CC BY
18
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 616.831.31-005.4.-092.913:618.33
ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ НЕЙРОНОВ ТЕМЕННОЙ КОРЫ У КРЫС С СУБТОТАЛЬНОЙ ЦЕРЕБРАЛЬНОЙ ИШЕМИЕЙ ПРИ СОЧЕТАННОМ ВВЕДЕНИИ ЬМАМЕ И ЬАРГИНИНА
© Бонь Е.И., Максимович Н. Е., Зиматкин С.М., Валько Н.А., Кот В.Н., Неделько Э.А.
Гродненский государственный медицинский университет, Гродно, Беларусь, 230009, ул. Горького, 80
Резюме
Цель. Изучение гистологических изменений в теменной коре головного мозга крыс при субтотальной церебральной ишемии на фоне сочетанного введения L-NAME, а также его совместного применения с L-Аргинином.
Методика. Эксперименты выполнены на 24 самках беспородных белых крыс с начальной массой 210±20 г. Субтотальную ишемию головного мозга (СИГМ) моделировали путем перевязки общих сонных артерий. Крысам группы СИГМ+L-NAME до перевязки общих сонных артерий вводили неселективный ингибитор NO-синтазы - L-NAME. Крысам группы СИГМ+L-NAME+L-Аргинин дополнительно вводили L-Аргинин одновременно с L-NAME. Животных декапитировали после 60-минутной ишемии.
Результаты. При субтотальной церебральной ишемии в теменной коре происходят существенные морфологические изменения - снижение размеров и деформация перикарионов нейронов и появление большого количества гиперхромных нейронов. На фоне введения L-NAME нарушения более выраженными. При дополнительном введении L-Аргинина негативные изменения, вызванные L-NAME, корригировались.
Заключение. Таким образом, введение неселективного ингибитора NO-синтазы L-NAME усугубляло гистологические нарушения нейронов теменной коры при субтотальной церебральной ишемии. Применение L-Аргинина оказывало корригирующее воздействие, обусловленное как его непосредственным антигипоксическим влиянием, так и опосредованным, за сч'т синтеза N0.
Ключевые слова: церебральная ишемия, нейроны, L-NAME, L-Аргинин
HISTOLOGICAL CHANGES OF THE NEURONS OF THE RATS PARIETAL CORTEX WITH SUBTOTAL CEREBRAL ISCHEMIA WITH COMBINED INTRODUCTION L-NAME AND L-ARGININE Bon' E.I., Maksimovich N.Ye., Zimatkin S.M., Valko N.A., Kot V.N., Nedelko E.A.
Grodno State Medical University, 80, Gorkogo St., 230009, Grodno, Republic Belarus
Abstract
Objective. To study the histological changes in the parietal cortex of the rat brain during subtotal cerebral ischemia on the background of the combined administration of L-NAME, as well as its combined use with L-Arginine.
Methods. The experiments were performed on 24 female outbred white rats with an initial weight of 210±20 g. Subtotal cerebral ischemia (SCI) was modeled by ligation of the common carotid arteries. Prior tothe ligation of the common carotid arteries the rats of the SCI + L-NAME group were injected with a non-selective inhibitor of NO-synthase - L-NAME. The rats of the SCI + L-NAME + L-Arginine group were additionally injected with L-Arginine simultaneously with L-NAME. The animals were decapitated after 60 minutes of ischemia.
Results.In subtotal cerebral ischemia, significant morphological changes occur in the parietal cortex -reduction in size and deformation of the neurons perikaryons and the appearance of a large number of hyperchromic neurons. On the background of the introduction of L-NAME the violations were more pronounced. With the additional introduction of L-Arginine, the negative changes caused by L-NAME were corrected.
Conclusion. Thus, the introduction of the non-selective inhibitor of NO-synthase L-NAME aggravated the histological disorders of the neurons of the parietal cortex during subtotal cerebral ischemia. The use of L-Arginine has a corrective effect, both due to its direct antihypoxic effect, and indirectly, due to the synthesis of NO.
Keywords: cerebral ischemia, neurons, L-NAME + L-Arginine
Введение
Ишемические повреждения головного мозга - по-прежнему одна из лидирующих причин заболеваемости, инвалидности и смертности в Беларуси, что предполагает необходимость проведения дальнейших исследований в этом направлении [9]. Особая роль в патогенезе ишемии оксиду азота, NO который образуется в головном мозге при участии нейрональных и экстранейрональных источников, образуя «нитрергическую систему» головного мозга [7, 8, 14]. Образование NO происходит из аминокислоты L-Аргинин, являющейся субстратом NO-синтазы (NOS). Ряд исследований ишемических повреждений головного мозга свидетельствует о том, что оксид азота может оказывать как защитное, так и повреждающее действие. Благоприятные NO эффекты (вазодилатация, антивоспалительное, антиатерогенное, антитромбогенное действие и др.) реализуются через эндотелиальную изоформу NOS, а негативные - посредством избыточной активации нейрональной и индуцибельной [6, 7, 9].
Неселективный ингибитор NOS этиловый эфир Nra-нитрон-аргинин Methyl
Ester (L-NAME)) угнетает все изоформы фермента, в том числе эндотелиальную, что приводит к уменьшению антигипоксической резистентности, увеличению агрегации тромбоцитов и снижению мозгового кровотока [6].
Одной из перспективных аминокислот-нейропротекторов, является L-Аргинин. L-Аргинин обладает антигипоксическим, противоболевым, противовоспалительным, антиатерогенным и антиагрегатными свойствами. Большинство эффектов, вызываемых данной аминокислотой, связано с ее способностью увеличивать образование NО, выступая в качестве источника для его образования. Показано, что использование L-Аргинина уменьшает размеры инфаркта, снижает тонус сосудов и вызывает гипотензивный эффект, предупреждает и корригирует ишемические и реперфузионные повреждения головного мозга и других органов [6-9].
Эффекты L-NAME и L-Аргинина показаны в экспериментах с помощью биохимических методов и функциональных проб, однако количественного морфологического изучения последствий сочетанного введения L-NAME и L-Аргинина в условиях субтотальной церебральной ишемии не проводилось.
Целью работы явилось изучение гистологических изменений в теменной коре головного мозга крыс при субтотальной церебральной ишемии на фоне сочетанного введения L-NAME, а также его совместного применения с L-Аргинином.
Методика
Эксперименты проведены на 24 самках беспородных белых крыс массой 210±20 г. В ходе исследования соблюдались все требования Директивы Европейского Парламента и Совета №2010/63/EU от 22.09.2010 о защите животных, использующихся для научных целей [12]. Животных содержали в проветриваемом помещении при температуре 22°С при достаточном освещении. Крысы находились на стандартном рационе вивария, им был обеспечен свободный доступ к корму и воде. В одной клетке находилось не более пяти особей. Использование крыс в качестве экспериментальных животных обусловлено сходством ангиоархитектоники и морфологии коры головного мозга у крыс и человека [3, 4].
Контрольную группу составили ложнооперированные крысы, которым производился разрез кожи и внутривенно вводили изотонический раствор NaCl. Субтотальную ишемию головного мозга (СИГМ) моделировали путем перевязки обеих общих сонных артерий в условиях внутривенного тиопенталового наркоза (40-50 мг/кг). Крысам группы СИГМ+L-NAME до перевязки общих сонных артерий вводили неселективный ингибитор NOS - L-NAME в дозе 5мг/кг. Крысам группы СИГМ+L-NAME+L-Аргинин дополнительно вводили L-Аргинин в дозе 200 мг/кг одновременно с L-NAME. Животных декапитировали после 60-минутной ишемии.
После декапитации производили извлечение головного мозга, стандартно выделенные участки коры больших полушарий, содержащие и теменную кору, фиксировали в жидкости Карнуа. На микротоме готовили серийные парафиновые срезы и окрашивали их 0,1% толуидиновым синим по методу Ниссля. Изучение гистологических препаратов, их микрофотографирование, морфометрию и денситометрию осадка хромогена в гистологических препаратах проводили с помощью микроскопа Axioscop 2 plus (Zeiss, Германия), цифровой видеокамеры (LeicaDFC 320, Германия) и программы анализа изображения ImageWarp (Bitflow, США). Локализацию теменной коры в гистологических препаратах мозга крыс определяли с помощью стереотаксического атласа [13]. В препарате, приготовленном из материала от одного животного, оценивали не менее 30 нейронов, a в каждой экспериментальной группе - 150 нейронов пятого слоя теменной коры, что обеспечивало достаточный объем выборки.
Для статистического анализа полученных в эксперименте данных использовали методы непараметрической статистики (программа Statistica 10.0 для Windows, StatSoft, Inc., США). В описательной статистике для каждого показателя определяли значения медианы (Ме), границы процентилей (от 25 до 75). Количественные результаты представлены в виде Me (LQ; UQ), где Me - медиана, LQ - нижняя граница нижнего квартиля; UQ - верхняя граница верхнего квартиля. Достоверными считали различия между контрольной и опытной группами при значениях р<0,05 (тест Краскелла-Уоллиса с поправкой Бонферони) [1].
Результаты исследования
В условиях субтотальной церебральной ишемии наблюдалось значительное снижение размеров перикарионов нейронов, увеличивалась их вытянутость и уменьшалась округлость. В наибольшей степени форм-фактор изменялся при введении L-NAME, однако дополнительное введение L-Аргинина корригировало эффект неселективного ингибитора NOS (табл. 1).
Таблица 1. Размеры и форма перикарионов нейронов
Группы животных Показатели морфометрии
2 площадь, мкм фактор элонгации, ед. форм-фактор, ед.
Контроль 144,6(130,5;153,8) 1,2(1,1;1,2) 0,9(0,9;0,9)
СИГМ 69(67;73,6)* 1,5(1,4;1,5)* 0,8(0,8;0,85)*
СИГМ+L-NAME 61,5(58,8;63,6)* 1,4(1,4;1,5)* 0,67(0,6;0,7)+
СИГМ+Ь-МЛМБ+Ь-Аргинин 83,5(39,3;99,8)* 1,5(1,4;1,65)* 0,76(0,7;0,8)#
Примечание: * - р<0,05 по сравнению с контролем, + - р<0,05 по сравнению с СИГМ, # - р<0,05 по сравнению с СИГМ+Ь-ЫАМБ, где СИГМ - субтотальная ишемия головного мозга, ^ЫЛМБ - Кю-нитро-Ь-аргинин
В условиях субтотальной церебральной ишемии в теменной коре наблюдалось снижение количества нормохромных нейронов и увеличение количество гиперхромных, гиперхромных сморщенных нейронов и клеток-теней (р<0,05) (табл. 2). У животных группы (ИГМ+Ь-ЫАМБ) количество гиперхромных несморщенных нейронов уменьшалось, но при этом происходило увеличение доли гиперхромных сморщенных нейронов (р<0,05) по сравнению с группой СИГМ. При сочетанном введении Ь-ЫЛМБ и Ь-Аргинина соотношение разных по степени хроматофилии нейронов не отличалось от такового в группе СИГМ (р>0,05) (рис. 1).
Таблица 2. Типы нейронов по степени хроматофилии цитоплазмы
Группы животных Типы нейроны
нормохромные гиперхромные гиперхромные сморщенные клетки-тени
Контроль 3283(3216;3283) 201(201;268) 134(67;134) 134(0;134)
СИГМ 2043(1943;2077)* 938(804;938)* 670(670;670)* 335(269;402)*
СИГМ+L-NAME 1976,5(1943;2010)* 603(536;670)+ 938(938;938)+ 335(268;402)*
СИГМ+ЫЧЛМБ+Ь-Аргинин 2043(1941;2143)* 941(941;941)# 672(538;672)# 404(269;404)*
Примечание: * - р<0,05 по сравнению с контролем, + - р<0,05 по сравнению с СИГМ, # - р<0,05 по сравнению с СИГМ+Ь-ЫЛМБ, где СИГМ - субтотальная ишемия головного мозга, ^Ь-КЛМБ - Ыю-нитро-Ь-аргинин
3 : а ' J* н \ шшк'М о 0 ь ^ & à * " « • v v ■ * V 0 * ' P S.
Щ% » у Ы* Л / Г A AÀ ' л' Jf > ' / ■ v "il ' j* s s ** В 1 A*. Jf ■ /-» w - щшш л
Рис. 1. Нейроны пятого слоя теменной коры. А - контроль (преобладание нормохромных нейронов). Б - ИГМ (преобладание гиперхромных нейронов). В - ИГМ+L-NAME (преобладание гиперхромных сморщенных нейронов), Г - L-NAME+L-Аргинин+СИГМ (преобладание гиперхромных нейронов). Цифровая микрофотография. Окраска по Нисслю
При субтотальной церебральной ишемии в теменной коре происходят существенные морфологические изменения - снижение размеров и деформация перикарионов нейронов, появление большого количества гиперхромных нейронов, которые часто расцениваются в качестве маркеров ишемии [2, 5, 11]. Интенсивная окраска их цитоплазмы обусловлена существенным преобладанием доли свободных рибосом, образующих обширные скопления. Фиксация рибосом к мембранам гранулярной эндоплазматической сети является энергозависимым процессом, обеспечиваемым белком рибофорином. Поэтому дегрануляция цистерн гранулярной эндоплазматической сети свидетельствует о нарастающем энергодефиците. Дегенеративные изменения гранулярной эндоплазматической сети приводит к накоплению синтезированных белков в цитоплазме. Под воздействием развивающейся гипоксии и ацидоза нарастает их денатурация. Сморщивание гиперхромных нейронов является результатом потери воды из-за энергетических и ионных нарушений, которые обусловливают снижение размеров и деформацию перикарионов. Сморщенные нейроны утрачивают функциональную активность и в последующим фагоцитируются микроглией [5].
На фоне введения L-NAME нарушения более выраженными, что может быть опосредовано блокированием эндотелиальной NOS. Это согласуется с данными о снижении антигипоксической резистентности организма и активации оксидативных процессов [7-9].
При дополнительном введении L-Аргинина негативные изменения, вызванные L-NAME, корригировались. Эти эффекты L-Аргинина при церебральной ишемии могут быть связаны как с его непосредственным антиоксидантным и антигипоксическим влиянием, так и с непрямым действием, обусловленным образованием NО [6, 9].
Заключение
Таким образом, введение неселективного ингибитора КО-синтазы Ь-КЛМЕ усугубляло гистологические нарушения нейронов теменной коры при субтотальной церебральной ишемии (происходило увеличение количества сморщенных нейронов, более выражена была деформация их перикарионов). Применение Ь-Аргинина оказывало корригирующее воздействие, обусловленное как его непосредственным антигипоксическим влиянием, так и опосредованным, за счет синтеза N0.
Работа выполнена при поддержке БРФФИ (проект М18М-036).
Литература (references)
1. Батин Н.В. Компьютерный статистический анализ данных: учеб.-метод. пособие. - Минск.: Институт подготовки научных кадров Национальной Академии Наук Беларуси - 2008. - 235 с. [Batin N.V.
Komp'yuternyy statisticheskiy analiz dannykh. Computer statistical data analysis: proc. Method. allowance. -Minsk: Institute for the Training of Scientific Personnel of the National Academy of Sciences of Belarus, 2008. -235 p. (in Russian)]
2. Бонь Е.И., Максимович Н.Е., Зиматкин С.М. Гистологические изменения в париетальной коре и гиппокампе крыс после субтотальной церебральной ишемии // Журнал ГрГМУ. - 2018. - N4. - С. 419423. [Bon E.I., N.Ye. Maksimovich, S.M. Zimatkin. Zhurnal GrGMU. Journal of GrSMU. - 2018. - N4. - С. 419-423. (in Russian)]
3. Бонь Е.И., Зиматкин С.М. Микроскопическая организация изокортекса крысы // Новости медико-биологических наук. - 2017. - №4. - С. 80-88. [Bon E.I., Zimatkin S.M. Novosti mediko-biologicheskikh nauk. News of Biomedical Sciences. - 2017. - N4. - P.80-88. (in Russian)]
4. Бонь Е.И., Максимович Н.Е. Морфологические представления о кровообращении головного мозга крысы // Вестник ВГМУ. - 2018. - N2. - С. 30-36. [Bon E.I., N.Ye. Maksimovich. Vestnik VGMU. Bulletin of VSMU. - 2018. - N2. - С. 30-36. (in Russian)]
5. Бонь Е.И., Максимович Н.Е. Способы моделирования и морфофункциональные маркеры ишемии головного мозга // Биомедицина. - 2018. - N2. - С. 59-71. [Bon E.I., N.Ye. Maksimovich. Biomedicina. Biomedicine. - 2018. - N2. - С. 59-71. (in Russian)]
6. Максимович Н. Е. Агрегация тромбоцитов при модуляции пути L-Аргинин-NO у крыс с ишемией головного мозга // Патофизиология и экспериментальная терапия. - 2005. - N4. - С. 14-15. [Maksimovich N.Ye. Patofiziologiya i eksperimental'naya terapiya. Pathophysiology and experimental therapy. - 2005. - N4. -С. 14-15. (in Russian)]
7. Максимович, Н. Е. Понятие о нитроксидергической системе мозга. Роль нейрональных источников // Журнал Гродненского государственного медицинского университета. - 2003. - N4. - С. 7-11. [Maksimovich N.Ye. Zhurnal GrGMU. Journal of GrSMU. - 2003. - N4. - С. 7-11. (in Russian)]
8. Максимович, Н. Е. Понятие о нитроксидергической системе мозга. Роль экстранейрональных источников // Журнал Гродненского государственного медицинского университета. - 2004. - №1. - С. 3-5. [Maksimovich N.Ye. Zhurnal GrGMU. Journal of GrSMU. - 2004. - N1. - С. 3-5. (in Russian)]
9. Максимович, Н. Е. Роль оксида азота в патогенезе ишемических и реперфузионных повреждений мозга: монография. - Гродно, ГрГМУ, 2004. - 178 с. [Maksimovich, N. Ye. Rol' oksida azota v patogeneze ishemicheskikh i reperfuzionnykh povrezhdeniy mozga. The role of nitric oxide in the pathogenesis of ischemic and reperfusion brain damage: a monograph. - Grodno, GrSMU, 2004. - 178 p. (in Russian)]
10. Смертность в Республике Беларусь: офиц. стат. сб. за 2016-2017 гг. - Минск: ГУ РНМБ, 2018. - 236 с. [Smertnost' v Respublike Belarus. Mortality in the Republic of Belarus: official stat. Sat for 2016-2017 - Minsk: GU RNMB, 2018. - 236 p. (in Russian)]
11. Bon L.I., Maksimovich N.Ye., Zimatkin S.M. Effects of experemental cerebral ishemia on metabolic characteristics of parietal cortex neurons // Bioprocess Engineering. - 2018. - N2(1). - P. 1-5.
12. Directive 2010/63/EU of the Ruropean Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes: text with EEA relevance 20.10.2010. - Strasbourg: Official Journal of the European Union, 2010. - 46 p.
13. Paxinos G., Watson C. The Rat Brain in stereotaxic coordinates. - Academic Press, Australia, 1998. - 242 p.
14. Prado R. Endothelium-derived nitric oxide synthase inhibition effects on cerebral blood flow, pial artery diameter, and vascular morphology in rats // Stroke. - 1992. - V.23. - P. 1118-1124.
Информация об авторах
Бонь Елизавета Игоревна - кандидат биологических наук, старший преподаватель кафедры патологической физиологии им. Д.А. Маслакова УО «Гродненский государственный медицинский университет», Беларусь. E-mail: asphodela@list.ru
Зиматкин Сергей Михайлович - доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии УО «Гродненский государственный университет», Беларусь. E-mail: smzimatkin@mail.ru
Максимович Наталия Евгеньевна - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой патологической физиологии им. Д.А. Маслакова УО «Гродненский государственный университет», Беларусь. E-mail: mne@grsmu.by
Валько Никита Андреевич - студент УО «Гродненский государственный университет», Беларусь. E-mail: sumeresto@gmail.com
Кот Виктория Николаевна - студентка УО «Гродненский государственный университет», Беларусь. E-mail: vika_kot_1999@mail.ru
Неделько Эдвард Александрович - студент УО «Гродненский государственный университет», Беларусь. E-mail: asphodela@list.ru
