CC BY
29
УДК 619:579.873.21
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ, ТИНКТОРИАЛЬНЫЕ И КУЛЬТУ-РАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ШТАММОВ MYCOBACTERIUM BO VIS 8 И MYCOBACTERIUM BOVIS VALLEE
А. Н. ПРИТЫЧЕНКО
РУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С. Н. Вышелесского», г. Минск, Республика Беларусь, 220063
(Поступила в редакцию 15.03.2021)
Проблема туберкулёза приобретает особую актуальность в современном мире. Возбудителем болезни инфицировано порядка 40 % людей, ежегодно более 3 млн человек умирает.
Ввиду высокой патогенности и уникальных свойств возбудителя поражаются многие виды животных и даже холоднокровных, однако крупный рогатый скот болеет чаще всего. Основным видом, играющим эпизоотическое значение является Mycobacterium bovis, способный вызывать туберкулёз и у человека [3, 4].
Благодаря аллергической диагностике, в нашей стране поддерживается устойчивое благополучие по туберкулёзу крупного рогатого скота. В настоящее время на ОАО «БелВитуни-фарм» для нужд Республики Беларусь выпускают туберкулин очищенный для млекопитающих, производство которого сопряжено с постоянным контролем штаммов.
Морфологические, тинкториальные и культуральные свойства производственных штаммов Mycobacterium bovis 8 и Mycobacterium bovis Vallee соответствуют типовым и обладают способностью продуцировать туберкулопротеины в концентрации 0,52—1,12 мг/мл, что соответствует ТНПА. Происследованные штаммы можно использовать для создания первичных посевных серий в технологическом цикле производства туберкулина очищенного для млекопитающих.
Ключевые слова: Mycobacterium bovis, туберкулин, аллерген, туберкулёз крупного рогатого скота, технология получения туберкулина.
The problem of tuberculosis is of particular relevance in the modern world. The causative agent of the disease is infected with about 40 % of people, every year more than 3 million people die.
Due to the high pathogenicity and unique properties of the pathogen, many species of animals and even cold-blooded animals are affected, but cattle are most often sick. The main species that plays an epizootic role is Mycobacterium bovis, which can cause tuberculosis in humans [3, 4].
Thanks to the allergic diagnosis, our country maintains a stable well-being for bovine tuberculosis. Currently, JSC "BelVitunifarm" produces tu-berkulinpurified for mammals for the needs of the Republic of Belarus, the production of which is associated with constant monitoring of strains.
The morphological, tinctorial and cultural properties ofthe Mycobacterium bovis 8 and Mycobacterium bovis Vallee strains correspond to the typical ones and have the ability to produce tuberculopro-teins at a concentration of 0.52—1.12 mg / ml, which corresponds to TNPA. The inherited strains can be used to create primary seed series in the technological cycle ofthe production ofpurified tuberculin for mammals.
Key words: Mycobacterium bovis, tuberculin, allergen, bovine tuberculosis, tuberculin production technology.
Введение. В качестве штаммов для производства туберкулина берут Mycobacterium bovis 8 и Mycobacterium bovis Vallee (резервный) [6].
В мировой практике производители используют преимущественно моноштаммную технологию, но до 1982 г. на Курской биофабрике туберкулин готовили из 3 штаммов Mycobacterium bovis №8, №14, Vallee и 2 штаммов Mycobacterium tuberculosis Dt/St и №192 [2, 6]. Штаммы M. bovis №8 и №14 были выделены в СССР в 30 годы прошлого века от больного крупного рогатого скота, а M. bovis Vallee - во Франции [6]. M. tuberculosis Dt/St и №192 были получены в 1948 г. из США [2].
В 70-80 гг. МЭБ признало целесообразным готовить туберкулин лишь из штаммов M. bovis, так как M. tuberculosis повышает концентрацию общеродовых антигенов, и снижает видовую специфичность аллергена [2]. В странах ЕС, США, Южной Америки основным производственным штаммом стал M. bovis AN 5, а штамм Vallee - резервным [10, 11, 12]. Тем не менее, не исключается применение других штаммов, отвечающих требованиям к штаммам M. bovis. На Курской биофабрике основным штаммом является M. bovis №8, как наиболее продуктивный по выходу туберкулопротеинов [2]. Для производства туберкулина в Украине использован полевой штамм M. bovis. Нередко туберкулины для медицинских целей готовили из целого набора штаммов одного вида, хотя существенных различий в их антигенном составе не обнаружено. Для приготовления эталона PPD RT 23 (Государственный институт сывороток, Копенгаген) было использовано 77 штаммов M. tuberculosis [9], хотя в последующем было установлено, что PPD RT 23 достоверно не отличался от моноштаммных препаратов [7, 8].
Исследования на крупном рогатом скоте и морских свинках показали, что ППД из M. bovis №8 и M. bovis AN5 не различаются [2, 5]. Вместе с тем прямых данных об их антигенном составе нет, и по вопросу их антигенной идентичности, возникают дискуссии, хотя известно, что у штаммов M. bovis №8 и Vallee заметных антигенных различий не обнаружено [5].
На свойства производственных штаммов могут влиять многократные пассажи на питательных средах с переходом к 6-12 генерации в S-форму. Культуральная жидкость S-культур МБТ содержит много белка, но с низкой активностью и видовой специфичностью [1]. Для ста-
билизации свойств производственных штаммов рекомендуется каждые 3-5 лет проводить пассаж на телятах [6].
Исключить диссоциацию производственного штамма МБТ можно ограничением числа пассажей на жидкой среде и использованием принципа «первичной посевной серии». Для этого ВОЗ рекомендует создание большой по объёму и хорошо изученной первичной посевной серии производственного штамма [10]. По мере необходимости, из неё создают вторичные производственные серии, число пассажей которых ограничивается [1, 10, 12]. При наличии диссоциаций происходит изменение не только культуральных, но и морфологических и тинктори-альных свойств микобактерий [10]. По международным требованиям производство туберкулина должно вестись с использованием первичной посевной серии производственного штамма [1, 5, 12], что максимально исключает изменение свойств диагностикума из-за процессов адаптации и диссоциации культуры при многократных пересевах на жидкой синтетической питательной среде.
Таким образом, изучение морфологических, тинкториальных и культуральных свойств производственных штаммов Mycobacterium bovis 8 и Mycobacterium bovis Vallee является актуальной задачей.
Цель работы - изучить морфологические, тинкториальные и куль-туральные свойства производственных штаммов Mycobacterium bovis 8 и Mycobacterium bovis Vallee и создать первичные посевные серии.
Основная часть. В качестве объектов исследования использовали штаммы Mycobacterium bovis 8 и Mycobacterium bovis Vallee, полученные из РУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вы-шелесского». Для культивирования штаммов использовали питательные среды: МПА, МПБ, Гельберга, Лёвенштейна-Йенсена, Павловского и Сотона.
Для изучения морфологических и тинкториальных свойств готовили препараты-мазки по классической методике, окрашивали по Цилю-Нильсену и Киньону, микроскопию проводили в световом микроскопе OLYMPUS BX51 с системой видеофиксации DP71.
Культуральные свойства изучали на средах МПА, МПБ, Гельберга, при различных температурных режимах (20, 37 и 45°С), а также на средах Павловского и Сотона. Антигенные свойства изучали иммуно-пероксидазным методом с использованием аффинно очищенных иммуноглобулинов к Mycobacterium bovis BCG. Идентификацию штаммов проводили в полимеразной цепной реакции (ПЦР) по стандартному протоколу.
Для определения содержания туберкулопротеинов использовали методику: 0,5 мл пробы + 2,0 мл H2O + 2,5 мл 20 % трихлоруксусной кислоты (ТХУ) - определение % пропускания через 5 мин при 540 нм в сравнении с контролем (2,5 мл HO+2,5 мл 20 % ТХУ). Расчёт содержания туберкулопротеинов проводили относительно калибровки, построенной по известным количествам сухого ППД туберкулина.
Все опыты сопровождались необходимыми контролями.
При изучении культуральных свойств сделаны посевы на различные питательные среды: МПА, Гельберга, Лёвенштейна-Йенсена.
При культивировании на МПА и МПБ при 37 °С, а также при 20 и 45 °С среды оставались стерильными без признаков роста культур.
На средах Гельберга, Лёвенштейна-Йенсена и Павловского штаммы Mycobacterium bovis 8 и Mycobacterium bovis Vallee формировали типичные колонии при температуре 38°С уже через 3 недели (рис. 1-3).
Рис. 1. Характер роста M. рис. 2. Характер рсюта Рис. 3. Характер роста bovis 8 и M. bovis Vallee на м. boviS 8 на среде штамма M. bovis 8 на среде Гельберга Лёвенштейна-Йенсена среде Павловского
На среде Гельберга (рис. 1) культуральные свойства характеризовались интенсивным ростом, мелкими, размером до 4 мм в диаметре, с неровным краем, сухими, непрозрачными, с приподнятым центром, цвета слоновой кости шероховатыми колониями R-формы, зачастую неправильной формы, в последующем образующие сливной рост, приобретающий складчатость. Со временем наблюдалось изменение цвета среды с оливково-зелёного до кремового в виду редукции малахитового зелёного.
На среде Лёвенштейна-Йенсена (рис. 2) культуральные свойства характеризовались менее интенсивным ростом, более мелкими, размером до 4 мм в диаметре, с неровным краем, непрозрачных, также цвета слоновой кости шероховатыми колониями R-формы и сливным ростом. На среде Павловского через 8 недель (рис. 3) культуральные свойства характеризовались мощным ростом с образованием мелких и крупных 2-5 мм в диаметре колоний, с неровным краем, непрозрачных, цвета слоновой кости шероховатыми колониями R-формы. Наиболее быстрый рост проявлялся на среде Павловского, уже через 14 дней культивирования. Это объясняется наилучшими адаптационными условиями для микобактерий на среде Павловского содержащую глицериновый картофель. При микроскопии препаратов-мазков, окрашенных по Цилю-Нильсену из колоний, полученных на средах Гель-берга, Лёвенштейна-Йенсена и Павловского штаммы Mycobacterium bovis 8 и Mycobacterium bovis Vallee обнаружены типичные рубиново-красные палочки (рис. 4-6).
Рис. 4. Морфология и тинкториальные свойста M. bovis 8 на среде Гель-берга, окраска по Цилю-Нильсену, х1000
Рис. 5 . Морфология и тинкториальные свойста M. bovis 8 на среде Лё-венштейна-Йенсена, окраска по Цилю-Нильсену, х1000
Рис. 6. Морфология и тинкториальные свойста M. bovis 8 на среде Павловского, окраска по Цилю-Нильсену, х1000
Как видно из рис. 4-6, штаммы Mycobacterium bovis 8 представляют собой чистые культуры, в которых видно наличие коротких, средних и длинных палочек рубиново-красного цвета на голубоватом фоне, размером до 1,5-7 мкм в длину и 0,3-0,7 мкм в диаметре, располагающихся одиночно, группами, скоплениями в виде формирующихся элементов корд-фактора -жгуты и конгломераты красного цвета (рис. 4-5), что характерно для данных штаммов.
На среде Сотона уже через 3 недели образовывалась лёгкая полупрозрачная нежная плёнка, занимающая всю поверхность среды или распола-
325
гаюшаяся в виде островков. В более старшем возрасте культуры росли с образованием обильной сухой складчатой плёнки цвета слоновой кости, заползаюшей на стенки флакона и образуюшие мошное пристеночное кольцо, при этом среда остаётся прозрачной, иногда наблюдается образование рыхлого, достаточно мошного осадка, который формируется при оседании плёнки. В процессе роста культур в культуральной жидкости за 89 недель происходило накопление 0,53-1,14 мг/мл туберкулопротеинов. При исследовании штамма Mycobacterium bovis Vallee получены идентичные результаты по морфологическим, тинкториальным и культуральным свойствам, продукция туберкулопротеинов была на уровне 0,51-1,11 мг/мл, что укладывается в нормативные показатели.
Культуры микобактерий Mycobacterium bovis 8 и Mycobacterium bovis Vallee были идентифицированы в ПЦР, а также происследованы в иммуно-пероксидазном методе с аффинно очишенными иммуноглобулинами к Mycobacterium bovis BCG. При микроскопии препаратов-мазков обнаружены морфологически типичные микобактерии бычьего типа, специфически окрашенные в коричневый цвет.
Заключение. Происследованные штаммы по морфологическим, тинк-ториальными и культуральными свойствами соответствуют характеристикам вида, идентифицированы в высокоспецифических тестах и способны продуцировать туберкулопротеины в достаточно высокой концентрации. Продукция туберкулопротеинов была на уровне для Mycobacterium bovis 8 -0,53-1,14 мг/мл и для Mycobacterium bovis Vallee - 0,51-1,11 мг/мл. Данные штаммы можно использовать для создания первичных посевных серий в технологическом цикле производства туберкулина очишенного для млеко-питаюших.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ауштрова, К. Н. Оптимизация системы подготовки производственных штаммов возбудителя туберкулёза при изготовлении очищенного туберкулина для млекопитающих: автореф. дис. ... канд. вет. наук: 16.00.03 / К. Н. Ауштрова; Всесоюзный государственный научно-контрольный институт. - М., 1991. - 21 с.
2. Козлов, В. Е. Аллергены для диагностики туберкулёза: совершенствование производства и стандартизация: автореф. дис. ... д-ра биол. наук: 16.00.03; 03.00.23 /
B. Е. Козлов; ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» - Москва, 2007. - 43 с.
3. Лысенко А. П., Власенко В. В., Красникова Е. Л., Лемиш А. П., Аксенчик М. А., Притыченко А. Н. Вирус бычьего лейкоза - вирусоподобная форма микобактерий туберкулеза? Экология и животный мир. - 2019. - №1. - С. 15-25.
4. Притыченко, А. Н. Аллергическая активность и специфичность препаратов туберкулина с 30-50 % слабосекретирующихся антигенов микобактерий туберкулёза / А. Н. Притыченко, А. П. Лысенко, М. В. Кучвальский, Е. Л. Красникова // Весщ На-цыянальнай акадэмп навук Беларуси Серыя аграрных навук. - 2020. - Т. 58. - N° 4. -
C.472-482.
5. Притыченко, А. Н. Туберкулин очищенный для млекопитающих (оптимизация очистки, диагностические и иммунохимические свойства): автореф. дис. ... канд. вет. наук : 16.00.03 / А. Н. Притыченко; БНИИ экспериментальной ветеринарии им. С. Н. Вышелесского. - Минск, 2002. - 17 с.
6. Юсковец, М. К. Туберкулёз сельскохозяйственных животных и птиц / М. К. Юсковец. - Минск: Ураджай, 1963. - 448 с.
7. Assessment of defined antigens for the diagnosis of bovine tuberculosis in skin test-reactor cattle / J.M. Pollock [et al.] // Veter. Rec. - 2000. - Vol. 146, № 23. - P. 659-665.
8. Harboe, M. Antigens of old tuberculin and autoclaved M. bovis BCG / M. Harboe // Amer. Rev. Resp. Dis. - 1984. - Vol. 124, № 1. - P. 124-127.
9. Magnusson, M. Preparation of purified tuberculin RT 23 / M. Magnusson, M. W. Bentzon // Bulletin of the World Health Organization. - 1958. - Vol. 19. - P. 46-63.
10. Palmer, D. N. Bovine tuberculosis in OIE manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals, 5th ed. / D. N. Palmer // World Organisation for Animal Health, France [Electronic resource] - 2004. - Mode of access: http: //www.oie.int/eng/normes/en_mmanual.htm. 22. - Date of access: 23.07.2004.
11. World Animal Health in 1995. Reports on the animal health status and disease control methods and list a disease outbreaks - statistics. Reports are presented in English, French, Spanish or Russian / Office International des Epizooties. - Brucel, 1995. - Part 1. - P. - 348.
12. World Health Organization (WHO) Requirements for Biological Substances, Annex: Requirement for Tuberculins: technical Report Series. - WHO, Geneva, 2005. - 1102 p.
