Морфологические нарушения нейронов теменной коры и гиппокампа крыс в динамике субтотальной церебральной ишемии Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

6. Микробиоценоз верхних дыхательных путей как фактор риска местных осложнений послеоперационного периода при экстирпации гортани / Е. В. Шугакова, В. А. Чаукина, А. Б. Кисилева [и др.] // Российская оториноларингология. - 2017. -№ 1 (86). - С. 154-158.

7. Микробный состав микрофлоры ротоглотки у больных с тонзиллярной патологией / О. Ю. Борисова, В. А. Алешкин, А. С. Пименова [и др.] // Инфекция и иммунитет. - 2015. - Т. 5. - № 3. - С. 225-232.

8. Михайлова, Е. А. Микробная экология небных миндалин у больных хроническим тонзиллитом / Е. А. Михайлова, М. В. Фомина, С. Б. Киргизова // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2015. - № 10 (185). - С. 270-272.

9. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования/ Под редакцией М. О. Биргер. - М. : Медицина, 1982. - 462 с.

10. Фомина, М. В. Новый подход к антибактериальной терапии синуситов / М. В. Фомина, О. В. Кван, А. В. Быкова //Медицинский вестник Башкортостана. - 2013. - Т. 8, № 4. - С. 40-43.

УДК 616.831.31-005.4.-092.913:618.33

11. Формирование микробиоценоза слизистой оболочки верхних дыхательных путей с доминированием непатогенной или малопатогенной микрофлоры / А. Б. Киселев, В. А. Чаукина, О. В. Андамова [и др.] // Российская оториноларингология. - 2017. -№ 2 (87). - С. 137-141.

12. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity / J. A. Aas, B. J. Paster, L. N. Stokes [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 2005. - Vol. 43. - № 11. - P. 5721-5732.

13. Kreth, J. Bacterial and host interactions of oral streptococci / J. Kreth, J. Merritt, F. Qi // DNA and Cell Biology. - 2009. - Vol. 28. - № 8. P. 397-403.

14. Level of Streptococcus pyogenes in patients with recurrent tonsillitis and tonsillar hypertrophy / Ch. Skoulakis, E. Tigiroglou, K. Gkarelis [et al.] // Scand J. Infect Dis. - 2008. - № 40 (11-12). - P. 899-903.

15. The human oral microbiome / F. E. Dewhirst, T. Chen, J. Izard [et al.] // Journal of bacteriology. - 2010. - Vol. 192. - № 19. - P. 5002-50017.

16. The microbiota on different oral surfaces in healthy children / W. Papaioannou, S. Gizani, A. D. Haffajee [etal.]// J. Oral Microbiol. Immunol. - 2009. - № 24. - P. 183-189.

Е. И. БОНЬ, Н. Е. МАКСИМОВИЧ, С. М. ЗИМАТКИН, Н. А. ВАЛЬКО

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ НАРУШЕНИЯ НЕЙРОНОВ ТЕМЕННОЙ КОРЫ И ГИППОКАМПА КРЫС В ДИНАМИКЕ СУБТОТАЛЬНОЙ ЦЕРЕБРАЛЬНОЙ ИШЕМИИ

Гродненский государственный медицинский университет, Республика Беларусь

L. I. BON, N. YE. MAKSIMOVICH, S. M. ZIMATKIN, N. A. VALKO

MORPHOLOGICAL DISTURBANCES OF THE PARIETAL CORTEX

AND HIPPOCAMPUS NEURONS IN THE DYNAMICS OF SUBTOTAL CEREBRAL

ISCHEMIA

Grodno State Medical University, Republic Belarus

Бонь Елизавета Игоревна - к. б. н., старший преподаватель кафедры патологической физиологии им. Д. А. Маслакова УО «Гродненский государственный медицинский университет», Беларусь; e-mail: asphodela@list.ru

Максимович Наталия Евгеньевна - д. м. н., профессор, заведующая кафедрой патологической физиологии им. Д. А. Маслакова УО «Гродненский государственный университет», Беларусь

Зиматкин Сергей Михайлович - д. б. н., профессор, заведующий кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии УО «Гродненский государственный медицинский университет», Беларусь

РЕЗЮМЕ

Цель. Цель работы - анализ изменений морфологических характеристик нейронов таких филогенетически разных отделов коры головного мозга (теменной коры и гиппокампа) крыс в различные периоды при субтотальной экспериментальной церебральной ишемии.

Методика. Исследования проведены на 42 крысах. Забор материала осуществлялся через 1, 2, 3, 6 и 24 часа после операции. Субтотальную

церебральную ишемию моделировали путем наложения сосудистых зажимов на общие сонные артерии в условиях наркоза (в/в тиопентал натрия, 50-60 мг/кг массы тела).

Результаты. Проведено микроскопическое изучение размеров, формы, степени хроматофилии цитоплазмы и содержаниярибонуклеопротеинов в пирамидных нейронах филогенетически разных отделов коры головного мозга.

Заключение. В динамике субтотальной церебральной ишемии наблюдалось снижение размеров перикарионов нейронов, они становились более вытянутыми и менее округлыми. Снижалось количество нормохромных и гиперхромных нейронов, ко 2-3-му часу возрастала доля сморщенных нейронов, часть из которых к 6-му часу переходила в клетки с перицеллюлярным отеком. Выявленные нарушения сходным образом проявлялись в филогенетически разных отделах коры головного мозга, однако наступали раньше и были более выражены в теменной коре, как более чувствительной к недостатку кислорода.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ИШЕМИЯ, МОЗГ, НЕЙРОНЫ.

SUMMERY

Objective. The aim of the work is to analyze changes in the morphological characteristics of neurons of such phylogenetically different parts of the cerebral cortex (parietal cortex and hippocampus) of rats at different periods during subtotal experimental cerebral ischemia.

Methods. Studies conducted on 42 rats. Material was collected at 1, 2, 3, 6, and 24 hours after surgery. Subtotal cerebral ischemia was modeled by applying vascular clips to the common carotid arteries under anesthetic conditions ((intravenous thyopenthal, 50-60 mg/kg).

Results. A microscopic study of the size, shape, degree of chromatophilia of the cytoplasm and the content of ribonucleoproteins in pyramidal neurons of phylogenetically different parts of the cerebral cortex was carried out.

Conclusion. In the dynamics of subtotal cerebral ischemia, a decrease in the size of the perikaryon neurons was observed; they became more elongated and

less rounded. The number of normochromic and hy-perchromic neurons decreased, by 2-3 h an increase in the proportion of shriveled neurons, some of which by the 6 th hour passed into cells with pericellular edema. The revealed disorders were similarly manifested in phylogenetically different parts of the cerebral cortex, however, they occurred earlier and were more pronounced in the parietal cortex, as they are more sensitive to oxygen deficiency.

KEY WORDS: ISCHEMIA, BRAIN, NEURONS.

ВВЕДЕНИЕ

Ишемические повреждения головного мозга -по-прежнему одна из лидирующих причин заболеваемости, инвалидности и смертности в РБ [9], что предполагает необходимость проведения дальнейших исследований в этом направлении. В настоящее время достаточно глубоко раскрыты основные патогенетические звенья ишемических повреждений мозга. Ключевыми звеньями патогенеза церебральной ишемии являются остро возникающий недостаток поступления кислорода в мозг, угнетение в мозге аэробного и активация анаэробного пути утилизации глюкозы, снижение энергообразования, нарушение транспорта различных ионов, изменение кислотно-основного состояния [11, 12].

Энергетический дефицит в условиях ишемии мозга на начальных этапах вызывает ряд функциональных изменений: формируется ионный дисбаланс, ацидоз, повреждение рецепторного аппарата клеток, нарушается генерация биопотенциалов, наблюдается инактивация ферментов, в том числе антиоксидантной природы, страдают биосинтетические процессы. На более поздних стадиях развиваются структурные нарушения в виде дезорганизации клеточных мембран, в том числе митохондриальных, что еще в большей степени усугубляет дефицит энергии. Высвобождающиеся из разрушенных лизосом и клеток ферменты, ионы К+, Н+, Са2+ и продукты распада тканей, вызывая нарушение функционирования интактных клеток, способствуют распространению повреждения [11, 12].

Ранее проведенные исследования по изучению морфологических изменений нейронов

теменной коры и гиппокампа при одночасовой субтотальной церебральной ишемии головного мозга показали снижение размеров перикари-онов и увеличение количества гиперхромных и гиперхромных сморщенных нейронов [3, 10]. Вместе с тем представляет интерес количественное изучение изменения размеров, формы и степени хроматофилии цитоплазмы нейронов в различные периоды при субтотальной экспериментальной церебральной ишемии.

ЦЕЛЬЮ ИССЛЕДОВАНИЯ явился анализ изменений морфологических характеристик нейронов таких филогенетически разных отделов коры головного мозга (теменной коры и гиппокампа) крыс в различные периоды при субтотальной экспериментальной церебральной ишемии.

МЕТОДИКА

Эксперименты выполнены на 42 самцах беспородных белых крыс с начальной массой 240 ± 20 г с соблюдением требований Директивы Европейского Парламента и Совета № 2010/63/Еи от 22.09.2010 г. о защите животных, использующихся для научных целей. Животных содержали в кондиционируемом помещении (22 °С) при смешанном освещении на стандартном рационе вивария и свободном доступе к корму и воде, группами не более 5 особей в клетке вивария [5].

Использование крыс в качестве экспериментальных животных обусловлено сходством ангио-архитектоники и морфологии коры головного мозга у крыс и человека [2]. Субтотальную ишемию головного мозга (СИГМ) моделировали путем перевязки обеих общих сонных артерий в условиях внутривенного тиопенталового наркоза (40-50 мг/кг). Забор материала осуществлялся через 1, 2, 3, 6 и 24 часа после операции. После декапитации быстро извлекали головной мозг, кусочки переднего отдела коры больших полушарий фиксировали в жидкости Карнуа. Серийные парафиновые срезы окрашивали 0,1% толуиди-новым синим по методу Ниссля и на выявление рибонуклеопротеинов по Эйнарсону.

Изучение гистологических препаратов, их микрофотографирование, морфометрию и ден-ситометрию осадка хромогена в гистологических препаратах проводили с помощью микроскопа

Axioscop 2 plus (Zeiss, Германия), цифровой видеокамеры (LeicaDFC320, Германия) и программы анализа изображения ImageWarp (Bitflow, США). Локализацию теменной коры и гиппокампа коры в гистологических препаратах мозга крыс определяли с помощью стереотаксического атласа [14]. У каждого животного оценивали не менее 30 нейронов пятого слоя париетальной коры и пирамидного слоя поля СА1 гиппокампа, что обеспечивало достаточный объем выборки для последующего анализа. На парафиновых срезах определяли число больших пирамидных нейронов на единицу площади срезов коры головного мозга. Среди общего количества выделяли клетки по интенсивности окраски цитоплазмы (хроматофилии). Выделяли несколько типов: нормохромные - умеренно окрашенные; гиперхромные - темные; гиперхром-ные - очень темные, с деформированными пери-карионами; гипохромные - светло окрашенные; клетки-тени - светлые, неокрашенные, с пузырьковидными ядрами. Подсчитывалось количество каждого типа клеток.

После предварительной проверки на нормальность распределения показателей полученные данные анализировали методами непараметрической статистики с помощью программы Statistica 10.0 для Windows (StatSoft, Inc., США). Результаты представлены в виде Me (LQ; UQ), где Me - медиана, LQ - значение нижнего квартиля; UQ - значение верхнего квартиля. Различия между показателями контрольной и опытной групп считали достоверными при р < 0,05 (Mann - Whitney U-test) [1].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Размеры перикарионов нейронов теменной коры существенно уменьшились на 2-м часу, по сравнению с одночасовой СИГМ (на 11% (р < 0,05)), в то время как в гиппокампе значительное снижение площади наблюдалось только к 24 часам СИГМ (на 37,5% (р < 0,05)) (рис. 1).

Фактор элонгации возрастал к 1-м суткам СИГМ в обоих изучаемых отделах (на 17% (р < 0,05) и 12% (р < 0,05) соответственно) (рис. 2), в то время как форм-фактор претерпевал значительные изменения только в теменной коре уже спустя 2 часа после операции (рис. 3).

Площадь

80 70 60 N 50

I 40 8 30 20 10 0

1 час 2 часа 3 часа 6 часов 1 сутки

-♦-париетальная кора -в-гиппокамп

Рис. 1 - Динамика изменения площади перикарионов нейронов 5-го слоя теменной коры и пирамидного слоя гиппокампа крыс, * - р < 0,05 по сравнению с показателями при 1 часе

Рис. 2 - Динамика изменения фактора элонгации перикарионов нейронов 5-го слоя теменной коры и пирамидного слоя гиппокампа крыс, * - р < 0,05 по сравнению с показателями через 1 час

Рис. 3 - Динамика изменения форм-фактора перикарионов нейронов 5-го слоя теменной коры и пирамидного слоя гиппокампа крыс, * - р < 0,05 по сравнению с показателями через 1 час

Количество нормохромных нейронов как в теменной коре, так и в гиппокампе существенно снижалось к 6 часам СИГМ (на 38% (р < 0,05), по сравнению с изменениями через 1 час). Происходило постепенное уменьшение доли гиперхромных нейронов, в то время как

количество гиперхромных сморщенных возрастало, достигая максимума ко 2-3-м часам СИГМ в обоих исследуемых отделах. К 6 часам СИГМ появляются нейроны с перицеллюляр-ным отеком. В теменной коре их содержание на 25% (р < 0,05) было больше, чем в гиппокампе (рис. 4, 5).

Содержание рибонуклеопротеинов в цитоплазме пирамидных нейронов теменной коры и гиппокампа значительно возрастало к 3 часам СИГМ (рис. 6).

При ишемии головного мозга наблюдается увеличение количества гиперхромных нейронов. Иногда гиперхромные нейроны расцениваются как клетки с повышенным синтезом протеинов и РНК. Считается, что синтезированный белок идет на собственные их потребности [4], тогда как функциональная активность сморщенных нейронов угнетена. Деформация их перикарионов связана с необратимыми нарушениями водного баланса клетки [4, 6, 13].

Сморщивание гиперхромных нейронов при ишемии головного мозга является типовой формой реактивных и патологических изменений нейронов и сопровождается значительными нарушениями ультраструктуры органелл и метаболизма [13].

На электронно-микроскопическом уровне в их цитоплазме наблюдается уплотнение органелл. При этом цитоплазма и ядро гиперхромных сморщенных нейронов уменьшены в объеме, что привело к увеличению плотности расположения рибосом (соответственно и рибонуклеопротеинов) и гиперхроматозу. Количество рибосом на внешней мембране кариолеммы значительно больше, чем у животных контрольной группы. Отмечается смещение ядрышка к периферии ядра и увеличение концентрации рибонуклеопротеинов вследствие их выхода из ядрышка и значительное возрастание количества свободных рибосом в цитоплазме нейронов крыс опытной группы [7, 8]. В гиперхромных сморщенных нейронах снижаются обменные процессы, распад нуклеопротеинов, особенно ядерных, превалирует над их синтезом. Запасы частиц рибонуклео-протеинов в ядре сохраняются, но блокируется

2 1,5

| 1

I

0,5 0

Фактор элонгации

1 час 2 часа 3 часа 6 часов 1 сутки

-♦-париетальная кора -и-гиппокамп

*

Форм-фактор

0,9

1 час 2 часа 3 часа б часов 1 сутки

-♦-париетальная кора -и-гиппокамп

- W

i Й i f &

* âéi .*■■

i't* .''У*

I 42 о . T * I. 1 1 ■ *

A

1 ». J. à

4*. -1

Б

• л.

« ч ••> » *

Я * • V ♦ '

Б

»

Д

^^ '/ 7

s _

p - />

_:_t

I « , P

V i .

• 1 - irtiii-Л ',>¿5

■

Рис. 4 - Нейроны пятого слоя теменной коры (А, В, Д) и пирамидного слоя гиппокампа (Б, Г, Е). А, Б - 1 час СИГМ, В, Г - 3 часа СИГМ (преобладание гиперхромных сморщенных нейронов), Д, Е - 1 сутки СИГМ (нейроны с перицеллюлярным отеком).

Цифровая микрофотография. Окраска по Нисслю. Ув. объектива: х40

их выведение в цитоплазму. В гиперхромных сморщенных нейронах глыбки хроматофильного вещества и нейрофибриллы обычно склеиваются, и тогда клетки начинают диффузно и очень интенсивно прокрашиваться тионином по методу Ниссля [7, 8, 13].

В зависимости от условий функционирования нейроны с начальными признаками гипер-и гипохромии либо превращаются в клетки-тени (гипохромные), либо в сморщенные гиперхром-ные нейроны с последующим колликвационным и коагуляционным некрозом или апоптозом [7].

На поздних этапах ишемии наблюдается распад и расплавление нейрофибрилл, пикноз ядер, распад отростков. Нейропиль вакуолизируется и фрагментируется, претерпевая зернисто-глыб-чатый распад, а миелин растворяется, вследствие чего по ходу нервных волокон начинают выявляться капельки липидов. Синапсы набухают,

A

Сз% 15%

22% \ 8%

47%

у%

14% \ 25%

18%

Б

48%

9%

Б

45%

4%

4%

21%

Wo

16% \ 23%

10%

45%

16% 15%

9%

20%

Д

35%

36%

Е

□ Сморщенные I Тени Гиперхромные

Нормохромные □ Гипохромные В Отёчные

Рис. 5 - Соотношение нейронов с различной степенью хроматофилии цитоплазмы пирамидного слоя гиппокампа (А, В, Д) и пятого слоя теменной коры головного мозга (Б, Г, Е). А, Б - 1 час СИГМ, В, Г - 3 часа СИГМ, Д, Е - 1 сутки СИГМ

РНК

S 0,45

ь

о т 0,4

ё 0,35

с »X 0,3

£ и 0,25

У s 0,2

с о 0,15

л 0,1

X 0,05

з 0

1 час 2 часа 3 часа 6 часов 1 сутки -«-париетальная кора -ш-гиппокамп

Рис. 6 - Динамика изменения содержания рибонуклеопротеинов в цитоплазме нейронов 5-го слоя теменной коры и пирамидного слоя гиппокампа крыс

разрушаются и исчезают. Вероятно, именно эти изменения создают картину нейронов с перицеллюлярным отеком [7, 8].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ Таким образом, в динамике субтотальной церебральной ишемии наблюдалось снижение

размеров перикарионов нейронов, они становились более вытянутыми и менее округлыми. Снижалось количество нормохромных и гиперхром-ных нейронов, ко 2-3-му часу возрастала доля сморщенных нейронов, часть из которых к 6-му часу переходила в клетки с перицеллюлярным

отеком. Выявленные нарушения сходным образом проявлялись в филогенетически разных отделах коры головного мозга, однако развивались раньше и были более выражены в теменной коре, как более чувствительной к недостатку кислорода области головного мозга.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Батин, Н. В. Компьютерный статистический анализ данных: учеб.-метод. пособие. - Минск : Институт подготовки научных кадров Национальной Академии Наук Беларуси. - 2008. - 235 с.

2. Бонь, Е. И. Микроскопическая организация изо-кортекса крысы / Е. И. Бонь, С. М. Зиматкин // Новости медико-биологических наук. - 2017. -№ 4. - С. 80-88.

3. Бонь, Е. И. Морфофункциональные нарушения в гиппокампе крыс при субтотальной ишемии / Е. И. Бонь, Н. Е. Максимович, С. М. Зиматкин // Вестник Смоленской государственной медицинской академии. - 2018. - N1. - С. 24-29.

4. Зиматкин, С. М. Темные нейроны мозга / С. М. Зиматкин, Е. И. Бонь// Морфология. - 2017. -№ 6. - С. 81-86.

5. Каркищенко, Н. Н. Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских исследованиях / Н. Н. Каркищенко, С. В. Грачева. - М.: Профиль-2С, 2010. - 241 с.

6. Попова, Э. Н. Ультраструктура мозга, алкоголь и потомство: монография/ Э. Н. Попова. - М.: Научный мир, 2010. - 155 с.

7. Семченко, В. В. Постаноксическаяэнцефалопатия/ В. В. Семченко, С. С. Степанов, Г. В. Алексеева. -Омск, 1999. - 448 с.

8. Ярыгин, Н. Е., Ярыгин Н. Н. Патологические и приспособительные изменения нейрона / Н. Е. Ярыгин, Н. Н. Ярыгин. - М.: Медицина, 1973. - 190 с.

9. Adam, A. Cerebrovascular desorders / А. Adam // Stroke. - 1989. - К 20. - P. 674-679.

10. Bon, L. I. Effects of experemental cerebral ishemia on metabolic characteristics of parietal cortex neurons / L. I. Bon, N. Ye. Maksimovich, S. M. Zimatkin // Bio-process Engineering. - 2018. - N 2 (1). - P. 1-5.

11. Chen, H. The role of Na-K-Cl co-transporter in cerebral ischemia / H. Chen // Neurol. Res. - 2005. - V. 27. -P. 280-286.

12. Clemens, J. A. Cerebral ischemia: gene activation, neuronal injury, and the protective role of antioxidants / J. A. Clemens // Free Radic. Biol. Med. - 2000. - Vol. 28. - P. 1526-1531.

13. Gallyas, F. Supravital microwave experiments support that the formation of «dark» neurons is propelled by phase transition in an intracellular gel system /

F. Gallyas, J. Pal, P. Bukovics //Brain Research. - 2009. -N1270. - P. 152-156.

14. Paxinos, G. The Rat Brain in stereotaxic coordinates /

G. Paxinos, C. Watson. - Academic Press, Australia, 1998. - 242 p.