CC BY
29
УДК 579.841.95-092.9+612.112.3+575.191
С.А. Битязева, т.п. Старовойтова, Б.Н. Дубровина, С.А. Татарников, Т.Т. Шкаруба
морфологическая оценка изменений в иммунокомпетентных органах морских свинок, зараженных FRANCISELLA TULARENSIS разных подвидов
Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока (Иркутск)
Проведены исследования по изучению влияния туляремийного микроба разных подвидов на морфологические изменения в иммунокомпетентных органах экспериментальных животных с помощью компьютерной программы. «Морфометрия». На основе морфометрического анализа функционально значимых структур макроорганизма идентифицированы иммунные маркеры, обладающие прогностическим, значением, для. характеристики, течения, инфекционного процесса, вызванного F. tularensis разных подвидов.
Ключевые слова: туляремийный микроб, лимфатический узел, селезенка, морфометрия
MoRpHoLoGicAL EvALuATioN oF cHANGEs iN iMMuNocoMpETENT organs of guinea piGs iNFECTED wITH DiFFERENT FRANdSELLA TuLARENSIS subspecies
S.A. Vityazeva, T.P. Starovoitova, V.I. Dubrovina, S.A. Tatarnikov, T.T. Shkaruba
irkutsk antiplague research institute of Siberia and Far east (irkutsk)
Immune response in spleen and lymph nodes of guinea pigs followed, to inoculation of various Francisella tularensis subspecies was evaluated, at light-optical level with the computer programs «Motic Images Plus» (Version 2) and «Morphometry». The findings can be prognostic for characterization of the infectious process.
Key words: Francisella tularensis, lymph node, spleen, morphometry
Туляремия, как нозологическая форма известна уже давно, причина высокой патогенности ее возбудителя остается загадкой [7]. Число зарегистрированных случаев заболевания во всем мире относительно низкое, но риск использования Francisella tularensis в качестве биологического оружия заставляет глубже изучать ее патогенез, а также разрабатывать эффективные вакцины и терапевтические методы против туляремии.
Несмотря на большое количество работ, посвященных этой проблеме, недостаточно уделяется внимания изучению патоморфологических изменений иммунокомпетентных органов экспериментальных животных [3, 7, 8]. Между тем, изучение морфофункционального состояния иммунокомпетентных органов с применением морфометрического метода для изучения морфологических изменений, происходящих в иммунной системе организма, позволяет количественно характеризовать состояние клеточных популяций и взаимоотношения отдельных органных структур и может служить прогностическим критерием исхода инфекционного процесса [1, 6].
Целью данного исследования явилось изучение влияния туляремийного микроба разных подвидов на морфологические изменения в иммунокомпетентных органах экспериментальных животных.
методика
Экспериментальной моделью в опытах служили 95 беспородных, но стандартных по условиям содержания и массе (250 — 300 г) морских свинок обоих полов.
В качестве объектов исследования использовали 6 штаммов возбудителя туляремии — вакцинный Francisella tularensis 15 НИИЭГ (F. tularensis subsp. holarctica); F. tularensissubsp. tularensis И-163 (Schu 11), F. tularensis subsp. holarctica И-94 (401), И-250 (306); F. tularensis subsp. mediaasiatica И-357 (А-120); F. tularensis subsp. novicida-like И-383 (F 6168). Инфекционный процесс вызывали введением морским свинкам подкожно туляремийного микроба всех выбранных для исследования штаммов в дозе 100 м.к./мл.
Забор материала для исследования (регионарный лимфатический узел и селезенка) проводили на 3-и, 6-е, 10-е сутки с момента заражения. В экспериментах морских свинок умерщвляли гуманным способом в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (2003). Животных усыпляли хлороформом и немедленно проводили вскрытие, что обеспечивало близкое к прижизненному состоянию, забираемых на гистологическое исследование, органов. Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине, заливали в парафин. В работе использовали методы обзорной микроскопии с применением окрасок гематоксилином-эозином, метиловым зеленым-пиронином [4]. Количественную оценку пиронино-фильных клеток (плазматических) лимфатического узла и селезенки проводили с использованием морфометрии [1], измерение площади лимфатического фолликула и его реактивного центра, — с помощью компьютерной программы «Motic Images Plus» (версия 2). Автоматический анализ изображения производили с помощью светового микро-
скопа «Zeiss» (Германия) с видеокамерой «Moticam 2000», разрешение 1392 х 1040 пикселей, об. 100. Статистическую обработку проводили с помощью программы Microsoft Excel (2003) корпорации Microsoft. Достоверными считали различия при уровне значимости p < 0,05, p < 0,01.
результаты
Установлено, что на начальной стадии инфекционного процесса (3 сут.) у морских свинок, зараженных F. tularensis subsp. tularensis И-163, имеет место редукция фолликулов иммунокомпетентных органов (табл. 1, 2), которая проявляется уменьшением общей площади фолликула в 1,2-1,5 раза по сравнению с показателями у интактных животных.
К 6-м сут. происходит увеличение как площади самих фолликулов (в 1,6 раза при р < 0,05), так и реактивных центров, показатели которых снижаются к 10-м сут. К 3-м сут. в селезенке и лимфатических узлах отмечается увеличение количества плазматических клеток (табл. 3) по сравнению с интактными животными (в 1,6 6,2 раза), достигая пика к 6-м сут. (в 11,2 14,7 раза при р < 0,01), и резко снижается к 10-м сут. (в 3,5 4,0 раза при р < 0,01). Менее выраженные изменения отмечаются у животных, зараженных штаммами F. tularensis subsp. holarctica И-250 и И-94, которые проявляются отсутствием признаков разрушения структуры фолликулов им-мунокомпетентных органов, незначительного увеличения их общей площади и реактивных центров во все сроки наблюдения. Число плазматических клеток у животных, зараженных этими штаммами, начиная с 3-х сут. постепенно увеличивается (в 1,5 4,7 раза, по сравнению с интактными животными) , достигая максимальных значений к 10 сут. (в 3,8 9,0 раза при р < 0,01 по сравнению с контролем), однако у животных, зараженных штаммом И-94, непатогенным для морских свинок, эти показатели значительно выше (в 8,6 23,5 раза при р < 0,01).
У животных, зараженных штаммом F. tularensis subsp. mediaasiatica И-357 изменения в регионарном лимфатическом узле отмечается уже на 3 сут., выражающиеся в увеличении как площади самого фолликула (в 3,6 раза), так и реактивного центра (в 14,0 раз), а к 6-м сут. эти показатели снижаются, но тем не менее, превышают значения у интактных
животных в 1,6 и 3,0 раза соответственно. Площадь лимфатических фолликулов к 10-м сут. наблюдения соответствует контрольным значениям, а реактивного центра - в 2,0 раза выше. В селезенке подобные изменения отмечались на 6-10-е сут. Увеличение количества плазмоцитов в иммуно-компетентных органах происходит в эти же сроки, превышая в 6,2-9,7 раза показатели в контроле.
В селезенке и регионарном лимфатическом узле животных, зараженных штаммами F. ШШ-rensis 15 НИИЭГ и F. tularensis subsp. novicida И-383 отмечается увеличение в 2,2-7,8 раза числа плазматических клеток на 3-и сут., достигая максимальных значений к 10-м сут. (в 14,8-25,0 раз выше, чем у интактных). Площадь фолликулов селезенки и регионарного лимфатического узла (табл. 2, 3) значительно увеличиваются к 3-м сут., достигая максимальных значений к 6-10-м сут. (в 2,8-3,1 и 3,0-3,5 раза больше, чем у интактных). Также отмечено значительное увеличение и реактивного центра в селезенке - в 13,0-19,0 раз, в лимфоузле - в 8,0-17,0 раз.
заключение
Таким образом, изменения микроанатомической организации (увеличение площади фолликула и реактивного центра) и повышение числа плазматических клеток в селезенке и лимфатических узлах свидетельствует об активизации В-зависимых зон иммунокомпетентных органов и, следовательно, о развитии иммунологических реакций гуморального типа [2, 5]. Этот процесс наиболее выражен у животных, инфицированных F. tulaтensis subsp. novicida И-383, F. tulaтensis subsp. holarctica И-94 и F. tulaтensis 15 НИИЭГ в отличие от морских свинок, зараженных штаммом F. tulaтensis subsp. mediaasiatica И-357, у которых данные показатели были значительно ниже. Выявленное в ходе исследования отсутствие реакции со стороны иммунокомпетентных органов животных, зараженных штаммом F. tulaтensis subsp. tula-rensis И-163 и слабовыраженная у морских свинок, инфицированных F. tulaтensis subsp. holarctica И-250, указывает на слабую сопротивляемость организма на внедрение патогена, вследствие чего, инфекционный процесс в этих случаях приводит к гибели животных в ранние сроки наблюдения (6-10-е сут.).
Таблица 1
Площадь фолликула и реактивного центра в селезенке морских свинок, зараженных Р. Tulаrensis
Штамм Сроки наблюдения (сут.)
3 6 10
S фол. S р.ц. S фол. S р.ц. S фол. S р.ц.
15-В 4,9 ± 0,3** 1,1 ± 0,1** 5,6 ± 0,3** 1,6 ± 0,1** 5,2 ± 0,5** 1,3 ± 0,2**
И-383 4,5 ± 0,3** 0,9 ± 0,1** 5,8 ± 0,3** 1,9 ± 0,2** 5,6 ± 0,8** 1,5 ± 0,2**
И-357 1,9 ± 0,2 0,3 ± 0,1** 4,7 ± 0,5** 0,9 ± 0,0** 4,1 ± 0,5** 0,8 ± 0,1**
И-94 2,5 ± 0,6 0,4 ± 0,4** 4,9 ± 0,4** 1,0 ± 0,1** 2,0 ± 0,8 0,3 ± 0,1**
И-250 1,5 ± 0,5 0,2 ± 0,2* 3,8 ± 0,4* 0,6 ± 0,2** 2,8 ± 0,9 0,3 ± 0,3**
И-163 1,2 ± 0,1 0,17 ± 0,04 2,9 ± 0,4* 0,3 ± 0,0** 2,3 ± 0,3 0,24 ± 0,02
Контроль 1,8 ± 0,2 0,1 ± 0,0 -
примечание: * - р < 0,05; ** - р < 0,01 статистическая значимость различий по отношению к контролю; S фол. - общая площадь фолликула в мкм; S р.ц. - площадь реактивного центра в мкм.
Таблица 2
Площадь фолликула и реактивного центра в регионарном лимфатическом узле морских свинок,
зараженных Р. Tularensis
Штамм Сроки наблюдения (сут.)
3 6 10
S фол. S р.ц. S фол. S р.ц. S фол. S р.ц.
15-В 4,9 ± 0,3** 1,1 ± 0,0** 5,1 ± 0,3** 1,3 ± 0,2** 4,4 ± 0,7** 0,8 ± 0,0**
И-383 3,2 ± 0,4* 0,7 ± 0,2** 5,3 ± 0,6** 1,7 ± 0,3** 4,6 ± 0,4** 1,1 ± 0,2**
И-357 5,5 ± 0,5** 1,4 ± 0,2** 2,4 ± 0,1* 0,3 ± 0,0** 1,6 ± 0,1 0,2 ± 0,0*
И-94 1,6 ± 0,3 0,2 ± 0,0* 1,1 ± 0,3 0,3 ± 0,1** 1,4 ± 0,4 0,2 ± 0,0*
И-250 3,1 ± 0,3* 0,2 ± 0,1* 1,8 ± 0,5 0,4 ± 0,1** 1,7 ± 0,2 0,2 ± 0,0*
И-163 1,2 ± 0,2 0,1 ± 0,0 2,4 ± 0,1* 0,1 ± 0,0 2,2 ± 0,2 0,1 ± 0,0
Контроль 1,5 ± 0,1 0,1 ± 0,0
примечание: * - р < 0,05; ** - р < 0,01 статистическая значимость различий по отношению к контролю; S фол. - общая площадь фолликула в мкм; S р.ц. - площадь реактивного центра в мкм.
Таблица 3
Количество плазматических клеток в иммунокомпетентных органах морских свинок, зараженных F. tularensis
Штамм Селезенка Регионарный л/уз
Сроки наблюдения (сут.)
3 6 10 3 6 10
15-В 3,9 ± 0,2** 6,9 ± 0,2** 11,0 ± 0,3** 2,4 ± 0,3** 6,9 ± 0,2** 10,0 ± 0,1**
И-94 2,2 ± 0,5** 3,2 ± 0,3** 9,2 ± 0,3** 1,6 ± 0,3** 2,9 ± 0,3** 9,4 ± 0,3**
И-250 1,0 ± 0,2** 3,2 ± 0,2** 1,9 ± 0,2** 1,9 ± 0,2** 1,1 ± 0,2** 3,6 ± 0,2**
И-163 0,8 ± 0,1* 5,6 ± 0,2** 2,0 ± 0,5** 2,5 ± 0,5** 5,9 ± 0,1** 1,4 ± 0,5**
И-357 0,9 ± 0,2* 3,5 ± 0,2** 4,3 ± 0,2** 0,6 ± 0,2* 2,5 ± 0,2** 3,9 ± 0,2**
И-383 2,5 ± 0,3** 6,7 ± 0,1** 7,4 ± 0,2** 0,9 ± 0,2* 5,7 ± 0,1** 8,0 ± 0,2**
Контроль 0,5 ± 0,2 0,4 ± 0,2
примечание: * - р < 0,05; ** - р < 0,01 статистическая значимость различий по отношению к контролю.
Полученные результаты способствуют более глубокому пониманию патологического процесса, вызванного F. tularensis разных подвидов и потенциальной идентификации иммунных маркеров, связанных с выздоровлением, что может иметь прогностическое значение для характеристики течения инфекционного процесса.
литература
1. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия I Г.Г. Автандилов. — М.: Медицина, 1990. — З84 с.
2. Галактионов В.Г. Иммунология: Учебник. — М.: «РИЦ МДК», 2000. - 487 с.
3. Исупов И.В. Морфологическая характеристика чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии и бруцеллеза у животных I И.В. Исупов. — Саратов. — 1998. — 9З с.
4. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники / Г.А. Меркулов. — Л.: Медицина, 1969. — 423 с.
5. Сапин М.Р. Иммунная система, стресс и иммунодефицит / М.Р. Сапин, Д.Б. Никитюк. — М.: АПП «Джангар», 2000. — 184 с.
6. Селятицкая В.Г. Эндокринно-лимфоидные отношения в динамике адаптивных процессов / В.Г. Селятицкая, Л.А. Обухова. — Новосибирск: Со РАМН. - 2001. - 168 с.
7. Histologic and molecular diagnosis of tularemia: a potential bioterrorism agent endemic to North America / L.W. Lamps [et al.] // Modern Pathology. — 2004. — Vol. 17. — P. 489 — 495.
8. Identification of Immunologic and Pathologic Parameters of Death versus Survival in Respiratory Tularemia / D. Chiavolini [et al.] // Infect. Immun. — 2008. — Vol. 76, N. 2. — P. 486 — 496.
сведения об авторах
Витязева Светлана Александровна, к.м.н., младший научный сотрудник лаборатории патофи-зиологии Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока; 664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35, факс: 8 (3952) 22-01-40, e-mail: [email protected]
Старовойтова Татьяна Пантелеевна, научный сотрудник Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока, тел. 8 (3952) 22-01-35, факс: 8 (3952) 22-01-40
Дубровина Валентина Ивановна, д.б.н., старший научный сотрудник, зав. лабораторией патофизиологии Иркутского научноисследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока; тел.: 8 (3952) 22-01-35, факс: 8 (3952) 22-01-40 Татарников Станислав Александрович, научный сотрудник Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока; тел.: 8 (3952) 22-01-35, факс: 8 (3952) 22-01-40
Шкаруба Татьяна Тимофеевна, научный сотрудник Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока; тел. 8 (3952) 22-01-35, факс: 8 (3952) 22-01-40
