02 и 0,4 ± 0,04). Уменьшается объемная плотность гликогена на 93,6 % (0,3 ± 0,01 и 0,01 ± 0,003). ЭПС формирует в области ядра сетчатые структуры, в ячейках которых располагаются митохондрии с сильно уплотненным матриксом (рис. 2). В ядрах отдельных гепатоцитов хроматин представлен диффузно распределенными, мелкогранулиро-ванными фракциями. Отмечается топографическое перераспределение ДНК, особенно в области ядерной мембраны (рис. 2).
70
Рис. 2. Формирование ЭПС в области ядра сетчатых структур у пресмыкающихся Тга^тув scripta elegans. Перегревание. Увеличение *8000
В некоторых митохондриях есть едва заметные кристы. Поверхностная площадь митохондрий выросла на 7 % (6,7 ± 0,4 и 7,7 ± 1,4), а численная плотность — на 6,9 % (5,9 ± 0,04 и 7,2 ± 0,9). АЭС фрагментирован на вакуоли с хлопьевидным содержимым различных размеров. Наблюдается процесс вакуолизации ЭПС. Меняется форма ядер за счет формирования инвагинаций в мембране (рис. 3). В ядрышке обнаруживаются участки
просветления, его объемная плотность увеличивается на 11,2 % по сравнению с контролем
(0,08 ± 0,01 и 0,1 ± 0,02) (рис. 3).
На 8 % стала больше поверхностная плотность липидных капель (10,3 ± 0,4 и 12,1 ± 1,0), а также на 12 (4,8 ± 0,6 и 6,1 ± 0,3) и 47,2 % (3,7 ± 0,8 и 10,3 ± 4,8) — соответственно поверхностная и численная плотность
лизосом в сравнении с контролем (рис. 4). В цитоплазме видны признаки развития аутофагии и жировой дистрофии (рис. 4).
Рис. 3. Изменение формы ядра и увеличение объемной плотности ядрышка у пресмыкающихся Тга^тув scripta elegans. Перегревание. Увеличение *4000
В расширенных межклеточных пространствах Диссе располагаются разбухшие пучки коллагеновых волокон, а также ярко выражено формирование фибрилл коллагена из диффузного тропоколлагена (рис. 4). Синусоиды полнокровны, кроме эритроцитов, в них выявляются розетки гликогена, скопление фибриногена, фибрина в виде хлопьевидных масс. Со стороны непаренхимных типов клеток отмечается активация печеночного макрофага, клеток Ито. Так, в цитоплазме купферовских клеток представлено большое количество захваченного клеточного детрита. Макрофаги печени проявляют активацию, в их цитоплазме присутствуют огромные гетерофагосы, содержащие частично лизированные митохондрии, липидные капли. Вокруг купферовских клеток в просвете синусоида наблюдаются свободные гранулы гликогена из разрушенных гепатоцитов и модифицированные литическими ферментами крови
72
клеточные обломки. Клетки Ито трансформируются в миофибробласты
и находятся в состоянии инт ка пи и синтеза г
опоко ллагена.
Я
У:-.* Л*-'-’. ■■ -■"■* <•
Рис. 4. Жировая дистрофия пресмыкающихся Ттаеквтув вогіріа в^апв.
Перегревание. Увеличение *4000
Обсуждение
По-видимому, именно самые ранние, срочно реализуемые в условиях стресса комбинации и реорганизации субклеточных структур гепатоци-тов обеспечивают дальнейшие признаки характера компенсаторно-приспособительной реакции гепатоцитов к гипертермии. Нами установлено, что общей реакцией на действие гипертермии является ультраструк-турный полиморфизм гепатоцитов и органелл, который отражает степень их реакции на гипертермию, что связано с различным ритмом их функционирования, биологической зрелостью, положением в системе ацинуса, а следовательно, и степенью адаптации к тепловой нагрузке. Образуются плотные конгломераты набухших, дегенеративных митохондрий с очаговым просветлением матрикса. Подобные изменения митохондрий могут отражать максимальную функциональную активность,
граничащую с дистрофическими процессами. Деление функционирующей популяции митохондрий может быть причиной увеличения поверхностной плотности мембран, что улучшает условия обменных процессов. Такие изменения можно рассматривать как адаптивные, позволяющие, видимо, существующей в данный момент популяции митохондрий значительно повысить свою функциональную активность в условиях стресса. Локализуются такие митохондрии перинуклеарно. Различные реакции со стороны митохондрий на термальный стресс в пределах одной клетки можно объяснить разным уровнем их функциональной активности, следовательно, они имеют разные структурнофункциональные и биологические потенции, в связи с чем по-разному и неравномерно вовлекаются в деструктивные процессы [2, с. 8; 10, с. 9]. В отдельных гепатоцитах хроматин формирует агрегаты в виде крупных глыбок, большая часть которых имеет примембранное расположение, меняется контур ядер, растет электронная плотность цитоплазмы, матрикс митохондрий уплотняется — эти признаки относят к первой стадии апоптоза в отдельных гепатоцитах [1; 5, с. 8]. Наличие в ядрышке участков просветления и увеличение его объемной плотности отражает интенсификацию функциональной активности и как следствие увеличение синтетической активности в цитоплазме гепатоцитов. В то же время процесс вакуолизации ЭПС проявляется только в отдельных гепатоцитах, что можно связать с различным биологическим их возрастом.
Рост численной плотности лизосом отражает использование в гепатоцитах на этот период альтернативного источника энергии, синтеза ли-зосомальных структур и их ферментов, необходимых для элиминации поврежденных гепатоцитов или клеточных структур, а также отражает повышение синтетической активности в гепатоцитах в этот период, так как существует необходимость затраты энергии для синтеза лизосомаль-ных структур и их ферментов с утилизацией гликогена в качестве источника энергии. Продукты лизосомального гидролиза структурных белков и липидов мембран могут быгть использованы гепатоцитами в качестве источника энергии и для синтеза структур de novo в соответствии с функциональными запросами к гепатоцитам в условиях термального стресса. Показателем повышения синтетических процессов в гепатоцитах в этот период является усиление аутофагических процессов и увеличение количества липидов в гепатоцитах. В свою очередь, выброс лизо-сомальных протеаз в цитозоль активирует лизосомальный путь апоптоза [16, с. 9; 24, с. 10]. Выгавленный рост объемной плотности и поверхностной площади липидных капель связан с нарушением функций ГЭС или с перераспределением пластического материала на синтез лизосомаль-ных структур, численная и объемная плотность которыгх увеличивается и коррелирует со значимым снижением объемной плотности гликогена.
Усиление атрофических процессов и жировой дистрофии в гепатоцитах свидетельствуют о том, что состояние острого стресса может выгзыпвать в печени картину изменений, характерную для целого ряда деструктивных состояний в этом органе. Наряду с этим в период острого стресса в гепатоцитах на субклеточном уровне наблюдается структурное выгражение формирования механизмов «срочной адаптации». На это же указыпвают изменения в популяции митохондрий и активация процессов аутофаго-
73
74
цитоза (помимо изменений содержания гликогена в гепатоцитах). Выявленная нами мозаичность повреждения ультраструктуры гепатоцитов и перемежающейся активности функционирующих гепатоцитов, а также органелл внутри одного и того же гепатоцита определяет возможность печени выдерживать нагрузку в условиях стресса. Учитывая различный временной период функционирования органелл гепатоцитов, в частности митохондрий, можно считать, вк что они могут отражать наличие в клетках широкого спектра танатогенных подпрограмм [7, с. 9], которые реализуются в отдельных гепатоцитах в ответ на действие термального стресса. Различная биологическая зрелость и пространственно-топографическое распределение гепатоцитов, по всей видимости, и обусловливают различную степень их устойчивости к действию тепловой нагрузки.
Таким образом, срочно реализуемая компенсаторная реакция со стороны субклеточных структур гепатоцитов и непаренхимных клеток печени после воздействия гипертермии характеризуется мозаичностью проявления деструктивно-репаративных процессов, формированием мегамитохондрий и повышением функциональной нагрузки на энергетический аппарат гепатоцитов, активацией процессов аутофагии и лизосомального пути апоптоза, усилением функциональной активности ядрышка, частичной конденсацией хроматина, активацией синтетической деятельности живых гепатоцитов.
Список литературы
1. Бакеева Л. Е. Ультраструктура митохондрий при апоптозе / / Сборник научных трудов XXI Российской конференции по электронной микроскопии. Черноголовка, 2006. С. 206.
2. Калашникова М. М., Фадеева Е. О. Особенности ультраструктуры клеток печени грачей, обитающих в экологически неблагоприятных зонах / / Известия РАН. Сер. биол. 2006. № 2. С. 133-141.
3. Калашникова М. М. Ультраструктурные аспекты приспособительных особенностей клеток печени позвоночных. М., 2003.
4. Константинов А. С., Зданович В. В., Пушкарь В. Я. Энергобюджет карпа Сургтиэ сагрю и золотой рыбки Сагавэтв аига^э в оптимальных стационарных и переменных терморежимах / / Вестник Московского ун-та. Сер.16. Биология. 2005. № 1. С. 39—44.
5. Лушников Е. Ф., Абросимов А. Ю. Гибель клетки (апоптоз). М., 2001.
6. Миронова А. П., Розанов Ю. М. Изменчивость уровня теплоустойчивости как показатель функционального состояния клетки / / Цитология. 2000. Т. 42. № 8. С. 725 — 731.
7. Проскуряков С. Я. Некроз — активная форма программируемой клеточной гибели // Биохимия. 2002. Т. 67. Вып. 4. С. 468—487.
8. Реброва О. Ю. Статистический анализ медицинских данных / / Применение пакета прикладных программ 81айвйса. М., 2002.
9. Саркисов Д. С. Рекомбинантные преобразования как один из механизмов качественных изменений в живых системах. М.,. 1994.
10. Ченцов Ю. С. Введение в клеточную биологию. М., 2004.
11. Шахбазов В. Г., Гапченко А. В. Неспецифическая устойчивость и содержание ДНК в геноме амфибий // ДАН СССР. 1990. 314(4). С. 971—975.
12. Шахбазов В. Г. Экологическая и биофизическая генетика: Избр. тр. Харьков, 2001.
13. Angilletta M. J., Steury T. Jr. D., Sears M. W. Temperature, growth rate, and body size in ectotherms: fitting pieces of a life-history puzzle / / Integrative and Comparative Biology. 2004. 44(6). P. 498 — 509.
14. Angilletta M. J., Wilson R. S., Navas C. A., James R. S. Tradeoffs and the evolution of thermal reaction norms // Trends Ecol. Evol. 2003. 18. P. 234 — 240.
15. Bayne B. L. Phenotype flexibility and physiological tradeoffs in the feeding and growth of marine bivalve molluscs // Integr. Comp. Biol. 2004.
16. Erdal H., Berndtsson M., Castro J. Induction of lysosomal membrane permeabi-lization by compounds that activate p53-independent apoptosis / / Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. 102. P. 192—197.
17. Gotthard K. Increased risk of predation as a cost of high growth rate: An experimental test in a butterfly // Anim. Ecol. 2000. 69. P. 896 — 902.
18. Kari Y. H. Lagerspetz. Thermal acclimation without heat shock, and motor responses to a sudden temperature change in Asellus aquaticus / / Thermal Biology. 2003. Vol. 28. Iss. 5. P. 421—427.
19. Kreuzer H. J., Grunze M. Stretching of single polymer strands: a first principles theory // Europhysics Lett. 2001. 55. P. 640 — 646.
20. Lovegrove B. G. The influence of climate on the basal metabolic rate of small mammals: a slow-fast metabolic continuum // Comp Physiol. 2003. 173(2). P. 87—112.
21. O'Brien T. P., Bult C. J., Cremer C. et al. Genome function and nuclear architecture: from gene expression to nanoscience // Genome Res. 2003. 13. P. 1029 — 1041.
22. Regev A., Silverman W., Shapiro E. Representation and simulation of biochemical processes using the n-calculus process algebra / / Pac. Symp. Biocomput. 2001. 6. P. 459—470.
23. Schleucher E, Withers P.C. Metabolic and thermal physiology of pigeons and doves // Physiol Biochem Zool. 2002. 75(5). P. 439 — 450.
24. Winchester B. Lysosomal metabolism of glycoproteins // Glycobiology. 2005. 15(6). Р 1 — 15.
25. Yamahira K., Conover. D. O. Intra- vs. interspecific latitudinal variation in growth: adaptation to temperature or seasonality? // Ecology. 2002. 83. P. 1252 — 1262.
Об авторе
Е.И. Антонова — канд. биол. наук, Омский государственный педагогический университет, [email protected]
УДК 517.958:57
В.В. Бирюков
СТРУКТУРИРОВАННАЯ МОДЕЛЬ ПРОЦЕССА ФЕРМЕНТАЦИИ, ЛИМИТИРОВАННОГО МАССОПЕРЕДАЧЕЙ КИСЛОРОДА
Предложен простой вариант структурированной модели лимитированного кислородом роста, в котором популяция микроорганизмов подразделена на два класса — покоящиеся и растущие клетки. Получены аналитические выражения для расчета концентрации этих компонентов популяции в любой момент времени, позволяющие на основе экспериментальных данных определять кинетические характеристики биосинтеза продуктов метаболизма.
The facilitated variant of structured model of oxygen limited microbial culture growth is proposed. The population of microorganisms is subdivided into 2 classes — resting and growing cells. The analytical equations for calcu-
Вестник РГУ им. И. Канта. 2008. Вып. 7. Естественные науки. С. 75 — 78.
