CC BY
57
УДК 616.831.31-005.4.-092.913:618.33
МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ НАРУШЕНИЯ В ГИППОКАМПЕ КРЫС ПОСЛЕ СУБТОТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ
© Бонь Е.И., Максимович Н.Е., Зиматкин С.М.
Гродненский государственный медицинский университет, 230009, Беларусь Гродно, ул. Горького, 80
Резюме
Цель. Изучение морфофункциональных нарушений в гиппокампе крыс с субтотальной ишемией головного мозга.
Методика. Опыты выполнены на самках беспородных белых крыс массой 230±20 г. Субтотальную ишемию головного мозга моделировали путем перевязки обеих общих сонных артерий в условиях внутривенного тиопенталового наркоза (40-50 мг/кг).
Результаты. Исследованы гистологические и гистохимические характеристики нейронов поля СА1 гиппокампа крыс в условиях субтотальной ишемии. Происходит уменьшение количества нормохромных и увеличение числа патологических форм нейронов, значительно изменяются их размеры и форма, отмечается снижение активности дегидрогеназ: НАДН, сукцината, глюкозо-6-фосфата, возрастание активности лактатдегидрогеназы и кислой фосфатазы.
Выводы. Субтотальная ишемия головного мозга приводит к значительным морфологическим изменениям нейронов и нарушению энергетического обмена в гиппокампе крыс.
Ключевые слова: нейроны, гиппокамп, ишемия
MORPHOFUNCTIONAL DISTURBANCES IN THE HIPPOCAMPUS OF RATS AFTER INCOMPLETE ISCHEMIA
Bon L.I., Maksimovich N.Ye., Zimatkin S.M.
Grodno State Medical University, 80, Gorkogo St., 230009, Grodno, Republic Belarus
Abstract
Objective. The objective was to study morphofunctional disorders of neurons in hippocampus of rats after incomplete cerebral ischemia.
Methods. The experiments were performed on female white rats weighing 230±20 g. Incomplete cerebral ischemia was modeled by ligation of both common carotid arteries under intravenous thiopental anesthesia (40-50 mg/kg).
Results. Histological and histochemical characteristics of CA1 hippocampal field neurons in rats under incomplete cerebral ischemia were studied. There was a decrease in the amount of normochromic and an increase in the number of pathological forms of neurons, their size and shape changed significantly, dehydrogenases activity decrease: NADH, succinate, glucose-6-phosphate, an increase in lactate dehydrogenase and acid phosphatase activity.
Conclusion. Incomplete cerebral ischemia leads to significant morphological changes and severe energy deficiency of the hippocampal neurons in rats.
Keywords: neurons, hippocampus, ischemia
Введение
В структуре заболеваемости и смертности во всем мире лидирующие позиции занимают цереброваскулярные заболевания, ведущими среди которых являются ишемические повреждения головного мозга (ГМ). Церебральная ишемия представляет собой тяжелое нейродегенеративное состояние, которое, в зависимости от затронутой области, приводит к нарушению когнитивных и моторных функций центральной нервной системы. Даже кратковременная ишемия головного мозга (ИГМ) ведет к его глубоким повреждениям [9]. Ключевыми звеньями патогенеза ИГМ являются: недостаток оксигенации нейронов, угнетение в мозге аэробного и активация
24
анаэробного пути утилизации глюкозы, снижение энергообразования, нарушение транспорта потенциал-определяющих ионов, изменение кислотно-основного состояния, эксайтотоксичность, активация воспалительного процесса, возникновение окислительного и нитрозативного стресса, апоптоза [5]. Нейроны коры головного мозга и, в том числе, гиппокампа являются наиболее чувствительными к недостатку кислорода. Функциональные и биохимические признаки повреждения нейронов выявляются уже после 2-минутной ИГМ. Морфологические нарушения гиппокампа проявляются в изменении размеров и формы нейронов, сателлитоза, нейронофагии, дезорганизации клеточных слоев, хроматолизе, кариопикнозе и апоптозе [8].
Гиппокамп находится в глубине больших полушарий ГМ, относится к обонятельному мозгу и является компонентом лимбической системы. Согласно одной из классификаций, гиппокамп вместе с обонятельной корой относят к древней коре (архикортекс), согласно другой - к старой (палеокортекс). Он обеспечивает пространственную ориентацию, играет важную роль в обонятельных и оборонительных реакциях, имеет важное значение в процессах обучения и памяти. При повреждении гиппокампа ухудшается ориентация в пространстве, развивается ретроградная амнезия, затрудняется выработка условных рефлексов, в результате чего теряется способность к обучению. Согласно современной гистологической номенклатуре в собственно гиппокампе выделяют 3 слоя: 1) молекулярный, включающий эумолекулярный, лакунарный и радиальный подслой 2) пирамидный и 3) краевой слой. Основным слоем гиппокампа является пирамидный, содержащий пирамидные, корзинчатые, триламинарные нейроны и клетки-канделябры [8].
Целью работы явилось изучение влияния субтотальной ИГМ на морфофункциональные характеристики нейронов пирамидного слоя поля СА1 гиппокампа ГМ крыс.
Методика
Эксперименты выполнены на 20 самках беспородных белых крыс массой 230±20 г. При проведении экспериментов соблюдались все требования Директивы Европейского Парламента и Совета №2010/63/EU от 22.09.2010 о защите животных, использующихся для научных целей [6]. Крыс содержали в кондиционируемом помещении (22°С) при смешанном освещении на стандартном рационе вивария и свободном доступе к корму и воде, группами не более 5-ти особей в клетке. Субтотальную ИГМ моделировали путем перевязки обеих общих сонных артерий в условиях внутривенного тиопенталового наркоза (40-50 мг/кг). Животных декапитировали после 60-минутной ишемии. Контрольную группу (контроль) составили ложнооперированные крысы аналогичных пола и массы, которым не производилась перевязка сосудов.
После декапитации быстро извлекали ГМ, кусочки переднего отдела коры головного мозга фиксировали в жидкости Карнуа. Серийные парафиновые срезы окрашивали 0,1% толуидиновым синим по методу Ниссля и на выявление рибонуклеопротеинов (РНП) по Эйнарсону. Для гистохимического исследования ферментов кусочки коры гиппокампа замораживали в жидком азоте. В срезах толщиной 10 мкм, изготовленных в криостате Leica CM 1840, Германия (-12°С), в нейронах пирамидального слоя поля СА1 гиппокампа определяли активность дегидрогеназ: НАДН (НАДН-ДГ: акцептор - оксидоредуктаза; КФ 1.6.93.3; по Нахласу и др., 1958), сукцината (СДГ: акцептор - оксидоредуктаза; КФ 1.3.99.1; по Нахласу и др., 1957), глюкозо-6-фосфата (Г-6-Ф-ДГ, Б-глюкозо-6-фосфат: НАДФ-оксиредуктаза; КФ 1.1.1.49; по Гесс, Скарпелли, Пирсу, 1958), лактата (ЛДГ; L = лактат: НАД-оксидоредуктаза; КФ 1.1.1.27; по Гесс и др., 1958) и маркерного фермента лизосом - кислой фосфатазы (КФ, фосфогидролаза моноэфиров ортофосфорной кислоты; КФ 3.1.3.2; по Гомори, 1950) [2]. Изучение гистологических препаратов, их фотографирование, морфометрию и денситометрию осадка хромогена в гистологических препаратах проводили с помощью микроскопа Axioscop 2 plus (Zeiss, Германия), цифровой видеокамеры (LeicaDFC 320, Германия) и программы анализа изображения ImageWarp (Bitflow, США). Расположение гиппокампа в гистологических препаратах мозга крыс определяли с помощью стереотаксического атласа [7]. У каждого животного оценивали не менее 30 нейронов пирамидного слоя поля СА1 гиппокампа, что обеспечивало достаточный объем выборки для последующего анализа. После предварительной проверки на нормальность распределения показателей полученные данные анализировали методами непараметрической статистики с помощью программы Statistica 10.0 для Windows (StatSoft, Inc., США). Результаты представлены в виде Me(LQ;UQ), где Me - медиана, LQ - значение нижнего квартиля; UQ - значение верхнего квартиля. Различия между показателями контрольной и опытной групп считали достоверными при р<0,05 (Mann-WhitneyU-test) [1].
Результаты исследования
У крыс после ИГМ в пирамидном слое гиппокампа выявлено уменьшение количества нормохромных нейронов и увеличение количества патологических форм нейронов (гипер-, гипохромных нейронов и клеток-теней) (рис. 1, 2) по сравнению с их значением в контроле. Так, количество гиперхромных нейронов увеличилось на 10% (р<0,05), гиперхромных сморщенных клеток - на 13%, по сравнению с контролем (р<0,05).
Рис. 1. Нейроны пирамидного слоя поля СА1 гиппокампа. А - контроль (преобладание нормохромных нейронов). Б - ИГМ (преобладание гиперхромных и гиперхромных сморщенных
В нормохромные
гиперхромные
Ш гиперхромные сморщенные
" гипохромные клетки-тени
Рис. 2. Соотношение форм нейронов с различной степенью хроматофилии цитоплазмы в гиппокампе крыс контрольной группы (контроль) и крыс с ишемией головного мозга (ИГМ)
При морфометрии нейронов гиппокампа крыс с ИГМ выявлено значительное уменьшение площади их перикарионов - на 41% (р<0,05), увеличение вытянутости тел нейронов (на 20%, р<0,05), уменьшение их округлости (на 13%, р<0,05) (табл. 1).
Предполагается, что изменения размеров и формы нейронов обусловлены водно-электролитными нарушениями, а также денатурацией белка. Полученные результаты согласуются с данными других исследований, в которых отмечено уменьшение размеров нейронов гиппокампа, их сморщивание в условиях ИГМ [8]. В настоящей работе эти данные подтверждаются морфометрически.
нейронов). Цифровая микрофотография. Окраска по Нисслю. Ув. ><40
Контроль ИГМ
Таблица 1. Размеры и форма перикарионов нейронов (Ме (LQ; UQ)
Группы животных Показатели морфометрии
2 площадь, мкм фактор элонгации, ед. форм-фактор, ед.
Контроль 92(78;102) 1,22(1,20;1,25) 0,92(0,90;0,94)
ИГМ 54(46;62) 1,5(1,40;1,60)* 0,80(0,78;0,82)*
Примечание: * - р<0,05 по сравнению с показателями в контроле
Установлено значительное увеличение содержания рибонуклеопротеинов (РНП) в цитоплазме нейронов гиппокампа крыс опытной группы (на 58%, р<0,05) (табл. 2).
Таблица 2. Содержание рибонуклеопротеинов (Ме (LQ; UQ), в единицах оптической плотности)
Группы животных Содержание рибонуклеопротеинов
Контроль 0,17 (0,15;0,18)
ИГМ 0,27 (0,25;0,28)*
Примечание: * - р<0,05 по сравнению с показателями в контроле
Повышение содержания рибонуклеопротеинов в гиппокампе после 60-минутной субтотальной церебральной ишемии может быть связано с увеличением количества гиперхромных нейронов.
Цитоплазма и ядро гиперхромных сморщенных нейронов уменьшены в объеме, что привело к увеличению плотности расположения рибосом (соответственно и рибонуклеопротеинов) и гиперхроматозу. Количество рибосом на внешней мембране кариолеммы значительно увеличилось по сравнению с животными контрольной группы. Отмечено смещение ядрышка к периферии ядра, увеличение концентрации рибонуклеопротеинов вследствие их выхода из ядрышка, значительное возрастание количества свободных рибосом в цитоплазме нейронов крыс опытной группы [4].
У крыс с ИГМ отмечалось снижение активности НАДН-ДГ в цитоплазме нейронов пирамидного слоя поля СА1 гиппокампа (на 23%, р<0,05) (рис. 2, 3; табл. 3).
Таблица 3. Активность ферментов в цитоплазме нейронов пирамидного слоя поля СА1 гиппокампа. (Ме (LQ; UQ), в единицах оптической плотности)_
Группы животных Активность ферментов, единицы оптической плотности
НАДН-ДГ СДГ Г-6-Ф-ДГ ЛДГ КФ
Контроль 0,22 (0,19;0,26) 0,17 (0,16;0,18) 0,22 (0,2;0,24) 0,14 (0,13;0,15) 0,24 (0,2;0,25)
ИГМ 0,17 (0,16;0,18)* 0,12 (0,11;0,13)* 0,17 (0,16;0,18)* 0,18 (0,17;0,19)* 0,31 (0,3;0,39)
Примечание: * - р< 0,05 по сравнению с показателями в контроле
Рис. 3. Высокая активность НАДН-ДГ в нейронах пирамидного слоя поля СА1 гиппокампа крыс контрольной группы - А и ее снижение в опытной группе - Б. Цифровая микрофотография. Ув. х400
Отмечали снижение активности СДГ на 30% (р<0,05) и Г-6-Ф-ДГ - на 23% (р<0,05), увеличение активности ЛДГ на 22% (р<0,05) и КФ - на 31% (р<0,05) (рис. 4; табл. 3).
Рис. 4. Активность КФ в нейронах пирамидного слоя поля СА1 гиппокампа крыс контрольной группы - А и её повышение в опытной группе - Б. Цифровая микрофотография. Ув. ><400
Обсуждение результатов исследования
Ведущими звеньями патогенеза ИГМ является энергодефицит и нарастающий ацидоз в зоне ишемии, которые обусловливают развитие в нейронах дистрофических, атрофических и некротических изменений [5]. В цитоплазме нейронов происходит снижение активности маркерных ферментов митохондрий: НАДН-ДГ - фермента, участвующего в переносе электронов с НАДН на убихинон и являющегося важным связующим звеном между циклом Кребса и электронно-транспортной цепью, СДГ - ключевого фермента аэробного окисления сукцината в митохондриях, а также внемитохондриального фермента Г-6-Ф-ДГ, связанного с пентозофосфатным путем. Происходит компенсаторное возрастание активности ЛДГ как показателя анаэробного гликолиза, и маркерного фермента лизосом КФ, отражающего возрастание процесса аутофагии, направленного на удаление поврежденных мембран и органелл в нейронах [5].
Отмеченные изменения свидетельствуют о нарушении энергетического обмена нейронов гиппокампа, что ведет к нарушению их структуры, функциональной активности и возможной гибели. В условиях ишемической гипоксии значительно возрастает количество патологических форм нейронов - гиперхромных, гиперхромных сморщенных, гипохромных нейронов и клеток-теней. «Темные» гиперхромные нейроны расцениваются как измененные сморщенные клетки. Выдвинута гипотеза о происхождении «темных» нейронов в результате ^запрограммированного фазового изменения гиалоплазмы. Эти нейроны способны к восстановлению функционирования, а в случае гибели - фагоцитируются микроглией. Гиперхроматофилия нейронов может отражать преобладание синтеза белка над его расходом как следствие дегидратации клетки из-за энергетических и ионных нарушений. При гипоксическим повреждении нейрон сокращает экспорт белка, направляя максимальное его количество на внутренние потребности [4].
Данные цитохимических исследований согласуются с результатами, полученными при изучении ультраструктуры нейронов при ИГМ. Отмечаются изменения в митохондриях: они набухают и распределяются в цитоплазме неравномерно, кристы их разрушаются. Снижение количества митохондрий, количества и длины их крист свидетельствует о нарушении энергетического обеспечения нейронов [5]. Набухание митохондрий приводит к разрыву наружной мембраны, затем растяжению внутренней мембраны, нарушению ее барьерных свойств (прежде всего для катионов) и к полному разрушению органелл. Происходит изменение конфигурации канальцев гранулярной и гладкой эдоплазматической сети. Увеличивается число свободных рибосом вследствие их отсоединения от мембран гранулярной эндоплазматической сети. Это является одним из проявлений формирующегося в клетке энергодефицита: фиксация рибосом к мембранам шероховатого эндоплазматического ретикулума при участии белка рибофорина является энергозависимым процессом. Возрастает общее количество и размеры лизосом. В цитоплазму выходят и активируются гидролитические ферменты - катепсины, рибонуклеаза, кислая фосфатаза, дезоксирибонуклеаза, гиалуронидаза и другие ферменты, запуская в клетке процесс аутофагии [5]. При инициации ишемии в нейронах головного мозга происходит увеличение [Н+] с
развитием ацидоза и [Са2]. В результате повышения [Са2] происходит активация ферментов, ведущих к дезорганизации метаболизма, а также к нарушению возбудимости и увеличению проницаемости плазматической мембраны для ионов. Нарушение внутриклеточного кальциевого гомеостаза играет одну из ведущих ролей в нейродегенеративных процессах в мозге при его ишемии наряду с такими факторами как глутаматергическая сигнальная трансдукция, оксидативный стресс, воспаление, что приводит к апоптозу нейронов [5].
Заключение
Таким образом, субтотальная ишемия головного мозга приводит к глубоким морфофункциональным нарушениям нейронов гиппокампа крыс, включающим уменьшение размеров формы клеток, изменение степени хроматофилии цитоплазмы нейронов и выраженные нарушения окислительного метаболизма.
Литература (references)
1. Батин Н.В. Компьютерный статистический анализ данных: учеб.-метод. пособие. - Минск : Ин-т подгот. науч. кадров НАН Беларуси, 2008. - 160 с. [Batin N.V. Komputornii statisticheskii analiz dannich: ucheb.-metod. posobie. Computer statistical analysis of data. Minsk: In-t podgot. nauch. kadrov NAN Belarusi, 2008. -160 p. (in Russian)]
2. Пирс Э. Гистохимия теоретическая и прикладная. - М.: Издательство иностранной литературы, 1962. -962 с. [Pirs Je. Gistohimija teoreticheskaja i prikladnaja. Histochemistry theoretical and applied. Moscow: IL, 1962, 962 p. (in Russian)]
3. Рукан Т.А., Максимович Н.Е., Зиматкин С.М. Морфофункциональные изменения нейронов фронтальной коры головного мозга в условиях его ишемии-реперфузии // Журнал Гродненского государственного медицинского университета. - 2012. - №4. - С. 35-38. [Rukan T.A., Maksimovich N.E., Zimatkin S.M. Morfofunktsional'nyye izmeneniya neyronov frontal'noy kory golovnogo mozga v usloviyakh yego ishemii-reperfuzi. Morphofunctional changes in the neurons of the frontal cortex of the brain under conditions of its ischemia-reperfusion. Journal of the Grodno State Medical University. - 2012. - N4. - P. 35-38. (In Russian)]
4. Baraskay S., Szepesi P., Orban G. Generalization of seizures parallels the formation of "dark" neurons in the hippocampus and pontine reticular formation after focal-cortical application of 4-aminopyridine (4-AP) in the rat // Brain Research. - 2008. - V.1228. - P. 217-228.
5. Chan P.H. Mitochondria and neuronal death/survival signaling pathways in cerebral ischemia // Neurochemisry Reseach. - 2004. - V.29. - P. 1943-1949.
6. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes: text with EEA relevance 20.10.2010. - Strasbourg: Official Journal of the European Union, 2010. - 46 p.
7. Paxinos G., Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates. 6th ed. - London: Academic Press, 2007. - 448 p.
8. Ryosuke M.D. Effect of danttrolene on extracellular glutamate concentration and neuronal death in the rat hippocampal CA1 region subjected to transient ischemia // Anesthesiology. - 2002. - V.96. - P. 705-710.
9. Sacco S.E., Whisnant J.P., Broderick J.P. Epidemiological characteristics of lacunar infarcts in a population // Stroke. - 1991. - V. 22. - P. 1236-1241.
10. White B.C. Brain ischemia and reperfusion: molecular mechanisms of neuronal injury // Journal of Neurological Science. - 2000. - V.179, N1-2. - P. 1-33.
Информация об авторах
Бонь Елизавета Игоревна - ассистент кафедры патологической физиологии им. Д.А. Маслакова УО «Гродненский государственный медицинский университет», Беларусь.
Максимович Наталия Евгеньевна - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой патологической физиологии им. Д.А. Маслакова УО «Гродненский государственный медицинский университет», Беларусь. E-mail: mne@grsmu.by
Зиматкин Сергей Михайлович - доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии, УО «Гродненский государственный университет», Беларусь. E-mail: zimatkin@grsmu.by
