Морфологические и гематологические критерии эффективности лечения экспериментального пиелонефрита комплексом природных цитокинов и антибактериальных пептидов Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

УДК 616.61-002.3-085.281

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ПИЕЛОНЕФРИТА КОМПЛЕКСОМ ПРИРОДНЫХ ЦИТОКИНОВ И АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПЕПТИДОВ

ВА. Черешнев, П.В. Косарева, Е.И. Самоделкин, Н.И. Аверьянова, ФА. Шилова,

НА. Зимушкина,

Большое количество побочных эффектов, присущих современным антибиотикам, и быстро растущее количество антибиотикорези-стентных форм возбудителей инфекционно-воспалительных заболеваний человека определяют постоянный поиск новых групп эффективных противомикробных препаратов. Согласно современным представлениям о качестве лекарств, оптимальными средствами лечения являются препараты, включающие естественные компоненты организма или близкие им по структуре и свойствам. В связи с этим поиск таких веществ, разработка способов их получения и методов использования в качестве субстанций лекарственных средств являются обоснованным подходом к созданию новых лечебных препаратов (Масычева В.И. и др., 2001).

К настоящему времени трудами многих авторов доказано, что у низкомолекулярных катионных пептидов нет недостатков классических антибиотиков: для них пока не описаны анафилактоидные реакции, поскольку они неантигенны, многие катионные пептиды обладают эндотоксиннейтрализующей и имму-норегулирующей активностью, усиливают действие традиционно используемых антибиоти-

ИА. Логинова

ков (Lehrer R.I., 1996; Кокряков В.Н., 1999; Andersson Е. et al., 2002), к ним практически не вырабатывается резистентность со стороны микробов (Hancock R.E., 1997). Многие низкомолекулярные пептиды животного происхождения одновременно являются многофункциональными иммуномодуляторами (Conner К. et al, 2002; Scott M.G. et al, 2002), в отличие от традиционных антибиотиков, вызывающих иммуносупрессию. Все это является предпосылкой для создания принципиально новых антимикробных препаратов - антибиотиков на основе катионных пептидов, продуцируемых в тканях животных и человека.

Кафедрой иммунологии РГМУ совместно с предприятием «Иммунохелп» (г. Москва) разработан и внедрен в клиническую практику препарат «Суперлимф»- естественный комплекс природных противомикробных пептидов и цитокинов. «Суперлимф» является иммуномоду-лятором с прямым противовирусным и проти-вомикробным действием. В настоящее время этот препарат уже используется для лечения заболеваний инфекционно-воспалительной природы в офтальмологии, гинекологии, хирургии. Исследование противомикробного и иммуномодулирующего действия суперлимфа

представляет особый интерес в нефрологии, поскольку инфекционно-воспалительные заболевания органов мочевой системы, как правило, вызываются полирезистентными штаммами микроорганизмов и сопровождаются разнообразными иммунологическими нарушениями (Griffiths Р, 2003; Domann Е. et al, 2003). Отсутствие в современной научной литературе данных, касающихся этого вопроса, и определило цель нашей работы - в доклинических экспериментах исследовать эффективность препарата «Суперлимф» при лечении инфекционно-воспалительных заболеваний органов мочевой системы.

Материалы и методы

Эксперимент выполнен на 50 животных-самках беспородных белых крыс четырехмесячного возраста, содержащихся в стандартных условиях вивария. Животные были разделены на пять экспериментальных групп по 10 в каждой:

I группа («=10) - контрольная (интакт-ные животные);

И группа (7?=10) - гематогенное заражение культурой Е. coli без лечения;

III группа (п=10) - гематогенное заражение культурой Е. coli, лечение суперлимфом;

IV группа (я=10) - гематогенное заражение культурой Е. coli, лечение цефазолином;

V группа (п=10) - гематогенное заражение культурой Е. coli, комбинированная терапия: цефазолин + суперлимф.

Все эксперименты проведены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755) и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986 г. Пиелонефрит у животных опытных групп моделировали интраперитонеальным введением

бактериальной суспензии уропатогенного штамма лакгозонегативной Escherichia coli по оригинальной методике, на которую подана заявка на изобретение и получена приоритетная справка № 2007127373/14(029795) от 17.09.07 г.

Экспериментальную терапию начинали спустя 48 часов после заражения. Препараты вводили интраперитонеально 1 раз в сутки в течение 8 дней: суперлимф - из расчета 0,1 мг/кг массы тела в сутки в 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия для инъекций, цефазолин - 50 мг/кг также в 0,5 мл физиологического раствора.

В ходе проведения эксперимента наблюдали за поведением животных, их внешним видом, динамикой массы тела. Спустя 3 и 7 суток после заражения у животных регистрировали показатели периферической крови -уровень гемоглобина, количество эритроцитов и лейкоцитов, лейкоцитарную формулу. Фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови оценивали по отношению к формалинизированным эритроцитам барана в концентрации 100х106/мл в условиях 20-минутной инкубации при 37°С с помощью модификации микрометода (Каплин В.Н., 1996). После забора лабораторных показателей животных выводили из эксперимента путем перерезки спинного мозга под эфирным наркозом. Почки, печень, селезенку, легкие, толстую и тонкую кишку забирали с целью проведения гистологического исследования. Для приготовления гистологических препаратов использовали стандартные методики, парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином и по методу Ван Гизона. Одновременно в стерильных условиях осуществляли забор аутоп-сийного материала (почки, печень, селезенку) для проведения бактериологического исследования. Кусочки органов помещали в мясопеп-тонный бульон и инкубировали 18-24 часа в термостате при температуре 37°С, после чего

осуществляли посев на плотные питательные среды (кровяной агар). Посев материала на питательные среды осуществляли не позже 2 часов с момента забора анализа. Выделенные чистые культуры идентифицировали по стандартным схемам микроскопией мазка, окрашенного по Граму, и изучением культур альных и биохимических свойств (Приказ МЗ СССР № 535,1985).

Результаты экспериментов подвергнуты статистической обработке с применением компьютерных программ Microsoft Excel и Biostat. Вычисляли среднюю арифметическую

0

Установлено, что при отсутствии терапии гематогенное заражение уропатогенной культурой Escherichia coli (группа II) вызывает у экспериментальных животных развитие пиелонефрита, о чем свидетельствуют исследованные в динамике показатели периферической крови и данные гистологического и бак-

(М) и среднюю ошибку (т). Сравнение двух выборок между собой проводили при помощи критерия Манна-Уитни; эффективность лечения оценивали, используя критерий Уилкоксо-на. За критический уровень значимости выявленных различий принимали /><0,05.

Результаты и обсуждение

Выявлено, что у животных контрольной группы не определяются лабораторные, бактериологические, гистологические признаки пиелонефрита (рис. 1).

териологического исследований аутопсийного материала.

При оценке показателей периферической крови к 7-му дню после заражения у животных, не получавших лечения, были выявлены достоверные изменения в периферической крови: увеличение числа лейкоцитов по

* : /к

> ГШ

mJr

|1| Л

«с 1 Ï '

-.•■•vi.*"*

s '

J^jJ ## W i

Mi* " # '

Шшгьм

êi

ю M

Щтл'.ё

fM $ , <■■

'v f "••

У

* é

Рис. 1. Почка здорового животного (контрольная группа). Гематоксилин-эозин, увеличение *400

сравнению с исходным уровнем (табл. 1) за счет появления юных форм (р<0,001), увеличение относительного и абсолютного числа палочкоядерных ф<0,05), сегментоядерных нейтрофилов (/КО,0 5), а также эозинофилов (р<0,05). При анализе фагоцитарной системы

отмечалось достоверное снижение фагоцитарной активности лейкоцитов ф<0,05), фагоцитарного числа ф< 0,05) и индекса ф<0,05). К 3-м суткам отмечалась тенденция формирования выявленных патологических изменений (табл. 1).

Таблица 1

Изменение показателей лейкоформулы и фагоцитоза у экспериментальных животных при моделировании гематогенного пиелонефрита (л=10)

Показатель Срок исследования

Исходно 3-й день 7-й день

(М±т) (М±т) (М±т)

Лейкоциты 29300±1198 30090±1111 39340±1706*

Лимфоциты, % 67,33±3,748 56,71±3,733 60,86±2,668

абс. 19620±979,9 17020±1227 24030±1713

Юные нейтрофилы, % 0 0,5714±0,2974 0,7143±0,2857*

абс. 0 51,55±25,06* 65,84±28,04*

11алочкоядерные нейтрофилы, % 4,5± 1,057 6,429±0,719 6,714±0,944

абс. 1312±279,6 1954±684,1 2628±378*

Сегментоядерные нейтрофилы, % 21,67±2,985 27,71±2,775 23,43±1,02

абс. 6418± 1021 8397±951,8 9215±570,9*

Эозинофилы, % 1,833±0,654 2±0,8165 3,571±0,5714

абс. 542± 189,2 579,3±237,5 1400±231,1*

Моноциты, % 4,5±0,8466 6,286±0,7143 4,143±0,7377

абс. 1352±284,8 1873±210 1591±261,7

Базофилы. % 0,1667±0,1667 0,2857±0,1844 0,5714±0,2974

абс. 2,608±2,608 6,071±3,995 14,87±10,7

ФАЛ, % 23±3,706 28,57±4,86 12,14±1,654*

Фагоцитарное число 0,2783±0,04915 0,3857±0,03696 0,1586±0,02017*

Фагоцитарный индекс 1,143±0,09 1,334±0,07181* 1,317±0,07549

Примечание: * - р< 0,05

При проведении бактериологического исследования аутопсийного материала, полученного от этих животных, положительные результаты бактериологического исследования отмечались в 100% случаев, что свидетельствует о наличии бактериемии у животных данной экспериментальной группы. При проведении гистологического исследования в почках экспериментальных животных были выявлены полнокровие сосудов стромы и ее инфильтрация лейкоцитами и макрофагами, зернистая

дистрофия эпителия проксимальных канальцев, белковые цилиндры в просветах канальцев, воспалительная лимфогистиоцитарная инфильтрация с примесью нейтрофилов в слизистой оболочке и строме лоханок Выявленные патоморфологические изменения свидетельствуют о развитии у животных острого пиелонефрита. В тонкой кишке животных в строме ворсин под базальной мембраной отмечалась выраженная воспалительная лимфо-лейкоцитарная инфильтрация с примесью

большого количества эозинофилов и макрофагов с пенистой цитоплазмой, некробиоти-ческие изменения энтероцитов, большое количество бокаловидных клеток Отмечалась также интенсивная дегрануляция клеток Пане-та. В толстой кишке выявлено избыточное количество бокаловидных клеток, десквамиро-ванных в просвет кишки. В строме в основании слизистой оболочки - признаки отека, более выраженные, чем в тонкой кишке, воспалительная инфильтрация лимфогистиоцитарного характера с примесью нейтрофилов и плазматических клеток В лимфоидной ткани селезенки выявлялись светлые центры размножения в фолликулах, в красной пульпе - крупные макрофаги с гиперхромными ядрами, умеренная лимфолейкоцитарная инфильтрация. Отмечаемые патоморфологические изменения объяс-

няются генерализованным характером инфек-ционно-воспалительного процесса.

У животных, получавших экспериментальную терапию цефазолином, суперлимфом, их комбинацией (группы III, IV, V), абсолютное число лейкоцитов и лейкоформула (в абсолютных числах и процентном отношении) к 3-му дню после заражения достоверно не отличались от исходных данных (табл. 2, 3) (р>0,05). Также не имели достоверных различий показатели лейкоформулы и фагоцитоза к 7-му дню от заражения (р>0,05), исключая возросшее по сравнению с исходным уровнем количество эозинофилов (р<0,05) в экспериментальной группе, получавшей только цефа-золин, что связано, вероятно, с возникновением сенсибилизации при приеме антибиотика (табл. 3).

Таблица 2

Показатель Срок исследования

исходно 3-й день 7-й день

(.М±т) (Mint) (М±т)

Лейкоциты 37820±1006 35720±2379 40230±1088

Лимфоциты, % 76,17±3,591 80,83±3,027 81,67±1,944

абс. 28870±1776 28670±1503 32890±1359

Юные нейтрофилы, % 0,1667±0,1667 0,3333±0,3333 0,1667±0,1667

абс. 12,27± 12,27 10,95± 10,95 4,33±4,33

Палочкоядерные нейтрофилы, % 5±0,6831 2,833±0,7032 3,833±0,654

абс. 1878±241,2 1065±293,6 1540±270

Сегментоядерные нейтрофилы, % 12,33±1,687 8,833±1,973 7,833±1,327

абс. 4643±607,9 3300±983,6 3128±507,9

Эозинофилы, % 4± 1,265 3,333±0,6667 2,833±0,4014

абс. 1506±460,7 1175±236 1128±153,6

Моноциты, % 2,333±0,8028 3,333±0,9888 3,667±0,5578

абс. 861,7±281 1188±319,4 1476±233,7(?)

Базофилы, % 0 0,5±0,2236* 0

абс. 0 8,442±3,838* 0

ФАЛ, % 8,75±1,887 3,167±0,4773* 2,75±0,4787*

Фагоцитарное число 0,089±0,03185 0,045±0,008466 0,0425±0,01031

Фагоцитарный индекс 0,6375±0,3119 0,01317±0,001078* 0,01375±0,002394*

Примечание: * -р<0,05

Изменение показателей лейкоформулы и фагоцитоза у экспериментальных животных при моделировании гематогенного пиелонефрита и лечении суперлимфом (л=10)

Таблица 3

Изменение показателей лейкоформулы и фагоцитоза у экспериментальных животных при моделировании гематогенного пиелонефрита и лечении цефазолином (л=10)

Показатель Срок исследования

исходно 3-й день 7-й день

(М±т) (М±т) (М±т)

Лейкоциты 41620±1980 37120±3359 44960±2800

Лимфоциты, % 72,8±4,852 85,2±2,289* 79,6+2,619

абс. 30070t1778 31750+3186 35970±3179

Юные нейтрофилы, % 0,8±0,3742 0,4±0,2449 0,2±0,2

абс. 28,38±13,11 10,22±6,262 6,37±6,37

Палочкоядерные нейтрофилы, % 6,4± 1,749 4± 1,049 3,8±0,8

абс. 2729±794,6 Ю96±365,4 1185±410,5

Сегментоядерные нейтрофилы, % 12,8±2,596 6,4±0,8718* 9,8±1,715

абс. 5424±1237 2294±205,7* 4293±615,4

Эозинофилы, % 4,2±1,356 1,2+0,5831 3,4±0,7483

абс. 1790±608,5 409,4± 177,1 1468±300,4

Моноциты, % 2,8±0,9165 3,2± 1,068 3±0,9487

абс. 1192±400,4 1299±563,9 1382±433,8

Базофилы, % 0,2±0,2 0,2±0,2 0,4±0,2449

абс. 3,44±3,44 2,22±2,22 1,108±1,106

ФАЛ, % 3,333±0,3333 2,6±0,5099 3±0,8367

Фагоцитарное число 0,03667±0,003333 0,028±0,005831 0,04±0,009487

Фагоцитарный индекс 0,011±0,001 0,0106±0,0006 0,0126±0,001939

Примечание: * -р<0,05

При проведении бактериологического исследования аутопсийного материала, полученного от животных, подвергшихся экспериментальной терапии, культура Е. coli была выделена от 2 из 5 животных, пролеченных су-перлимфом, и от 1 из 5 - получавших цефазо-лин. Все выделенные культуры были по своим свойствам идентичны использованным для заражения штаммам. Посевы, полученные от животных, зараженных Е. coli и получавших комбинированную терапию, были стерильны.

При проведении гистологического исследования в почках животных всех опытных групп, получавших лечение, отмечались патологические изменения, выраженные в разной степени. Так, при изолированной терапии су-перлимфом на фоне отчетливой положительной динамики лабораторных показателей к

концу эксперимента в почках животных сохранялись полнокровие сосудов стромы и очаги воспалительной инфильтрации, дистрофические изменения эпителия канальцев. У животных, получивших монотерапию цефазолином, в почках выявлялись достаточно крупные очаги воспалительной инфильтрации в интер-стиции и воспалительная инфильтрация слизистой и стромы лоханок (рис. 2). В группе, получавшей комбинированную терапию, воспалительные изменения, в основном, проявлялись в слабо выраженной воспалительной инфильтрации чашечно-лоханочной системы (рис. 3). В кишечнике животных не было выявлено воспалительной инфильтрации стромы ворсин или же она была выражена минимально. Реактивные изменения в селезенке также были выражены слабо или отсутствовали.

ю

Рис. 2. Острый пиелонефрит у животного, получавшего цефазолин в качестве монотерапии. Гематоксилин-эозин. Увеличение *400

Рис. 3. Почка животного, получавшего комбинированную терапию. Гематоксилин-эозин. Увеличение *400

Таким образом, в экспериментальных исследованиях установлена целесообразность включения в комплексную терапию пиелонефрита нового отечественного препарата «Суперлимф», являющегося иммуномодулятором с прямым антибактериальным и противовирусным действием.

Выводы

1. В экспериментальных исследованиях установлено, что применение суперлимфа в сочетании с антибактериальным средством - цефа-золином - способствует снижению частоты бактериемии у экспериментальных животных, зараженных уропатогенными штаммами.

2. Включение в комплексную терапию экспериментального пиелонефрита препарата «Суперлимф» приводит к уменьшению выраженности морфологических признаков пиелонефрита у экспериментальных животных, тогда как у животных, пролеченных только антибиотиком, сохраняются гистологические признаки микроб-но-воспалительного процесса в ткани почек

3. Использование суперлимфа у экспериментальных животных не вызывает изменений показателей периферической крови животных, тогда как применение антибиотика группы це-фалоспоринов вызывает эозинофилию вследствие аллергизирующего действия препарата.

Библиографический список

1. Катин, ВН. Нетрадиционная иммунология инфекций / ВН. Каплин. - Пермь: ПГМА, 1996.- 163 с.

2. Кокряков, ВН. Биология антибиотиков животного происхождения / ВН. Кокряков. -СПБ.: Наука, 1999- - 152 с.

3. Масычева, ВН. Разработка препаратов на основе генно-инженерных цитокинов / ВН. Масычева, НМ. Пустошилова, ЕД. Да-ниленко // Мед. иммунология. - 2001. -Т. 3. - №3. - С. 369-378.

4. Приказ МЗ СССР «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в кли-нико-диагностических лабораториях ле-чебно-профилактических учреждений». -М, 1985 - 126 с.

5. Culture-independent identification of pathogenic bacteria and polymicrobial infections in the genitourinary tract of renal transplant recipients / E. Domann, G. Hong, C.Imirza-lioglu et al. //J. Clin. Microbiol. - 2003. - Vol. 41 (12).-P. 5500-5510.

6. Epithelial secretion of C3 promotes colonization of the upper urinary tract by Escherichia coli / T. Springall, Neil S. Sheerin, K.Abe et al. // Nature Medicine. - 2001. -№ 7. - P. 801-806.

7. Griffiths, P. The role of cranberry juice in the treatment of urinary tract infections / P. Griffiths I/ J. Community Nurs. - 2003. -Vol. 8 (12).-P. 557-561.

8. Hancock, RE. Peptide antibiotics / RE. Hancock // The lancet. - 1997. - Vol. 349. - № 8. -P. 418-422.

9. In Vivo Antibacterial Activity of RWJ-54428, a New Cephalosporin with Activity against Gram-Positive Bacteria / D.C. Griffith, L. Harford, R. William et al. // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - 2003. - Vol. 47. - №. 1. -P. 43-47.

10. Isolation of human cationic antimicrobial protein-18 from seminal plasma and its association with prostasomes / E. Andersson, OE. Sorensen, B. Frohm et al. // Hum. Reprod. - 2002. - Vol. 17 (10). - P. 2529-34.

11. Lehrer, RJ. Endogenous vertebrate antibiotics. Defensins, protegrins, and other cysteine-rich antimicrobial peptides / RJ. Lehrer, T. Ganz // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 1996. - Vol. 797. -P 228-239.

12. The antimicrobial peptide LL-37 is expressed by keratinocytes in condyloma acuminatum and verruca vulgaris / K. Conner, K. Nern,

J. Rudisiii et al. // J. Am. Acad. Dermatol. -2002.-Vol. 47 (3). - P. 347-50.

13. The human antimicrobial peptide LL-37 is a multifunctional modulator of innate immune responses / M.G. Scott; DJ. Davidson, MR. Gold et al. // J. Immunol. - 2002. - Vol. 169 (7). -P. 3883-3891.

14. Transepithelial Neutrophil Migration Is CXCR1 Dependent In Vitro and Is Defective in IL-8 Receptor Knockout Mice / G. Godaly, L. Hang B.Frendeus, C. Svanborg // The Journal of Immunology. - 2000. - Vol. 165. - P. 5287-5294.

VA. Cheresbnev, P.V. Kosareva, E.I. Samodelkin, N.I. Averyanova, F.A. Shilova, NA. Zitnushkina, I A. Loginova

MORPHOLOGICAL AND HEMATOLOGIC EFFICIENCY CRITERIA OF TREATMENT OF EXPERIMENTAL PYELONEPHRITIS WITH NATURAL CYTOKINE AND ANTIBACTERIAL PEPTIDE COMPLEX

Experimental studying of efficiency of using new native preparation "Superlymph" ("Immuno-

help" Immunology Department, RSMI, Moscow) in therapy of acute pyelonephritis was fulfilled. The preparation constitutes a complex of natural cytokines and antibacterial peptides; it possesses immunomodulating, antibacterial and antiviral effect. In experimental investigations, rationality of using Superlymph in treatment of pyelonephritis was established. The preparation applied in complex therapy of pyelonephritis contributes to decrease in bacteriemia rate among experimental animals infected with uropathogenic strains. It reduces expression of morphological pyelonephritis signs; the preparation does not cause changes in animal peripheral blood indices while using of cephalosporin (cephasoline) group antibiotics induces eosinophil resulting from allergic effect typical for antibiotics.

Keywords: experimental pyelonephritis, morphology, blood, antibacterial peptides.

Пермский государственный университет

Пермская государственная медицинская академия им. ак. ЕА Вагшра

Материал поступил в редакцию 10.11.2007

© Черешнев ВА, Косарева ГШ, Самоделкин Е.И, Аверьянова Н.И, Шилова ФА, Зимушкина НА,

Логинова ИА, 2007