CC BY
5454
Acta medica Eurasica. 2016. № 3
УДК 599.323.4-114.44:591.044 ББК Е623.362.423.2*732.32-64
Л.М. МЕРКУЛОВА, Г.Ю. СТРУЧКО, О.М. АРЛАШКИНА, М.Н. МИХАЙЛОВА
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ СЕЛЕЗЕНКИ В УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО КАНЦЕРОГЕНЕЗА
Ключевые слова: селезенка, канцерогенез, 1,2-диметилгидразин, В-лимфоциты, Т-лимфоциты, белая пульпа, опухоль, толстая кишка.
С помощью морфологических и иммуногистохимических методов исследования изучен лимфоидный компартмент селезенки у крыс в возрасте 3 и 6 месяцев, подвергшихся химическому канцерогенезу, индуцированному 1,2-диметилгидразином. Установлено, что канцероген приводит к уменьшению основных морфометрических показателей В- и Т-зависимых зон селезенки. При этом в этих зонах значительно сокращается число Ой79а+-клеток (В-лимфоцитов) и Ой45НО+-клеток (Т-лимфоцитов). Выявлено, что все количественные и качественные изменения белой пульпы селезенки более выражены у крыс в возрасте 6 месяцев.
L. MERKULOVA, G. STRUCHKO, O. ARLASHKINA, M. MIKHAYLOVA MORFOLOGICAL CHANGES OF THE LIEN IN THE CONDITIONS OF THE EXPERIMENTAL CARCINOGENESIS
Key words: lien, carcinogenesis, 1,2-dimethylhydrazine, B-lymphocytes, T-lymphocytes, white pulp, tumor, colon.
By means of morphological and immunohistochemical methods of a research the lymphoid device of a lien at rats at the age of 3 and 6 months which underwent a chemical carcinogenesis, the induced 1,2-dimetilgidraziny is studied. It is established that the entered carcinogen leads to decrease of the main morphometric indicators In - and T-dependent zones of a lien. After administration of carcinogen in these zones the number of OD79a+ cells (B-lymphocytes) and OD45RO+ cells (T-lymphocytes) is considerably reduced. It is taped that all quantitative and high-quality changes of a white pulp of a lien are more expressed at rats at the age of 6 months.
Неуклонный рост онкологической заболеваемости является глобальной медико-социальной проблемой. По данным Росстата, одной из распространенных локализаций опухолей является толстая кишка, составляя 11,4% в общей структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями населения России. Существуют данные о том, что примерно 80-90% опухолей у человека возникают при воздействии различных химических канцерогенов [1].
Известно, что химический канцерогенез приводит к определенным нарушениям в системе иммунного надзора [7]. Имеются сведения, что рост злокачественных новообразований сопровождается продукцией биологически активных веществ, угнетающих защитные силы организма. Это, в свою очередь, приводит к снижению противоопухолевого иммунного ответа [10], в результате чего опухоль не распознается иммунными клетками как чужеродная. Вероятно, это связано с инволюцией тимуса на фоне канцерогенеза [5]. Также имеются сведения о том, что опухоль обладает прямым токсическим влиянием на иммунные органы [3], что, в свою очередь, приводит к снижению продукции ими иммунокомпетентных клеток, выработке дефектных и иммуносу-прессивных клеток [9].
Одна из ведущих ролей в формировании противоопухолевой иммунной защиты принадлежит самому большому периферическому органу иммуногенеза - селезенке. Здесь происходит окончательная антигензависимая диф-ференцировка В- и Т-лимфоцитов, а также превращение В-лимфоцитов в плазмоциты и накопление клеток-памяти.
Несмотря на имеющиеся противоречия в литературе по вопросам взаимодействия опухоли и иммунных органов, можно утверждать, что иммунитет играет в патогенезе онкогенеза значительную роль [4]. Поэтому углублённое
изучение локального иммунного статуса, в частности, селезенки при развитии опухолей является весьма актуальной задачей.
Цель исследования - изучение морфологических и иммуногистохими-ческих характеристик селезенки крыс при химическом канцерогенезе, индуцированном 1,2-диметилгидразином, через 1 и 4 месяца после воздействия.
Материалы и методы исследования. Эксперимент выполнен на 40 белых нелинейных крысах в возрасте 3 и 6 месяцев. Все процедуры по содержанию крыс и выведение из эксперимента производились согласно правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных и принципам Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным. Животные были разделены на две группы. Первая - интактные крысы, которым для контроля вводили изотонический раствор хлорида натрия (n = 20). Вторая группа -животные, которым через месяц после рождения внутрибрюшинно вводили канцероген (1,2-диметилгидразин) из расчета 20 мг/кг 1 раз в неделю в течение четырех недель (n = 20). Выведение крыс из эксперимента производили через 1 и 4 месяца после окончания курса инъекций. При патоморфологическом исследовании учитывались частота развития новообразований, их локализация и морфологические особенности. Объектом исследования служила селезенка.
В работе применялись следующие методы:
1. Иммуногистохимический метод с использованием коммерческих моно-клональных антител (МКАТ) производства Santa Cruze (США):
- МКАТ к В-лимфоцитам (CD79a);
- МКАТ к Т-лимфоцитам (CD45RO).
Материал для исследования фиксировали 10%-ным нейтральным забу-ференным формалином в течение 24 ч и выполняли стандартную спиртово-ксилоловую проводку. Подготовленные образцы тканей заливали в парафин. Готовые срезы толщиной 4 мкм наносили на высокоадгезивные стекла и высушивали при температуре 37°С в течение 18 ч. Демаскировка и иммуноги-стохимическая окраска проводились с использованием системы визуализации Leica ChromoPlex™ 1 Dual Detection for BOND. Контролем иммуногисто-химической реакции служила неиммунизированная сыворотка. Результаты реакций оценивали с применением микроскопа МИКРОМЕД 3 ЛЮМ.
2. Окраска срезов селезенки гематоксилином и эозином для изучения общегистологической картины.
3. Компьютерная морфометрия с использованием программы «МикроАнализ» (Санкт-Петербург, 2010) для измерения Т- и В- зависимых зон белой пульпы, а также количественных характеристик иммуногистохимических реакций.
4. Статистическая обработка с использованием лицензионного пакета программ MS Office 2003, достоверность определялась по /-критерию Стьюдента.
Результаты исследования и их обсуждение. Введение 1,2-диметил-гидразина через один месяц после окончания курса приводит к трансформации слизистой толстой кишки, что проявляется клеточной дисплазией, полиморфизмом, гиперхромией ядер и усилением митотической активности клеток железистого эпителия. Через 4 месяца канцероген вызывает образование одной, реже двух опухолей в толстой кишке размером от 0,3 до 1,0 см, которые имеют структуру высокодифференцированной аденокарциномы.
Лимфоидная ткань селезенки крыс формирует две основные В- и Т-зави-симые зоны, которые представлены периартериолярными лимфоидными муфтами (ПАЛМ) и лимфоидными узелками. Выделяют первичные лимфоид-ные узелки, не имеющие центров размножения, и вторичные лимфоидные узелки с герминативными центрами (ГЦ), которые появляются только после
56
Ае1а швМса Еигин1еи. 2016. № 3
антигенной стимуляции. Они, в свою очередь, образуют В-зависимую зону, где осуществляется дифференцировка, пролиферация В-лимфоцитов и накопление клеток-памяти. Т-зависимой зоной являются периартериальная зона лимфоидных узелков и ПАЛМ, которые состоят из Т-лимфоцитов и интер-дигитирующих клеток. Местом, где В- и Т-лимфоциты взаимодействуют между собой и встречаются с антигенами, является маргинальная зона, которая располагается по периферии лимфоидных узелков [8]. Количественный и качественный состав этих структур свидетельствует о функциональном состоянии селезенки и отображает состояние ее локального иммунного статуса.
В селезенке интактных крыс каждый лимфоидный узелок имеет округлую форму, четкое зональное строение и ровные границы. При этом доля крупных лимфоидных узелков (более 500 мкм в диаметре) преобладает над мелкими (менее 300 мкм) и средними (300-500 мкм).
Наши исследования показали, что при канцерогенезе лимфоидные узелки не только приобретают измененную форму, но и теряют четкие контуры между зонами, границы между ними становятся размытыми, стертыми. Введение канцерогена приводит к увеличению числа мелких и средних лимфо-идных узелков в 2 раза, а число крупных уменьшается на 10%.
Диаметр лимфоидных узелков селезенки через 1 месяц после введения 1,2-диметилгидразина достоверно снижается на 19%, а через 4 месяца более значимо - на 22 % (табл. 1).
Таблица 1
Морфометрические параметры лимфоидных узелков (ЛУ) селезенки
Показатели Интактные крысы. Через 1 месяц после инъекций Крысы с введением канцерогена. Через 1 месяц после инъекций Интактные крысы. Через 4 месяца после инъекций Крысы с введением канцерогена. Через 4 месяца после инъекций
Диаметр ЛУ, мкм 620,8±23,5 502,33±18,4*** 561,8±22,9 437,71±14,3***
Диаметр ГЦ, мкм 218,53±8,5 191,59±8,3* 202,02±9,2 171,78±5,9**
Ширина маргинальной зоны, мкм 121,3±6,02 118,352±2,2 122,85±2,7 109,737±2,1***
Ширина ПАЛМ, мкм 118,31±4,8 125,06±4,8 119,33±3,3 111,11±3,9*
Примечание. * - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 по сравнению с аналогичными показателями у интактных животных.
При этом диаметр герминативных центров лимфоидных узелков также значительно меньше через 4 месяца после введения канцерогена (табл. 1), что косвенно указывает на снижение у этих крыс В-клеточной иммунореактивности.
Кроме того, наши исследования показали, что при канцерогенезе в герминативных центрах лимфоидных узелков уменьшается количество Ой79а+-клеток: в 3 месяца - на 31%, а в 6 месяцев - на 35% (табл. 2).
Введение канцерогена приводит к уменьшению ширины ПАЛМ только через 4 месяца после инъекций (рис. 1), а количество ОР45РО+ Т-лимфоци-тов этой зоны уменьшается у крыс как через 1, так и через 4 месяца (табл. 2).
Канцерогенез в толстой кишке сопровождается также уменьшением ширины маргинальной зоны лимфоидных узелков селезенки на обоих сроках наблюдения (табл. 1). Это может быть связано как с инволюцией тимуса и уменьшением поступления лимфоцитов Т-типа в селезенку [6], так и с нарушением дифференцировки В-лимфоцитов.
Таблица 2
Доля СD79a+-клеток (В-лимфоцитов) в герминативных центрах лимфоидных узелков и СD45RO+-клеток (Т-лимфоцитов) в периартериолярных лимфоидных муфтах селезенки, %
Показатели Интактные крысы. Через 1 месяц после инъекций Крысы с введением канцерогена. Через 1 месяц после инъекций Интактные крысы. Через 4 месяца после инъекций Крысы с введением канцерогена. Через 4 месяца после инъекций
СD79a+-клетки 46,91±2,5 32,48±3,5** 45,37±3,5 29,31±3,6**
СD45RO+-клетки 42,39±2,7 35,24±2,0* 38,07±2,3 32,36±2,0**
Примечание. * - p < 0,05; ** - p < 0,01 по сравнению с аналогичными показателями у интакт-ных животных.
Выводы. Введение 1,2-диметилгидразина приводит к существенным морфологическим и иммуногистохимическим изменениям белой пульпы селезенки: изменению соотношения между лимфоидными узелками различного диаметра в сторону увеличения мелких, уменьшению диаметра узелков и их герминативных центров. Через 4 месяца после окончания введения канцерогена отмечается более выраженная гипоплазия лимфоидных узелков по сравнению с таковой в предыдущий срок: значительное сокращение диаметра герминативных центров и ширины маргинальной зоны, существенное уменьшение числа В- и Т-лимфоцитов, а также уменьшение диаметра ПАЛМ.
Таким образом, изменения, выявленные в селезенке, свидетельствуют о снижении локального иммунного статуса селезенки при канцерогенезе, что сопровождается недостаточностью противоопухолевого иммунного ответа и может служить предпосылкой ускорения темпов злокачественного роста.
Литература
1. Белицкий В.А., Якубовская М.Г. Генетический полиморфизм и вариабельность химического канцерогенеза // Биохимия. 2008. № 73(5). С. 675-689.
2. Гумен А.В., Шанин С.Н., Козинец И.А. Цитотоксическая активность натуральных киллер-ных клеток селезенки крыс при стрессе и ее коррекция короткими иммуномодулирующими пептидами // Цитокины и воспаление. 2006. Т. 5, № 2. С. 37-41.
3. Киселева Е.П. Механизмы инволюции тимуса при опухолевом росте // Успехи современной биологии. 2004. Т. 124. C. 589-601.
4. Кострова О.Ю. Акцидентальная инволюция тимуса крыс на фоне развития аденокарци-номы толстой кишки, вызванной введением канцерогена в различной дозировке // Фундаментальные исследования. 2013. № 3-2. С. 321-324. URL: http://www.fundamental-research.ru/ru/arti-cle/view?id=31334 (дата обращения: 02.09.2016)
5. Москвичев Е.В., Меркулова Л.М., Стручко Г.Ю., Кострова О.Ю., Михайлова М.Н. Возрастная инволюция и острая атрофия тимуса при экспериментальном канцерогенезе // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. 2014. № 3(51). С. 127-129.
6. Москвичев Е.В., Меркулова Л.М., Стручко Г.Ю. Иммуногистохимическая характеристика апоптоза и клеточной пролиферации в тимусе при экспериментальной опухоли толстой кишки // Иммунология. 2012. Т. 33, № 6. С. 303-305.
7. Михайлова М.Н., Стручко Г.Ю., Меркулова Л.М., Кострова О.Ю, Москвичев Е.В., Дран-дрова Е.Г., Стоменская И.С. Участие дендритных и нейроэндокринных клеток тимуса в развитии его инволюции при формировании экспериментальной опухоли толстой кишки // Вестник Чувашского университета. 2011. № 3. С. 377-383.
8. Ярилин А.А. Иммунология. М. : ГЭОТАР-Медиа. 2010. С. 430-476.
9. Clarke S.L., Betts G.J., Plant A. CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells suppress antitumor immune responses in patients with colorectal cancer. PLoS One, 2006, vol. 27, no. 1, р. 129
10. Whiteside T.L. The role of immune cells in the tumor microenvironment. Cancer Treat Res., 2006, vol. 130, pp. 103-124.
58
Acta medica Eurasica. 2016. № 3
References
1. Belitskii V.A., Yakubovskaya M.G. Geneticheskii polimorfizm i variabel'nost' khimicheskogo kantserogeneza [Genetic polymorphism and variability of a chemical carcinogenesis]. Biokhimiya [Biochemistry]. 2008, no. 73(5), pp. 675-689.
2. Gumen A.V., Shanin S.N., Kozinets I.A. Tsitotoksicheskaya aktivnost' natural'nykh killernykh kle-tok selezenki krys pri stresse i ee korrektsiya korotkimi immunomoduliruyushchimi peptidami [Cytotoxic activity natural the killernykh of cells of a lien of rats at a stress and its correction by short immunomodula-tory peptides]. Tsitokiny i vospalenie [Cytokines and inflammation]. 2006, vol. 5, no. 2, pp. 37-41.
3. Kiseleva E.P. Mekhanizmy involyutsii timusa pri opukholevom roste [Mechanisms of an involution of a thymus with a tumoral growth]. Uspekhi sovremennoi biologii [Achievements of modern biology], 2004, vol. 124, pp. 589-601.
4. Kostrova O.Yu. Aktsidental'naya involyutsiya timusa krys na fone razvitiya adenokartsinomy tolstoi kishki, vyzvannoi vvedeniem kantserogena v razlichnoi dozirovke [Aktsidentalny involution of a thymus of rats against the background of development of an adenocarcinoma of the large intestine caused by administration of carcinogen in various dosage]. Fundamental'nye issledovaniya [Basic researches]. 2013, no. 3-2, pp. 321-324. URL: http://www.fundamental-research.ru/ru/article/view?id= 31334 (data obrashcheniya: 02.09.2016).
5. Moskvichev E.V., Merkulova L.M., Struchko G.Yu., Kostrova O.Yu., Mikhailova M.N. Vozrast-naya involyutsiya i ostraya atrofiya timusa pri eksperimental'nom kantserogeneze [Age involution and acute atrophy of a thymus at an experimental carcinogenesis]. Vestnik Volgogradskogo gosudarstven-nogo meditsinskogo universiteta [The Bulletin of the Volgograd state medical university], 2014, no. 3(51), pp. 127-129.
6. Moskvichev E.V., Merkulova L.M., Struchko G.Yu. Immunogistokhimicheskaya kharakteristika apoptoza i kletochnoi proliferatsii v timuse pri eksperimental'noi opukholi tolstoi kishki [The immunohis-tochemical characteristic of an apoptosis and cellular proliferation in a thymus at an experimental tumor of a large intestine]. Immunologiya [The Immunology]. 2012, vol. 33, no. 6, pp. 303-305.
7. Mikhailova M.N., Struchko G.Yu., Merkulova L.M., Moskvichev E.V., Kostrova O.Yu., Stomens-kaya I.S. Uchastie dendritnykh i neiroendokrinnykh kletok timusa v razvitii ego involyutsii pri formirovanii eksperimental'noi opukholi tolstoi kishki [Involment of dedritic and neuroendocrinic cells of thymus in the development of its involution against the formation of experimental colon cancer]. Vestnik Chuvashsko-go universiteta, 2011, no. 3. pp. 377-383.
8. Yarilin A.A. Immunologiya [The Immunology]. Mosco, GEOTAR-Media Publ., 2010, pp. 430-476.
9. Clarke S.L., Betts G.J., Plant A. CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells suppress antitumor immune responses in patients with colorectal cancer. PLoS One, 2006, vol. 27, no. 1, p. 129
10. Whiteside T.L. The role of immune cells in the tumor microenvironment. Cancer Treat Res., 2006, vol. 130, pp. 103-124.
МЕРКУЛОВА ЛАРИСА МИХАЙЛОВНА - доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой нормальной и топографической анатомии с оперативной хирургией, Чувашский государственный университет, Россия, Чебоксары (merkulova192@mail.ru).
MERKULOVA LARISA - Doctor of Medical Sciences, Professor, Head of Normal and Topographic Anatomy Department with Operative Surgery, Chuvash State University, Russia, Cheboksary.
СТРУЧКО ГЛЕБ ЮРЬЕВИЧ - доктор медицинских наук, заведующий кафедрой инструментальной диагностики с курсом фтизиатрии, Чувашский государственный университет, Россия, Чебоксары (glebstr@mail.ru).
STRUCHKO GLEB - Doctor of Medical Sciences, Head of Department of the Instrumental Diagnostics Department with a course of Phthisiology, Chuvash State University, Russia, Cheboksary.
АРЛАШКИНА ОЛЬГА МИХАЙЛОВНА - аспирантка кафедры инструментальной диагностики с курсом фтизиатрии, Чувашский государственный университет, Россия, Чебоксары (olgaruz1202@mail.ru).
ARLASHKINA OLGA - Post-Graduate Student, Department of the Instrumental Diagnostics Department with a course of Phthisiology, Chuvash State University, Cheboksary, Russia.
МИХАЙЛОВА МАРИНА НИКОЛАЕВНА - кандидат медицинских наук, доцент кафедры нормальной и топографической анатомии с оперативной хирургией, Чувашский государственный университет, Россия, Чебоксары (mar30o7@mail.ru).
MIKHAYLOVA MARINA - Candidate of Medical Sciences, Associate Professor, Normal and Topographic Anatomy Department with Operative Surgery, Chuvash State University, Cheboksary, Russia.
