CC BY
96
3. Лашин А.П., Симонова Н.В., Симонова Н.П. Адаптогены в профилактике диспепсии у новорожденных телят // Вестн. КрасГАУ. - 2013. - № 8. - С. 28-32.
4. Лашин А.П., Симонова Н.В., Симонова Н.П. Настои лекарственных растений в профилактике диспепсии у новорожденных телят // Вестн. КрасГАУ. - 2013. - № 9. - С. 177-181.
5. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К. Окислительный стресс (диагностика, терапия, профилактика): монография. - Новосибирск: Наука, 1993. - 181 с.
6. Симонова Н.В. Фитопрепараты в коррекции процессов перекисного окисления липидов биомембран, индуцированных ультрафиолетовым облучением: автореф. дис. ... д-ра биол. наук. - Благовещенск, 2012. - 46 с.
7. Симонова Н.В., Доровских В.А., Симонова Н.П. Ультрафиолетовое облучение и окислительный стресс. Возможности фитокоррекции: монография. - Благовещенск, 2014. - 140 с.
8. Симонова Н.В., Доровских В.А., Штарберг М.А. Адаптогены в коррекции процессов перекисного окисления липидов биомембран, индуцированных воздействием холода и ультрафиолетовых лучей // Бюл. физиологии и патологии дыхания. - 2011. - Вып. 40. - С. 66-70.
УДК 619:612.112.9:636 Е.Г. Турицына, Е.А. Климова
МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ И ЦИТОМЕТРИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ ПЕРЕПЕЛОВ
В ВОЗРАСТНОМ АСПЕКТЕ
В статье представлены результаты исследований, связанные с изучением морфологической и цито-метрической характеристикой лейкоцитов крови перепелов от суточного до 120-дневного возраста. Ключевые слова: перепел, морфология, цитометрия, лейкоциты, кровь.
E.G. Turitsyna, E.A. Klimova
THE MORPHOLOGICAL AND CYTOMETRIC CHARACTERISTIC OF THE QUAIL BLOOD LEUKOCYTES
IN THE AGE ASPECT
The researchresults connected with the studying of the morphological and cytometric characteristic of the blood leukocytes of quailsfrom theone-day age to 120-day age are presented in the article. Key words: quail, morphology, cytometry, leukocytes, blood.
Введение. Перепеловодство - сравнительно молодая, но перспективная и интенсивно развивающаяся отрасль птицеводства. Перепела имеют ряд существенных продуктивно-хозяйственных преимуществ перед другими видами птицы. Так, у перепелов в пять раз выше скорость роста, чем у кур, у них более ранняя яйценоскость (5-6-недельный возраст) [1]. Состояние птицы в разные периоды функционального напряжения можно контролировать по крови, которая способна быстро реагировать на экстремальные внутренние и внешние воздействия изменением своего морфологического и биохимического состава. Клетки крови, особенно лейкоциты, играют центральную роль в неспецифической защите и в иммунологических реакциях. Выздоровление сопровождается восстановлением морфофункциональной характеристики крови [4]. В доступной литературе встречаются сведения о морфологическом составе и биохимических показателях крови японского перепела при использовании различных кормовых добавок [3, 5]. Однако достоверные данные о морфологических и цитометрических параметрах клеток крови японского перепела в постнатальном онтогенезе отсутствуют, что делает актуальным представленные научные исследования.
Цель исследований. Изучение морфологической и цитометрической характеристики лейкоцитов крови перепелов в возрастном аспекте.
Задачи исследований. Провести морфологические и цитометрические исследования лейкоцитов крови японского перепела с суточного до 120-суточного возраста.
Материалы и методы исследований. Исследования были проведены в 2013-2014 гг. на кафедре анатомии, патологической анатомии и хирургии Института прикладной биотехнологии и ветеринарной медицины Красноярского государственного аграрного университета. Объектом исследований являлся японский перепел (Coturnix japónica), поступивший из вивария парка флоры и фауны «Роев ручей» (г. Красноярск). Материалом для исследований служила цельная кровь, полученная из наружной яремной вены птиц. Отбор
материала осуществляли с суточного до 35-дневного возраста с интервалом в 7 сут, а затем у 60-, 90- и 120-суточных перепелов. Всего исследован материал от 45 гол.
При морфологическом исследовании лейкоцитов для дифференцировки ядер и выявления зернистости клеток мазки крови окрашивали комбинированным методом по Паппенгейму, сочетающим обработку мазков фиксатором Май-Грюнвальда с последующим докрашиванием краской Романовского-Гимза [2]. Окрашенные мазки исследованы на микроскопе «МикМед-6» (Россия) с помощью иммерсионного объектива. Микрофотографирование произведено цифровой камерой CAM V200 (Vision, Австрия). Подсчет лейкоцитарной формулы произведен с использованием одиннадцатиклавишного счетчика.
Цитометрические исследования лейкоцитов проведены при помощи компьютерной системы анализа изображений «ЦитоБиоГрафика» версия 2.1. Определены линейные размеры лейкоцитов и ядер моно-нуклеаров, ядерно-клеточное отношение лимфоцитов (ЯКО).
Статистическую обработку полученных данных проводили на ПК с помощью прикладных программ Microsoft Office Excel 2007. Достоверность возрастных различий цитометрических показателей лейкоцитов определяли с помощью t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при P<0,05.
Результаты исследований и их обсуждение. Известно, что кровь состоит из жидкой фазы - плазмы и взвешенных в ней форменных элементов - эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов [2]. В зависимости от зернистости цитоплазмы лейкоциты птиц делятся на зернистые (гранулоциты) и незернистые (агрануло-циты). К зернистым лейкоцитам относятся базофильные, эозинофильные и псевдоэозинофильные грануло-циты. Незернистыми клетками являются лимфоциты и моноциты.
Исследование морфологического состава лейкоцитов показали, что лимфоциты - это округлые клетки с крупным округлым или слегка бобовидным ядром красно-фиолетового цвета, с грубыми глыбками хроматина, расположены эксцентрично (рис. 1). Цитоплазма голубого или синего цвета в виде узкого ободка вокруг ядра может иметь просветленную перинуклеарную зону. Изредка встречаются лимфоциты с многочисленными цитоплазматическими выпячиваниями, что является морфологическим признаком активного состояния клеток (рис. 1).
Минимальные диаметры лимфоцитов в разные периоды жизни колебались от 5,7 до 6,4 мкм, что характерно для малых лимфоцитов, максимальные - от 11,1 до 12,3 мкм, что присуще средним лимфоцитам. Незначительное содержание в мазках крови больших лимфоцитов свидетельствовало, на наш взгляд, об интактном состоянии опытной птицы.
Рис. 1. Морфологическая характеристика лейкоцитов крови перепелов: 1 - малый лимфоцит; 2 - средний лимфоцит; 3 - моноцит; 4 - базофил; 5 - эритроцит; 6 - псевдоэозинофил (окраска по Паппенгейму; ув. * 1000)
Популяция лимфоцитов представлена преимущественно малыми и средними лимфоцитами, о чем свидетельствовали результаты цитометрических исследований. У суточных перепелов преобладали малые лимфоциты с ядерно-клеточным отношением (ЯКО) от 0,70 до 0,98 ед. (53 %), около 40 % составляли средние лимфоциты с показателями ЯКО от 0,50 до 0,69 ед. Уровень больших лимфоцитов с ЯКО 0,36-0,46 ед. не превышал 7 %. В течение первой недели жизни уровень малых лимфоцитов сократился до 32,5 %, а средних и больших вырос до 55,8 и 12,5 % соответственно. Это соотношение в популяции лимфоцитов сохранилось до 14-суточного возраста. Третья-пятая недели жизни характеризовались ростом относительного содержания больших лимфоцитов, что косвенно указывает на воздействие какого-либо раздражителя на иммунную систему перепелов. На наш взгляд, это могло быть вызвано сменой рациона кормления, колебанием температурного режима, транспортным стрессом и т.д. Дальнейшие исследования показали преобладание в крови перепелов средних лимфоцитов (рис. 2).
Рис. 2. Распределение популяции лимфоцитов периферической крови японского перепела в постнатальном онтогенезе
Второй группой мононуклеаров крови являются моноциты. Это крупные клетки неправильной округлой формы. Ядро слабосегментированное или бобовидное розовато-фиолетового цвета, с грубыми глыбками хроматина. Цитоплазма серовато-голубая, часто вакуолизированная. Исследования показали колебания размеров моноцитов от 9,6 до 14,5 мкм в разные возрастные периоды.
Исследованием гранулоцитарных лейкоцитов установлена следующая морфологическая характеристика псевдоэозинофилов, эозинофилов и базофилов перепелов. Псевдоэозинофильные гранулоциты -округлые клетки с палочковидным или сегментированным, реже округло-овальным ядром. Считается, что форма ядра отражает степень дифференциации клетки. Наиболее зрелыми являются гранулоциты с сег-ментоядерным ядром [2]. Именно эти клетки преобладали у перепелов в течение всех периодов исследований. Цитоплазма клеток почти бесцветна, заполнена веретеновидными гранулами с заостренными концами красновато-коричневого цвета. Менее заметны среди них мелкие округлые гранулы. Размеры псевдоэози-нофильных гранулоцитов колебались от 7 до 13 мкм, чаще встречались клетки размером 8-11 мкм.
Эозинофилы - крупные округлые клетки с ядром, состоящим из двух крупных сегментов и узкой перемычки между ними. Цитоплазма бледно-голубого цвета, равномерно заполненная округлыми, обособленно расположенными гранулами красного цвета. Размеры клеток в среднем составляли 9-12 мкм.
Базофилы - крупные, округлые клетки с ядрами палочковидной или сегментарной формы, их контуры плохо заметны из-за обилия крупных вишнево-фиолетовых округлых гранул. Размеры базофилов не зависели от возраста птицы и колебались от 8 до 11,5 мкм.
В результате проведенных исследований установлены возрастные особенности соотношения разных видов лейкоцитов. У суточных перепелов кровь характеризовалась преобладанием псевдоэозинофильных гранулоцитов, содержание которых в среднем составило 55,59±1,23 % (табл.). При этом относительное содержание базофильных гранулоцитов зарегистрировано на минимальном уровне - 1,75±0,28 %. За первую неделю жизни количество лимфоцитов увеличилось почти на 19 %, а содержание псевдоэозинофилов сократилось более чем на 14 % (Р<0,05). В тот же возрастной период отмечался рост числа базофилов на 60 %, содержание моноцитов и эозинофилов практически сохранялось на исходном уровне.
На третьей неделе жизни кровь перепелов приобрела лимфоцитарный профиль, который сохранялся до конца наблюдений. Максимальное содержание лимфоцитов зафиксировано у птицы двухмесячного возраста -69,42±1,41 %. В этот же период уровень псевдоэозинофильных гранулоцитов упал до минимальных показателей и в среднем составил 20,84±1,01 %, что в 2,6 раза меньше, чем у суточной птицы (Р<0,01).
Относительное содержание эозинофильных гранулоцитов достоверно отличалось от исходных показателей у птицы 35-суточного возраста (Р<0,05) и составило 1,71 ±0,32 %, что представляло собой минимальные значения за весь период исследований. Максимальное содержание эозинофилов отмечено у перепелов 120-суточного возраста (табл.). Количество моноцитов во все периоды исследований характеризовалось относительной стабильностью, их уровень колебался в диапазоне от 4 до 6 %.
Возрастные изменения лейкоцитарной формулы крови перепелов, %
Возраст, сут Базофилы Эозинофилы Псевдоэозинофилы Лимфоциты Моноциты
1 1,75±0,28 3,25±0,34 55,59±1,23 34,06±1,32 5,34±0,44
7 2,80±0,31* 3,20±0,37 48,15±0,77* 40,40±0,75* 5,45±0,62
14 1,00±0,27 2,90±0,32 42,40±2,22** 48,80±2,18** 4,20±0,39
21 3,05±0,79 3,25±0,59 28,90±1,96** 59,30±2,16** 5,50±0,59
28 0,75±0,22* 2,45±0,35 29,00±2,09** 62,60±1,86** 5,50±0,60
35 0,61 ±0,15 1,71 ±0,32* 35,77±1,98** 56,09±1,74** 5,77±0,63
60 0,21 ±0,10 3,37±0,56 20,84±1,01 ** 69,42±1,41** 6,21 ±0,54
90 0,19±0,09 3,48±0,40 27,78±1,14** 64,78±1,16** 4,07±0,50
120 0,15±0,09 3,54±0,30 26,54±2,12** 64,96±1,99** 4,85±0,55
* P<0,05; ** Р<0,01 относительно суточного возраста.
У перепелов трех- и четырехмесячного возраста содержание всех видов лейкоцитов крови стабилизировалось, о чем свидетельствует незначительная вариабельность полученных показателей.
Выводы
1. В крови перепелов присутствуют все виды гранулоцитарных и агранулоцитарных лейкоцитов, морфологическая характеристика которых не меняется в течение жизни птицы.
2. Возрастные изменения соотношения лейкоцитов крови перепелов характеризуются сменой грану-лоцитарного профиля на лимфоцитарный в течение первых трёх недель жизни. Окончательная стабилизация клеточного состава крови происходит у двухмесячной птицы.
3. В популяции лимфоцитов суточных перепелов преобладают малые лимфоциты с высокими ядерно-клеточными показателями. С возрастом повышается содержание средних лимфоцитов, которые становятся преобладающими клетками в течение остального периода постнатального развития.
Литература
1. Гущин В.В., КроикЛ.В. Перепеловодство должно развиваться // Птицеводство. - 2003. - № 6. - С. 22-23.
2. Карпуть ИМ. Гематологический атлас сельскохозяйственных животных. - Минск: Ураджай, 1986. - 183 с.
3. Сухорукова О.А., Костеша Н.Я. Механизм повышения продуктивности перепелов путем применения экстракта пихты сибирской // Вестн. Том. гос. пед. ун-та. - 2010. - № 3. - С. 36-39.
4. Турицына Е.Г. Оценка морфофункционального состояния крови птиц при вирусных антигенных стимуляциях: науч.-практ. рекомендации. - Красноярск, 2010. - 50 с.
5. Шваб А.А. Показатели естественной резистентности перепелов в постнатальном онтогенезе и при введении в рацион концентрата молочной сыворотки: автореф. дис. ... канд. биол. наук. -Новосибирск, 2010. - 24 с.
