CC BY
38
ПРЕПАРАТЫ
U
Использование аллергенов туберкулезных для исследования антигенов вирулентности у штаммов Mycobacterium bovis
Леви Д.Т., Обухов Ю.И., Рухамина М.Л., Александрова Н.В., Наконечная А.В.
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва
Use of tuberculosis allergens for studying virulence antigens in Mycobacterium bovis strains
Levi D.T., Obukhov Y.I., Rukhamina M.L., Alexandrova N.V., Nakonechnaya A.V.
Federal State Budgetary Institution "Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products of the Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow
л
Биопрепараты Диаскинтест® аллерген туберкулезный рекомбинантный в стандартном разведении и аллерген туберкулезный очищенный в стандартном разведении (туберкулин), обладающие различной специфичностью и предназначенные для диагностики туберкулеза, использованы для выявления антигенов вирулентности у16 штаммов M. bovis в эксперименте на морских свинках. Диаскинтест® представляет собой генно-инженерный препарат, состоящий из комплекса 2 антигенов ESAT-6 и CFP-10, присутствующих в вирулентных штаммах. Морские свинки, зараженные испытуемыми штаммами M. bovis, положительно реагировали на внутрикожное введение этого препарата. Животные, вакцинированные БЦЖ - штаммом M. bovis, у которого доказана делеция генного участка, ответственного за выработку антигенов ESAT-6 и CFP-10, на введение Диаскинтеста® не реагировали.
Ключевые слова: микобактерии туберкулеза, «антигены вирулентности» ESAT-6 и CFP-10, туберкулез, туберкулин, Диаскинтест®.
Библиографическое описание:ЛевиД.Т., Обухов Ю.И., Рухамина М.Л., Александрова Н.В., Наконечная А.В. Использование аллергенов туберкулезных для исследования антигенов вирулентности у штаммов Mycobacterium bovis // Биопрепараты. 2013. №1. С. 23 - 27.
Diaskintest® recombinant tuberculosis allergen in standard dilution and purificated tuberculosis allergen in standard dilution (tuberculin) biopreparations, possessing different specificities and intended for tuberculosis diagnostics, were used for the detection of virulence antigens of 16 strains of M. bovis in guinea pig tests. Diaskintest® is a genetically engineered product consisting of two antigens complex ESAt-6 and CFP-10 in virulent strains. Guinea pigs infected with strains of M. bovis strains, showed positive reaction to the intradermal injection of this medicine. Animals vaccinated with BCG - strain M. bovis, which has proved a deletion of a gene site responsible for producing antigens ESAT-6 and CFP-10, showed no reaction to Diaskintest® administration.
Key words: mycobacterium tuberculosis, « virulence antigens» ESAT-6 and CFP-10, tuberculosis, tuberculin, Diaskintest®.
Bibliographic description: Levi D.T., Obukhov Y.I., Rukhamina M.L., Alexandrova N.V., Nakonechnaya A.V. Use of tuberculosis allergens for studying virulence antigens in Mycobacterium bovis strains // Biopre-parats (Biopharmaceuticals). 2013. № 1. P. 23 - 27.
Для корреспонденции:
Леви Д.Т. - главный эксперт Управления экспертизы противобактериальных МИБП Центра экспертизы и контроля
МИБП ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России
Адрес: ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России
119002, Москва, пер. Сивцев Вражек, 41
e-mail: [email protected]
Статья поступила 21.01.2013 г, принята к печати 07.02.2013 г
В группу микобактерий туберкулеза (МБТ), называемую Mycobacterium tuberculosis complex, по классификации H. Tomioka (1998) [12] входят : M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti, M. canettii, M. caprae, M. pinnipedii. В 2010 году появилась публикация об открытии нового вида МБТ - M. mungi [5].
Среди МБТ M. tuberculosis является преобладающим агентом в этиологии туберкулеза у человека. M. bovis
- возбудитель туберкулеза крупного рогатого скота, коз, овец, лошадей, кошек, собак также патогенна для человека. В мире имеются регионы, где выявляется до 20% случаев туберкулеза у людей, вызванного M. bovis. В СССР в Казахстане до 15% туберкулеза у людей было вызвано M. bovis, а в целом по стране не более 3% [1, 2]. В настоящее время в России лишь единичные исследования посвящены вопросам дифференцирования выделенных от больных людей штаммов микобактерий до вида, отсутствуют работы по изучению вирулентности M. bovis, выделенных как от больных людей, так и животных.
Большим научным прорывом в исследовании туберкулеза является расшифровка генома M. tuberculosis в 1996 г. [6]. В настоящее время известно, что за вирулентность штаммов M. tuberculosis в значительной степени, наряду с другими отвечают гены, кодирующие антигены ESAT-6 и CFP-10. При сравнении геномной последовательности M. tuberculosis с аттенуированной M. bovis BCG была обнаружена делеция трех геномных участков в вакцинном штамме (RD1, RD2, RD3). Вакцинный штамм БЦЖ лишен участков генома в RD1, кодирующих микобактери-альные антигены ESAT-6 и CFP-10, присутствующих в вирулентных штаммах M. tuberculosis complex.
В России, в Институте молекулярной биологии ММА им. И. М. Сеченова, был разработан генно-инженерный метод получения специфичного антигена, состоящего из комплекса двух антигенов ESAT-6 и CFP-10, кодируемых областью региона RD1. На основе этого метода фирма ЗАО «Лекко» разработала препарат Диаскинтест® аллерген туберкулезный очищенный в стандартном разведении для внутрикожного введения. Диаскинтест® представляет собой комплекс двух антигенов ESAT-6 и CFP-10, продуцируемый генетически модифицированной культурой Escherichia соН BL21 (DE3)/pCFP-ESAT, разведенный в стерильном изотоническом фосфатном буферном растворе с консервантом до содержания 0,2 мкг белка в мл [3]. Специфичность этого препарата в эксперименте проявляется в том, что он выявляет гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ), только обусловленную сенсибилизацией вирулентными МБТ, а вакцинированные БЦЖ животные не реагируют на Диаскинтест®. На аллерген туберкулезный очищенный в стандартном разведении (очищенный туберкулин) положительные реакции на кожный тест дают как вакцинированные БЦЖ, так и зараженные МБТ животные. Линейная зависимость «логарифм дозы-ответ» присуща как одному, так и другому аллергену: чем выше доза препарата, тем больший размер ответной реакции на внутрикожное введение препарата. Интересно отметить, что животные, сенсибилизированные инактивированными вирулентными МБТ, практически
не реагируют на Диаскинтест®, отвечая на его введение сомнительными реакциями (до 5 мм), что дало основание предположить, что этот аллерген может быть маркером активности туберкулеза у человека [3].
Многие авторы полагают, что делеция участков генома в RD1, кодирующих микобактериальные антигены ESAT-6 и CFP-10, произошла в процессе создания штамма БЦЖ. Однако вопрос о том, все ли штаммы М. bovis кроме БЦЖ имеют антигены ESAT-6 и CFP-10, и зависит ли от наличия этих антигенов степень вирулентности штаммов микобактерий бычьего вида, остается не изученным [7, 8].
Музей микобактериальных культур ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России располагает 16 штаммами М. bovis, 5 из которых получены с 1936 по 1961 гг. из научных учреждений страны и США. Остальные 11 штаммов выделены от больных туберкулезом коров в средней полосе России и в Казахстане и представлены в ГИСК им. Л. А. Тарасевича на депонирование в 1990 г. Горьковским НИВИ НЗ РСФСР ВАСХНИЛ. Задачей настоящей работы явилось:
- исследовать с помощью внутрикожного теста с туберкулезными аллергенами наличие в штаммах М. bovis генов, кодирующих антигены ESAT-6 и CFP-10;
- изучить возможность оценить вирулентность штамма по уровню ГЗТ, определяемой по ответу на Диаскинтест®.
Материалы и методы
Животные. Морские свинки, альбиносы, массой 280-300 г, получены из питомника филиал «Андреевка» ФГБУ «НЦБМТ» РАМН. Животных содержали в одинаковых условиях при одинаковом пищевом рационе.
Штаммы М. bovis в музее хранили в ампулах в лио-фильно высушенном виде. Перечень штаммов представлен в табл. 1.
Для изучения морфологических и культуральных свойств штаммы из ампул высевали на питательные среды - яичную среду Левенштейна-Йенсена (1, 2 и 3 генерации) и картофельную среду Павловского (3 генерация).
Сенсибилизация морских свинок. Бактериальную массу культуры третьей генерации каждого штамма, собранную с поверхности питательной среды Левенштей-на-Йенсена, растирали в банках со стеклянными бусами, разводили раствором натрия хлорида 0,9% до содержания 0,005 мг в 1 мл и вводили п/к по 0,2 мл 3 морским свинкам. Вакцину туберкулезную БЦЖ, регидратирован-ную прилагаемым растворителем, вводили 3 морским свинкам контрольной группы (по 0,5 мг в/к в 2 места).
Аллергены.
- ОСО ППД-Л-2 № 42-28-49 А (2 ТЕ в 0,1 мл) - отраслевой стандартный образец специфической биологической активности очищенного туберкулина PPD-L-2.
- РСОп Диаскинтеста® 0,2 мкг в 0,1 мл (разведенный стандартный образец предприятия специфической биологической активности Диаскинтеста® аллергена туберкулезного рекомбинантного).
ГЗТ к аллергенам у зараженных животных исследовали через 1 и 2 мес. путем внутрикожного введения по
*
ПРЕПАРАТЫ
Таблица 1. Результаты постановки внутрикожных проб с туберкулином и Диаскинтестом® морским свинкам через 1 мес. после заражения
Штамм M. bovis Средняя (мм) реакция на 2 ТЕ ППД-Л ± m (n = 9) Средняя реакция на 0,2 мкг, РСОп ± m (n = 9) Разность средних реакций (мм) Достоверность различий (p)
1594* 9,45 ± 0,17 11,57 ± 0,42 2,12 > 0,05
1б28* 10,72 ± 0,49 10,59 ± 0,б2 -0,13 > 0,05
588* 9,3б ± 0,4 12,22 ± 0,42 2,8б > 0,05
1573* 10,25 ± 0,75 11,б9 ± 0,47 1,44 > 0,05
157б* 8,94 ± 0,25 12,33 ± 0,49 3,39 < 0,05
598* 9,11 ± 0,33 11,11 ± 0,39 2,0 > 0,05
б07* 7,94 ± 0,42 12,44 ± 0,52 4,50 < 0,05
Vallee** 7,25 ± 0,4 11,1б ± 0,4б 3,91 < 0,05
Ravenel** 10,22 ± 0,17 12,38 ± 0,42 2,1б > 0,05
б10* 9,5±0,5 11,25±0,31 1,75 > 0,05
595* 10,б±0,б3 11,5б±0,35 1,0 > 0,05
58б* 8,б2±0,74 9,б3±0,325 1,0 > 0,05
Виноградов** 10,8±0,29 11,31±0,54 0,5 > 0,05
Bovinus-8** 12,5±0,1б 13,0б±0,22 0,5 > 0,05
1б32* 12,2±0,45 12,00±0,3 0,2 > 0,05
Bang** 11,31±0,27 5,75±1,5б -4,5б < 0,05
БЦЖ*** 10,1 ± 0,41 0,02 - 10,1 < 0,01
* Штаммы из Горьковского НИВИ НЗ РСФСР ВАСХНИЛ.
** Штаммы из музея ФГБУ ГИСКим. Л.А. Тарасевича.
*** Аттенуированный штамм для производства туберкулезной вакцины.
0,1 мл РСОп Диаскинтеста® и ОСО ППД-Л-2 (по 3 пробы каждого препарата). Для кодирования места постановки проб использовали метод латинских квадратов. Учет реакций проводили через 24 ч. Подсчитывали средний из
9 диаметров эритемы на каждый препарат для каждой группы животных. Данные подвергали статистической обработке методами вариационной статистики. Использовали 95% уровень вероятности для оценки достоверности различий между размерами средних реакций.
Вирулентность штаммов оценивали через 2,5 мес. после заражения животных. Морских свинок подвергали эвтаназии, вскрывали и обследовали визуально на наличие туберкулезных поражений в лимфатических узлах, печени, селезенке и легких. Степень поражения морских свинок туберкулезом оценивали по индексу поражения, предложенному А.И. Нахимсон, когда тотальное поражение внутренних органов (печень, селезенка, легкие) принимается за 100.
Результаты
Исследования показали, что по культурально-морфологическим свойствам различия между 16 штаммами практически отсутствовали. Все штаммы - это спирто-кислотоустойчивые палочки (палочки красного цвета при окрашивании мазка по Цилю-Нильсену), растут в виде R-колоний на среде Левенштейна-Йенсена. По скорости роста штаммы также практически не различались: рост 1-й генерации на среде Левенштейна-Йенсена - 3-4 недели, 2-й и 3-й генерации - 2-3 не-
дели, 3 пассаж на среде Павловского - 3 недели. Среди исследуемых культур не выявлены быстрорастущие штаммы, которые, как известно, обладают ослабленной вирулентностью.
В таблице 1 представлены результаты сравнительного исследования ГЗТ на туберкулезные аллергены у животных через 1 месяц после заражения.
Анализ полученных данных показал, что все животные, кроме морских свинок, вакцинированных БЦЖ, реагировали как на Диаскинтест®, так и на туберкулин, что указывает на присутствие антигенов ESAT-6 и CFP-10 во всех изучаемых штаммах микобактерий бычьего вида, кроме M. bovis BCG. Животные трех групп (зараженные штаммами M. bovis 1576, M. bovis 607 и M. bovis Vallee) давали реакцию на Диаскинтест® более выраженную, чем на туберкулин с вероятностью более 95%. Животные, зараженные M. bovis Bang, также реагировали на оба аллергена, однако размеры реакций на Диаскинтест® были статистически значимо меньше, чем реакции на 2 ТЕ ППД-Л-2 (р< 0,05). У морских свинок, зараженных штаммами 1628 и 1573, средние реакции на туберкулин и на Диаскинтест® были практически одинаковыми (р>0,05). В остальных группах реакции на антигены ESAT-6/CFP-
10 превалировали над реакциями на ППД-Л, однако достоверность этих различий доказать не удалось.
Через 2 мес. после заражения, реакции на Диаскинтест® также были выше, чем на туберкулин, однако достоверность этих различий удалось доказать только для групп морских свинок, зараженных M. bovis 607 и M. bovis Vallee. У животных, зараженных M. bovis Bang, раз-
О5
Таблица 2. Индексы поражения животных, зараженных M. bovis
Штамм M. bovis Индекс поражения Степень вирулентности
610 100 Высоковирулентный
595 100 Высоковирулентный
586 100 Высоковирулентный
Виноградов 85 Высоковирулентный
Bovinus-8 86.6 Высоковирулентный
1576 80 Высоковирулентный
1594 70 Вирулентный
588 60 Вирулентный
1632 63 Вирулентный
Ravenel 50 Вирулентный
Vallee 35 Умеренно вирулентный
607 35 Умеренно вирулентный
598 30 Умеренно вирулентный
1573 20 Слабовирулентный
1628 7 Слабовирулентный
Bang 7,3 Слабовирулентный
БЦЖ 2 Аттенуированный
меры реакций на Диаскинтест® были статистически значимо меньше, чем реакции на 2 ТЕ ППД-Л-2 (р< 0,05). В остальных группах достоверность различий в размерах реакций на эти препараты доказать не удалось.
Вакцинированные БЦЖ морские свинки через 1 и 2 мес. после сенсибилизации отвечали положительно на введение 2 ТЕ туберкулина. Реакции на Диаскинтест® у них практически отсутствовали, что подтверждало отсутствие генов, кодирующих антигены ESAT-6 и CFP-10.
Через 2,5 мес. после заражения животные были подвергнуты эвтаназии, вскрыты и обследованы на наличие туберкулезных поражений. Результаты представлены в таблице 2 и на рисунке 1.
Анализ полученных данных показал, что 16 изучаемых штаммов М. bovis по степени туберкулезных поражений у животных можно разделить на 4 группы. Тяжелые поражения внутренних органов морских свинок (тотальное поражение селезенки, печени и легких, лимфатических узлов) вызывали 6 штаммов (М. bovis 1576, М. bovis 610, М. bovis 595, М. bovis 586, М. bovis Виноградов, М. bovis Bovinus-8). Эти штаммы отнесены к группе высоковирулентных, индекс поражения животных находился в пределах от 80 до 100. Часть животных, зараженных вышеуказанными штаммами, начала гибнуть от туберкулеза уже через 4 недели после заражения. Два штамма (М. bovis Виноградов, М. bovis Bovinus-8) - это музейные, остальные 4 - депонированные изоляты от больных коров.
Индекс поражения туберкулезом от 50 до 70 имели животные 4 групп: морские свинки, зараженные М. Ьо-мв 588, М. Ьо^в 1594, М. Ьovis 1632 и М. Ьо^в Яауепе1. Вирулентность проявлялась поражением всех внутренних органов зараженных животных, однако туберкулезные узелки были мельче и не сливались друг с другом. Эти штаммы, вызвавшие достаточно тяжелые поражения внутренних органов и лимфатических узлов, отнесены к вирулентным.
У животных, зараженных M. bovis Vallee, M. bovis 607 и M. bovis 598, при вскрытии отмечены менее значительные поражения внутренних органов, туберкулезные узелки выявлены помимо лимфатических узлов только в 2 органах. Эти 4 штамма признаны умеренно вирулентными.
Наибольший интерес представляют три штамма: M. bovis 1573, M. bovis 1628 и M. bovis Bang. Поражения после заражения штаммом M. bovis 1628 ограничивались только регионарными лимфатическими узлами. У одной морской свинки, зараженной штаммом M. bovis Bang, выявлен только один
Группа вакцинированных БЦЖ морских свинок служила контролем. У этих животных отмечено только увеличение поверхностного и глубокого паховых лимфатических узлов.
При исследовании корреляции ГЗТ на туберкулин и Диаскинтест® у зараженных животных с вирулентностью инфицирующего агента установлено, что все морские свинки реагировали положительно на оба аллергена реакциями размером от 8,6 до 12,5 мм и 9,613,6 мм соответственно. Достоверно большие размеры ответных реакций на Диаскинтест®, чем реакции на туберкулин отмечены только у животных, зараженных M. bovis 1576, M. bovis Vallee, M. bovis 607. При этом, штамм M. bovis 1576 относится к группе высоковирулентных, а два других - к группе умеренно вирулентных, т.е. в данной оранжировке опыта не удалось доказать, что более высокая вирулентность штамма ведет к большей сенсибилизации морских свинок искомыми антигенами. У животных, зараженных M. bovis Bang, реакции на внутрикожный тест с Диаскинтестом® были статистически значимо меньше, чем на туберкулин, что свидетельствовало о слабом проявлении генов, кодирующих антигены ESAT-6 и CFP-10. Для двух других представителей группы штаммов со слабой вирулентностью достоверность различий в реакциях на аллергены доказать не удалось. Контрольный аттенуирован-
ПРЕПАРАТЫ
ный штамм БЦЖ, как и следовало ожидать, не проявлял вирулентности на морских свинках, а вакцинированные животные не реагировали на Диаскинтест®, что свидетельствует об отсутствии антигенов ESAT-6 и CFP-10.
Таким образом, при постановке проб с аллергенами различной специфичности морским свинкам, зараженным изучаемыми штаммами микобактерий бычьего вида, установлено, что все изученные штаммы, кроме M. bovis BCG, несут в себе гены, кодирующие антигены ESAT-6 и CFP-10. В этой связи уместно предположить, что в хозяйствах (на фермах), где отмечается заболевание скота туберкулезом, постановка туберкулинполо-жительным животным внутрикожных проб с Диаскинте-стом® позволит дифференцировать неспецифическую ГЗТ к туберкулину, вызванную нетуберкулезными микобактериями, от обусловленной сенсибилизацией M. bovis. В таких хозяйствах целесообразно также проведение диаскин-теста работникам, обслуживающим скот, подозрительный на туберкулез, с целью выявления заражения их этим видом микобактерий.
Следует признать, что в данной аранжировке опыта при небольшом количестве морских свинок в группе не удалось дать четкий ответ на вопрос, можно ли по уровню ГЗТ к Диаскинтесту® установить степень вирулентности штамма. Эти исследования следует считать предварительными, они позволили отобрать 6 штаммов для дальнейших расширенных исследований в этом направлении: M. bovis 1576, M. bovis Vallee, M. bovis 607, M. bovis Bang, M. bovis 1573, M. bovis 1628.
Выводы:
Рис. 1. Распределение штаммов по группам вирулентности.
- аттенуированный индекс поражения (ИП) от 0 до 6
- слабовирулентные ИП от 7 до 20
- умеренновирулентные ИП от 30 до 35
- вирулентные ИП от 50 до 70
- высоковирулентные ИП от 80 до 100
1. Показана различная степень вирулентности для морских свинок 5 музейных и 11 депонированных штаммов M. bovis, выделенных от крупного рогатого скота, что позволило разделить их на 4 группы: высоковирулентные, вирулентные, умеренно вирулентные и слабовирулентные.
2. Все изученные штаммы M. bovis, в отличие от БЦЖ, содержат антигены ESAT-6 и CFP-10, о чем свидетельствуют положительные реакции на специфический туберкулезный аллерген - Диаскинтест® у животных, зараженных этими штаммами.
3. Применение внутрикожных проб с Диаскинте-стом® у крупного рогатого скота с подозрением на туберкулез, может быть перспективным для дифференцирования неспецифической ГЗТ к туберкулину, вызванной нетуберкулезными микобактериями, от ГЗТ, обусловленной сенсибилизацией M. bovis.
4. Наличие антигенов ESAT-6 и CFP-10 во всех изо-лятах от крупного рогатого скота позволяет рекомендовать проведение обследования работников, обслуживающих животных, подозрительных на туберкулез, внутрикожной пробой с Диаскинтестом® с целью выявления лиц с туберкулезной инфекцией, вызванной микобактериями бычьего вида.
Литература:
1. Благодарный Я.А., Батырбеков С. Туберкулез домашних животных и его связь с туберкулезом человека //Пробл. туб. 1976. № 3. С. 14-17.
2. Литвинов В.И., Макарова М.В., Краснова М.А. Нетуберкулезные микобактерии. М. 2008. 256 с.
3. Кожная проба с препаратом «ДИАСКИНТЕСТ» - новые возможности идентификации туберкулезной инфекции/Под ред. Пальцева М.А. М., 2011. 256 с.
4. Блюм Б. Р. Туберкулез. Патогенез, защита, контроль. М. 2002. 696 с.
5. Alexander K.A., Laver P.N., Michel A.L. Novel Mycobacterium tuberculosis Complex pathogen, M. mungi// Emerging Infectious Diseases. - 2010. V. 16, № 8. P. 1296-1299.
6. Behr M.A., Wilson M.A., Gill W.P., Salamon H, Schoolnik G.K., Rane S., Small P.M. Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray //Science. 1999. V. 284(5419). Р. 15201523.
7. Magdalena J., Supply Ph., Locht C. Specific differentiation between Mycobacterium bovis BCG and virulent strains of the Mycobacterium tuberculosis Complex //Clin. Microbiol. 1998. V. 36, № 9. P. 2471-2476.
8. Harboe M., Oettinger Т., Wiker H.G. Rosenkrands I., Andersen P. Evidence for occurrence of the ESAT-6 protein in Mycobacterium tuberculosis and virulent Mycobacterium bovis and for its absence in Mycobacterium bovis BCG // Infect. Immun. 1996. V. 64. Р. 16-22.
